微管不穩(wěn)定蛋白-1在肛門鱗狀上皮內(nèi)瘤變分級(jí)診斷中的應(yīng)用價(jià)值

楊春, 石娜, 王康, 王春

1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇南京 211102;2.南京市中醫(yī)院病理科,江蘇南京 210006;3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院普外科,江蘇南京 211102

肛門鱗狀上皮內(nèi)瘤變(anal intraepithelial neoplasia,AIN)是肛門鱗狀細(xì)胞癌的癌前病變。根據(jù)疾病的分級(jí),AIN 1級(jí)為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變,AIN 2級(jí)和AIN 3級(jí)為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變,因?yàn)楦呒?jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變存在進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的較大風(fēng)險(xiǎn),所以早期篩查AIN并判斷分級(jí)對(duì)指導(dǎo)AIN治療具有重要意義[1-2]。與宮頸上皮內(nèi)瘤變具有成熟的篩查系統(tǒng)不同,目前AIN尚缺乏統(tǒng)一的篩查和分級(jí)診斷體系,因此,發(fā)現(xiàn)AIN相關(guān)的分子標(biāo)志物有助于AIN的診斷和分級(jí)。微管不穩(wěn)定蛋白-1(stathmin-1,STMN1)在有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用,通過(guò)阻止微管的組裝和促進(jìn)微管的拆卸來(lái)促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移[3]。有研究顯示,STMN1高表達(dá)與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),也參與宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生發(fā)展[4-5],但STMN1在AIN中的表達(dá)變化及意義尚不清楚。因此,本研究對(duì)STMN1在不同級(jí)別AIN中的表達(dá)變化及其對(duì)分級(jí)診斷的應(yīng)用價(jià)值展開(kāi)探索?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月1日—2021年10月1日南京市中醫(yī)院經(jīng)病理確診的AIN標(biāo)本33例為AIN組,病理科保存的肛門移行區(qū)正常黏膜標(biāo)本10例為對(duì)照組。兩組一般資料比較差異無(wú)顯著性(P>0.05;表1)。納入標(biāo)準(zhǔn):①參照《肛門上皮內(nèi)瘤變?cè)\治中國(guó)專家共識(shí)》[6],經(jīng)病理診斷為AIN;②未接受過(guò)腫瘤相關(guān)治療;③患者或家屬知情同意,簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心肝腎等重要臟器功能不全;②合并代謝性疾病、惡性腫瘤;③臨床資料不全。

表1 不同p16、Ki-67表達(dá)AIN組織STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率的比較

1.2 AIN分級(jí)評(píng)估[6]

AIN鏡下病理表現(xiàn)為細(xì)胞核異型性,包括核增大、染色質(zhì)增粗、核膜不規(guī)則,以及基底層以上核分裂像的出現(xiàn)。AIN 1級(jí):未成熟細(xì)胞數(shù)量局限在上皮層厚度下1/3;AIN2級(jí):未成熟細(xì)胞增殖累及上皮層厚度1/3～2/3;AIN3級(jí):未成熟細(xì)胞累及上皮層厚度上1/3。AIN 1級(jí)為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變,AIN 2級(jí)和3級(jí)為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變。

1.3 免疫組化檢測(cè)STMN1、p16、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)

各組組織經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后4 μm切片,采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組化染色。所用一抗Stathmin-1、p16、Ki67及二抗均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。Stathmin-1著色于細(xì)胞質(zhì),僅在上皮基底層染色時(shí)為陰性,在上皮基底和中間細(xì)胞層呈現(xiàn)彌漫染色時(shí)為陽(yáng)性。p16著色于核及胞質(zhì),當(dāng)組織呈空白或斑片狀染色時(shí)為陰性,當(dāng)鱗狀上皮基底和中間細(xì)胞層呈現(xiàn)彌漫染色,伴或不伴淺表細(xì)胞層染色時(shí)為陽(yáng)性。Ki-67著色于細(xì)胞核,基底層散在染色為陰性;上皮下1/3、下2/3或超過(guò)2/3染色為陽(yáng)性。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)STMN1 mRNA表達(dá)

采用RNA提取試劑盒提取組織樣本RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,而后配置熒光定量PCR檢測(cè)體系如下:cDNA 1 μL、反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物溶液各0.6 μL,去離子水補(bǔ)足至20 μL。STMN1上游引物5′-AGCGACGTTGATGACGAT-3′,下游引物5′-ATGCTAGCTAGCTAGCTG-3′。β-actin上游引物5′-GCTAGCTGAAGCTAGCGA-3′,下游引物5′-GCTAGGCTAGTTCGATGCA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct),以β-actin為內(nèi)參,測(cè)定STMN1 mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AIN組和對(duì)照組STMN1表達(dá)的比較

對(duì)照組STMN1在上皮基底層陽(yáng)性表達(dá),AIN組STMN1在上皮基底和中間細(xì)胞層呈現(xiàn)彌漫染色(圖1A和B)。AIN組的STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組(P<0.05;圖1C和D)。

圖1 AIN組和對(duì)照組STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率的比較A和B為STMN1免疫組化染色(200×);C為STMN1 mRNA表達(dá)水平;D為STMN1陽(yáng)性表達(dá)率。a為P<0.05,與對(duì)照組比較。

2.2 不同p16、Ki-67表達(dá)AIN組織STMN1的比較

AIN組p16和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)AIN組織中STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率均高于陰性表達(dá)組織(P<0.05;表1)。

2.3 不同級(jí)別AIN組織STMN1的比較

高級(jí)別AIN組織STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率高于低級(jí)別AIN組織(P<0.05;表2)。

表2 不同級(jí)別AIN組織STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率的比較

2.4 STMN1表達(dá)水平對(duì)AIN及分級(jí)的ROC曲線分析

STMN1 mRNA表達(dá)水平對(duì)AIN及高級(jí)別AIN均具有診斷價(jià)值(P<0.05;圖2和表3)。

表3 STMN1 mRNA表達(dá)水平診斷AIN及分級(jí)的效能分析

圖2 STMN1 mRNA表達(dá)水平診斷AIN及分級(jí)的ROC曲線

3 討 論

近些年,肛門癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈增加趨勢(shì),但該疾病的早期癥狀不典型,確診時(shí)多已為晚期,生存率低、預(yù)后差[7-8]。AIN是肛門癌的癌前病變,高級(jí)別AIN具有進(jìn)展為肛門癌的較高風(fēng)險(xiǎn),篩查AIN特別是高級(jí)別AIN對(duì)肛門癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。

本研究以STMN1作為分子標(biāo)志物用于AIN診斷及分級(jí),旨在發(fā)現(xiàn)AIN的篩查手段和標(biāo)志物。微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的成分之一,在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)、分裂等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的作用。STMN1通過(guò)調(diào)節(jié)微管系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)平衡而發(fā)揮作用,研究資料顯示,多種癌組織中STMN1表達(dá)增加[3-5],STMN1對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲均具有促進(jìn)作用[9-10]。以上結(jié)果提示STMN1具有促癌生物學(xué)活性。本研究中,肛門移行區(qū)正常黏膜組織的STMN1局限于上皮基底層,AIN的STMN1突破基底層并出現(xiàn)在中間細(xì)胞層,提示AIN中存在STMN1的異常表達(dá)。

目前關(guān)于STMN1陽(yáng)性表達(dá)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一,有研究將染色超過(guò)上皮厚度1/3評(píng)定為陽(yáng)性,也有研究將染色超出基底層評(píng)定為陽(yáng)性,不同的定性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)直接影響評(píng)價(jià)結(jié)果的靈敏度和特異度[11-12]。本研究以染色超出基底層為評(píng)定STMN1陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn),AIN組織中STMN1的陽(yáng)性表達(dá)率均高于肛門移行區(qū)正常黏膜組織,提示STMN1高表達(dá)參與AIN的發(fā)生。為克服免疫組化染色不同陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果的影響,本研究通過(guò)熒光定量PCR對(duì)組織中STMN1的表達(dá)進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示:AIN組織中STMN1 mRNA表達(dá)水平高于肛門移行區(qū)正常黏膜組織,STMN1 mRNA表達(dá)水平對(duì)AIN具有診斷價(jià)值。以上研究結(jié)果不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了STMN1高表達(dá)參與AIN的發(fā)生,還提示局部病灶中STMN1 mRNA表達(dá)可作為診斷AIN的分子標(biāo)志物。

AIN分為1～3級(jí),其中AIN 2級(jí)和3級(jí)為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變,進(jìn)展為肛門癌的風(fēng)險(xiǎn)高,因此準(zhǔn)確診斷高級(jí)別AIN具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn),高級(jí)別AIN組織中STMN1 mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性表達(dá)率均高于低級(jí)別AIN,提示STMN1高表達(dá)可能與AIN由低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變向高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展相關(guān)。研究資料顯示,p16和Ki-67是反映上皮內(nèi)瘤變的免疫組化標(biāo)志物,AIN組織及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中,p16和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)與病變進(jìn)展、癌變風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān),其機(jī)制可能是高表達(dá)的p16和Ki-67加速細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲[13-15]。本研究分析AIN中STMN1與p16、Ki-67的關(guān)系發(fā)現(xiàn),p16和Ki-67陽(yáng)性的AIN組織中STMN1 mRNA表達(dá)高于p16和Ki-67陰性的AIN組織,表明AIN中STMN1 mRNA表達(dá)增加與標(biāo)志物p16、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)相關(guān),進(jìn)而從分子層面揭示STMN1高表達(dá)可能促進(jìn)AIN的進(jìn)展。最后通過(guò)ROC曲線分析證實(shí),STMN1 mRNA表達(dá)水平對(duì)AIN和高級(jí)別AIN具有診斷價(jià)值。

綜上所述,STNM1高表達(dá)參與AIN的發(fā)生發(fā)展,對(duì)AIN發(fā)病及分級(jí)具有診斷價(jià)值。