hsa_circ_100395對胃癌細(xì)胞HGC-27、MGC-803增殖、侵襲和遷移的影響

毛星薦, 高其亮, 夏冬靜, 師權(quán)

都江堰市人民醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)檢驗科,2.消化內(nèi)科,四川成都 611830

胃癌(gastric cancer,GC)是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。近年來,隨著GC診斷和治療策略的發(fā)展,其發(fā)病率和病死率逐步下降[2]。由于腫瘤的侵襲性和復(fù)發(fā)性,GC患者5年總生存率仍低于29%[3]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)參與癌癥發(fā)展,在胃癌、肺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等多種癌癥中異常表達(dá)[4]。circRNA通過充當(dāng)編碼肽、蛋白質(zhì)誘餌或微小RNA(microRNA,miRNA)來調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞過程[5]。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn),hsa_circ_100395對肺癌的發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用,而hsa_circ_100395對胃癌的影響尚未見報道。因此,本研究探究hsa_circ_100395在胃癌組織中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,旨在為胃癌的分子靶向治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

胃癌細(xì)胞系HGC-27和MGC-803購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。54只雄性昆明裸鼠(4周齡,體質(zhì)量16～19 g)購自中國醫(yī)科大學(xué),許可證號:SYXK(遼)2018-0008。LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Technology公司;CCK-8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑、TB Green熒光試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;hsa_circ_100395過表達(dá)或沉默質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。酶標(biāo)儀購自美國BioRad公司。

1.2 樣本來源

收集2017年10月—2019年10月本院72例GC患者的胃癌組織及癌旁正常組織,其中男41例,女31例,年齡28～75歲,平均(50.63±11.34)歲。根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行TNM分期。所有患者術(shù)前未接受任何放、化療,且術(shù)前無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;手術(shù)后立即將組織冷凍并保存在-80 ℃冰箱。所有患者均簽署書面知情同意書,本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 胃癌組織RNA分離和定量分析

提取胃癌及癌旁組織中總RNA,使用Nanodrop檢測RNA濃度及純度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR檢測。使用primer premier 6.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循環(huán)40次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,以GAPDH為內(nèi)參基因。hsa_circ_100395引物序列F為5′-ATCACGCCGTAGTGGATTGGT-3′,R為5′-GTGCTCTCTGTCTCTGCTT-3′;GAPDH引物序列F為5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,R為5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

胃癌細(xì)胞系HGC-27和MGC-803使用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清FBS和100 μg/mL青霉素和鏈霉素),在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HGC-27和MGC-803細(xì)胞分別分成過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染hsa_circ_100395過表達(dá)質(zhì)粒)、沉默組(轉(zhuǎn)染hsa_circ_100395沉默質(zhì)粒)和對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)。根據(jù)LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將約2 000個轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到96孔板孔中,在37 ℃和5%CO2條件下孵育。每孔添加10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育24 h后,使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度值(optical density,OD)。

1.6 劃痕愈合實驗

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,在6孔板中培養(yǎng)至5×105個/孔。隨后,用無菌微量移液器從孔中心刮擦細(xì)胞,劃痕后0、24 h拍攝代表性圖像。使用Image-Pro Plus分析軟件對遷移距離進(jìn)行定量分析。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell小室實驗

將約5×104個轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸浮在200 μL無血清培養(yǎng)基中,并在沒有Matrigel的情況下接種到上腔室中進(jìn)行遷移測定。將含有200 μL無血清培養(yǎng)基8×104個轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到含有Matrigel涂層的Transwell上腔室中進(jìn)行侵襲測定。10%FBS培養(yǎng)基作為化學(xué)吸引劑添加到下腔室中。細(xì)胞孵育24 h以進(jìn)行遷移測定,孵育48 h以進(jìn)行侵襲測定。除去小室頂部的細(xì)胞,然后將小室底部用4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,計數(shù)遷移和侵襲細(xì)胞,并在顯微鏡下拍片。

1.8 裸鼠成瘤實驗

隨機(jī)選取27只裸鼠注射HGC-27細(xì)胞,27只注射MGC-803細(xì)胞,然后分別將其均分為對照組、沉默組和過表達(dá)組,每組9只。根據(jù)GenBank報道的hsa_circ_100395序列,使用cDNA模板通過PCR擴(kuò)增獲得雙鏈DNA片段。構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a。將陰性對照質(zhì)粒和重組質(zhì)?？寺?得到重組慢病毒載體。通過大量的陽性克隆擴(kuò)增感受態(tài)細(xì)胞。將含有重組載體的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中,將其制備成穩(wěn)定的單細(xì)胞懸浮液。

以PBS∶Matrigel為1∶1比例制備單細(xì)胞懸液(1×106個細(xì)胞/200 μL)。戊巴比妥鈉麻醉裸鼠后,在裸鼠右后側(cè)皮下注射細(xì)胞懸液。對照組注射轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的細(xì)胞懸液,沉默組注射轉(zhuǎn)染hsa_circ_100395沉默質(zhì)粒的細(xì)胞懸液,過表達(dá)組注射轉(zhuǎn)染hsa_circ_100395過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞懸液。將裸鼠飼養(yǎng)在相同的環(huán)境中,每3天觀察1次。接種28天后對裸鼠實施安樂死,計算腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_100395在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

與癌旁正常組織(1.00±0.06)比較,胃癌組織hsa_circ_100395表達(dá)水平(0.35±0.03)明顯下調(diào)(P<0.05)。根據(jù)hsa_circ_100395在胃癌組織中的表達(dá)水平分為高表達(dá)(≥0.35)27例和低表達(dá)(<0.35)45例。hsa_circ_100395高表達(dá)與低表達(dá)在組織分化程度、浸潤深度及TNM分期上差異有顯著性(P<0.05;表1)。

表1 hsa_circ_100395表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系 例(%)

2.2 hsa_circ_100395抑制胃癌細(xì)胞增殖

與對照組比較,過表達(dá)組HGC-27和MGC-803細(xì)胞增殖降低(P<0.05),沉默組HGC-27和MGC-803細(xì)胞增殖升高(P<0.05;圖1)。

圖1 hsa_circ_100395對胃癌細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05,與對照組比較。

2.3 hsa_circ_100395抑制胃癌細(xì)胞遷移

與對照組比較,過表達(dá)組HGC-27和MGC-803細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),沉默組HGC-27和MGC-803細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高(P<0.05;圖2)。

圖2 hsa_circ_100395對胃癌細(xì)胞遷移的影響A為劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移(200×);B為劃痕愈合率柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較。

2.4 hsa_circ_100395抑制胃癌細(xì)胞侵襲

與對照組比較,過表達(dá)組HGC-27和MGC-803細(xì)胞相對遷移細(xì)胞數(shù)和相對侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),沉默組HGC-27和MGC-803細(xì)胞相對遷移細(xì)胞數(shù)和相對侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05;圖3)。

圖3 hsa_circ_100395對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響A、B分別為HGC、MGC803細(xì)胞遷移和侵襲的Transwell小室實驗(200×);C為遷移侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較。

2.5 hsa_circ_100395抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)生長

與對照組比較,過表達(dá)組HGC-27和MGC-803細(xì)胞的裸鼠移植瘤體積和腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05),沉默組HGC-27和MGC-803細(xì)胞的裸鼠移植瘤體積和腫瘤質(zhì)量顯著升高(P<0.05;圖4)。

圖4 hsa_circ_100395對裸鼠移植瘤生長的影響(n=9)A為各組裸鼠移植瘤瘤體圖;B為腫瘤體積比較;C為腫瘤質(zhì)量比較。a為P<0.05,與對照組比較。

3 討 論

GC是胃腸道惡性腫瘤中最常見的癌癥之一,在全球范圍內(nèi)具有很高的病死率[8]。手術(shù)是GC早期治療的主要方法。由于GC的癥狀不明顯且不具有特異性,發(fā)現(xiàn)時已到中晚期[9]。手術(shù)對于晚期GC患者來說風(fēng)險較大,故一般使用化學(xué)療法和放射療法等,但晚期患者的治愈率較低。同時,胃癌的高復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性使其治療難度加大,患者總生存期很低[10-11]。因此,深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制具有臨床意義。

高通量測序分析和生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了更多功能circRNA[12]。circRNA作為人細(xì)胞中穩(wěn)定且普遍存在的非編碼RNA,可通過結(jié)合特定的miRNA競爭性地抑制靶基因,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,分化和凋亡,并參與腫瘤發(fā)生[13-14]。Shao等[15]報道,有308個circRNA在胃癌中差異表達(dá),其中34.74%表達(dá)上調(diào)和65.26%表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示,hsa_circ_100395在胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),且與胃癌組織的分化程度、浸潤深度及TNM分期呈正相關(guān)。環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(http://www.circbase.org)查詢結(jié)果顯示,hsa_circ_100395位于1q25.1染色體上,長度約為671個核苷酸,由KLHL20 mRNA的4個外顯子組成。此外,hsa_circ_100395在人胃癌細(xì)胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27和AGS)中的表達(dá)水平顯著低于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1,其中HGC-27和MGC-803細(xì)胞中hsa_circ_100395的表達(dá)水平分別為最低和最高,因此,本研究選擇HGC-27和MGC-803細(xì)胞進(jìn)行研究。

與其他非編碼RNA相比,circRNA具有高度的保守性和穩(wěn)定性。其重要特性可能是其作為癌癥診斷和治療中理想生物標(biāo)志物的潛力[16]。研究表明,circRNA與抑癌作用或致癌作用有關(guān)[17]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn),circRNA circ_NRIP1促進(jìn)了胃癌的發(fā)展。Liu等[18]研究表明,circRNA circ_YAP1可通過競爭性結(jié)合胃癌細(xì)胞中miR-367-5p促進(jìn)p27表達(dá),從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和增殖。另外,circRNA circ_DLST和circRNA circ_CACTIN均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性行為[19-20]。本研究結(jié)果表明,hsa_circ_100395的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。hsa_circ_100395過表達(dá)顯著抑制了胃癌細(xì)胞HGC-27和MGC-803的增殖,并減少了體外細(xì)胞的遷移和侵襲。異種移植實驗表明,hsa_circ_100395過表達(dá)延遲了體內(nèi)腫瘤的生長。而hsa_circ_100395水平的降低則導(dǎo)致相反的作用。以上結(jié)果證明,hsa_circ_100395在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述,hsa_circ_100395在胃癌組織中顯著低表達(dá),且上調(diào)hsa_circ_100395可明顯抑制體外胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。