花姜酮通過抑制NLRP3炎癥小體改善SAP大鼠腸道黏膜屏障功能

莊亞萍, 林志星, 鐘昌會, 鄧小彥

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,海南?？?571101

急性胰腺炎(acute pancreastitis,AP)是胰腺及其周圍組織引起的突發(fā)炎癥,是腹部外科常見的急腹癥之一[1]。臨床上,大多數(shù)AP患者的病程呈自限性,但20%～30%患者發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),死亡率高達(dá)20%[2]。研究表明,在SAP早期階段,腸道屏障功能障礙和炎癥免疫功能紊亂是誘發(fā)和加重全身并發(fā)癥的主要原因[3]。因此,維持免疫平衡,保護(hù)腸道黏膜屏障功能是阻止SAP病程加重的關(guān)鍵。

花姜酮是天然植物提取物,抗炎作用顯著,可用于治療動物潰瘍性結(jié)腸炎以及炎癥性腸病[4-5]。研究報道,花姜酮對急性胰腺炎患者原位損傷有保護(hù)作用[6],但目前尚未有涉及腸道組織的報道。本研究旨在探討花姜酮對SAP大鼠腸道黏膜屏障功能的影響,為花姜酮應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

花姜酮(純度96%)購自海南鑫禾生物工程有限公司;牛膽酸鈉購自美國Sigma公司;白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒、流式細(xì)胞儀購自美國RD公司;一氧化氮(NO)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)購自南京建城生物工程研究所;分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、Caspase-1購自美國CA公司;熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。6周齡SPF級雄性SD大鼠42只,體質(zhì)量(200±20)g,由海南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗中心提供,動物實(shí)驗符合海南醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會3R標(biāo)準(zhǔn),動物合格證號為SCXK(瓊)2018-0007。

1.2 動物分組及模型建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周[(22±1)℃,12 h晝夜循環(huán),自由飲水和進(jìn)食],然后將其隨機(jī)分為對照組、模型組、花姜酮組,每組14只。模型組和花姜酮組大鼠經(jīng)胰膽管逆行注射350 mg/kg?；悄懰徕c建立SAP模型[6],對照組大鼠經(jīng)胰膽管逆行注射等量生理鹽水。建模6、12 h后,花姜酮組經(jīng)股靜脈穿刺給與花姜酮溶液(10 mg/kg)[7],對照組和模型組給與等量蒸餾水。

1.3 HE染色檢測小腸組織病理學(xué)變化

取大鼠回腸組織于10%甲醛溶液固定4 h,石蠟包埋。常規(guī)制備4 μm石蠟切片,脫蠟、脫水,采用HE染色試劑盒對切片進(jìn)行染色,于顯微鏡下觀察。

1.4 內(nèi)毒素、IL-1β、TNF-α、NO及MPO含量檢測

建模24 h后,取各組8只大鼠腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,于腹主動脈取血,同時快速摘取小腸和腸系膜淋巴結(jié)組織。采用ELISA測定血清和小腸組織中TNF-α和IL-1β含量。采用Griess法測定血清NO水平。采用偶氮基質(zhì)顯色法測定血清內(nèi)毒素(endotoxin,ET)含量。采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測定小腸組織MPO含量。

1.5 EB染色檢測腸道血管通透性

取各組6只大鼠于處死前30 min,經(jīng)尾靜脈注入30 mg/kg EB溶液。處死后,取回腸組織200 mg放入試管中,加3 mL甲酰胺反應(yīng)24 h后,過濾。采用分光光度計測定濾液620 nm處光密度值,并根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線計算EB含量。

1.6 免疫熒光法檢測NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)

處死大鼠,快速摘取小腸和腸系膜淋巴結(jié)組織,置于10%甲醛溶液中進(jìn)行石蠟包埋。取小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)組織的石蠟切片,置于65 ℃烘箱中烤片2 h,二甲苯浸泡脫蠟,乙醇梯度水化。PBS洗滌,加0.2 mL 3%H2O2去掉內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌,加pH 6檸檬酸溶液,95 ℃煮沸20 min,冷卻至室溫。PBS洗滌,加3%TritonX-100,5%BSA封閉30 min。加NLRP3、ASC一抗(1∶50)4 ℃過夜。次日將切片加熱1 h,滴加熒光二抗(1∶100),37 ℃避光孵育30 min,PBS洗滌,甘油封片。每張切片于光鏡下選取8個視野,統(tǒng)計NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法測定sIgA、Casepase-1蛋白表達(dá)水平

取小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)組織的石蠟切片,脫蠟、水化及去掉內(nèi)源性酶后,加sIgA、Casepase-1一抗(1∶50)4 ℃過夜。次日將切片加熱1 h,滴加二抗(1∶500),37 ℃孵育20 min,PBS洗滌。DAB顯色,HE復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明10 min,中性樹膠封片,光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕紅色者為陽性細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間兩兩比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 花姜酮對大鼠小腸組織病理學(xué)影響

對照組大鼠腸壁細(xì)胞排列整齊,形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整,組織間隙無明顯滲出;模型組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)紊亂,腸壁充血、水腫,有大量炎癥細(xì)胞浸潤,黏膜上皮細(xì)胞壞死;花姜酮組大鼠腸組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤,但組織充血、水腫程度較模型組減輕(圖1)。

圖1 花姜酮對大鼠小腸組織病理學(xué)影響(HE染色,200×)

2.2 花姜酮對血清ET、IL-1β、TNF-α、NO及小腸組織IL-1β、TNF-α、MPO的影響

模型組大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO水平及小腸組織IL-1β、TNF-α、MPO水平較對照組升高(P<0.05)。花姜酮組大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO水平及小腸組織IL-1β、TNF-α、MPO水平較模型組均降低(P<0.05;表1)。

表1 各組大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO及小腸組織IL-1β、TNF-α、MPO水平比較(n=8)

2.3 花姜酮對腸道血管通透性的影響

模型組大鼠小腸組織EB含量較對照組升高(P<0.05);花姜酮組大鼠小腸組織EB含量較模型組降低(P<0.05;圖2)。

圖2 花姜酮對腸道血管通透性的影響(n=6)a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.4 花姜酮對NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)量的影響

對照組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)組織中NLRP3、ASC幾乎無陽性細(xì)胞。與對照組比較,模型組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05);與模型組比較,花姜酮組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05;表2)。

表2 各組大鼠NLRP3、ASC陽性細(xì)胞數(shù)量的比較 個

2.5 花姜酮對Casepase-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較,模型組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中Casepase-1蛋白表達(dá)水平增加;與模型組比較,花姜酮組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中Casepase-1蛋白表達(dá)水平下降(圖3)。

圖3 花姜酮對大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中Casepase-1蛋白的影響(免疫組織化學(xué)染色法,200×)a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.6 花姜酮對大鼠小腸黏膜組織中sIgA蛋白的影響

與對照組比較,模型組大鼠小腸黏膜組織sIgA蛋白表達(dá)水平降低;花姜酮組大鼠小腸黏膜sIgA蛋白表達(dá)水平較模型組大鼠升高(圖4)。

圖4 花姜酮對大鼠小腸黏膜組織中sIgA蛋白的影響(免疫組織化學(xué)染色法,200×)a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

3 討 論

SAP可引發(fā)多器官功能衰竭,腸道屏障功能障礙是SAP發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵[8]。炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放是造成腸黏膜屏障損傷的主要原因。腸道免疫功能可以避免不當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng),讓抗炎和促炎處于平衡狀態(tài)[9]。因此,通過調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)防止腸道黏膜屏障損傷是改善SAP的重要措施。

HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠小腸腸壁充血、水腫,有大量炎癥細(xì)胞浸潤,黏膜上皮細(xì)胞壞死,腸道細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷。EB為一種常用的偶氮染料,可根據(jù)其是否穿過血管壁進(jìn)入組織來評價血管通透性。組織EB滲出量升高,血管通透性增強(qiáng),反之血管通透性降低。本研究EB染色結(jié)果顯示,模型組大鼠小腸組織EB滲出量升高,提示SAP大鼠小腸通透性增大;MPO是一種含血紅素輔基的蛋白酶,可通過調(diào)節(jié)NO對血管信號傳遞和舒張的作用,改變血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)性。因此MPO、NO是臨床上評估炎癥程度的重要指標(biāo)。本研究模型組大鼠血清和小腸組織中ET水平和炎癥因子IL-1β、TNF-α、NO及MPO水平較對照組升高,表明SAP大鼠建模成功,SAP大鼠腸黏膜屏障功能嚴(yán)重?fù)p壞或破壞,無法有效防止SAP大鼠中細(xì)菌和ET易位到血液中,這與相關(guān)研究結(jié)果相符[10-11];而花姜酮能有效改善SAP大鼠腸道損傷,降低腸道通透性,抑制血清和組織中ET、IL-1β、TNF-α、NO及MPO水平;提示花姜酮對SAP大鼠腸黏膜屏障功能具有保護(hù)作用。

NLRP3是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要成分,NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和Casepase-1及炎癥細(xì)胞因子組成,活化的Caspaes-1不僅可誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá),而且在炎癥反應(yīng)中反過來激活炎癥小體,引起瀑布樣炎性反應(yīng)[12]。Lu等[13]報道,NLRP3、ASC表達(dá)少的SAP大鼠,其胰腺炎癥反應(yīng)明顯減輕。免疫熒光法和免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示,模型組大鼠小腸組織和腸系膜淋巴結(jié)中NLRP3、ASC、Casepase-1表達(dá)均較對照組明顯升高;模型組大鼠血清和組織中IL-1β、TNF-α水平較對照組升高,提示SAP大鼠固有免疫細(xì)胞過度激活會破壞腸道免疫平衡,產(chǎn)生過度炎性反應(yīng);花姜酮能降低NLRP3、ASC、Casepase-1及IL-1β、TNF-α表達(dá);提示花姜酮可通過下調(diào)NLRP3蛋白、銜接蛋白ASC和Caspase-1前體蛋白表達(dá),從而抑制NLRP3炎癥小體的活化,避免固有免疫細(xì)胞過度激活引起的炎癥反應(yīng),改善SAP大鼠的腸損傷。

sIgA由小腸黏膜固有層中的漿細(xì)胞產(chǎn)生,是黏膜局部免疫反應(yīng)的主要抗體,其水平代表局部體液免疫功能[14]。在腸道內(nèi),sIgA能夠抵抗蛋白水解,抵御細(xì)菌和毒素入侵,抑制過度炎性反應(yīng),減少腸黏膜損害。Sun等[15]報道SAP患者血清中sIgA水平顯著降低。本文免疫組織化學(xué)染色法顯示,花姜酮組大鼠小腸黏膜sIgA較模型組升高,推測花姜酮可通過上調(diào)sIgA水平,調(diào)節(jié)局部體液免疫功能。

綜上所述,花姜酮對SAP大鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與上調(diào)sIgA水平,抑制NLRP3炎癥小體活化,調(diào)節(jié)腸道免疫功能有關(guān)。