TRPV4抑制劑HC067047對(duì)小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的影響

劉德龍, 楊瞻宇, 陳昕彤, 王奕威, 關(guān)蕊, 盛斌

湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,湖南長(zhǎng)沙 410000

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限,其主要病理性改變?yōu)檐浌羌?xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨的合成和降解偶聯(lián)失衡[1]。瞬時(shí)受體電位香草素受體4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)是一種多模式的鈣滲透性陽(yáng)離子通道,能被多種細(xì)胞外刺激所激活,進(jìn)而調(diào)控鈣離子內(nèi)流,從而引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn),TRPV4既可在軟骨細(xì)胞膜上參與低滲透壓引起的炎性反應(yīng),又可在軟骨細(xì)胞中引起鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致軟骨破壞[3]。因此,抑制TRPV4的表達(dá)可能對(duì)KOA的軟骨組織發(fā)揮保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡可能參與了KOA疾病的發(fā)生發(fā)展[4-5]。本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討TRPV4抑制劑HC067047對(duì)小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

10周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只,體質(zhì)量20～25 g,由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(湘)2019-0018。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒購(gòu)于武漢Elabscience生物技術(shù)有限公司;GSDMD抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)抗體、Caspase-1抗體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)抗體、IL-1β和IL-18抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;TRPV4抗體、HE染液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;生物素化兔抗羊抗體購(gòu)于北京康為試劑生物科技有限公司;HC067047購(gòu)于美國(guó)TargetMol公司;ABC試劑盒購(gòu)于北京Biolead生物科技有限公司;DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京Zsbio生物技術(shù)有限公司;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒、番紅固綠染色液購(gòu)于廣州勞斯生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立

將30只小鼠均分為假手術(shù)組、模型組、HC067047組。假手術(shù)組僅切開(kāi)右側(cè)膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)皮膚,不予處理膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)結(jié)構(gòu)。模型組、HC067047組手術(shù)切除小鼠板股韌帶及內(nèi)側(cè)半月板前角以構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎模型,HC067047組每天10 mg/kg HC067047灌胃6周[6],假手術(shù)組、模型組等量生理鹽水灌胃6周。所有小鼠在18～22 ℃、相對(duì)濕度50%～65%環(huán)境中飼養(yǎng),活動(dòng)、飲食、飲水自由。

1.3 番紅固綠染色及軟骨下骨骨量檢測(cè)

膝關(guān)節(jié)軟骨組織固定,切成石蠟切片,脫蠟,浸入番紅O染色液染色,然后酸性乙醇分化液分化15 s,用35%、50%、70%、80%乙醇脫色,隨后水洗1 min,再入固綠染色液內(nèi)浸染,然后蒸餾水下沖洗1 min,無(wú)水乙醇脫水3～5 min,50%二甲苯+50%乙醇透明5 min,二甲苯5 min,最后用樹(shù)脂封固,每張切片選取5個(gè)不同視野。采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(international association for the study of osteowrthritis,OARSI)評(píng)分[7]評(píng)定軟骨及軟骨下骨骨量,總分20分,評(píng)分越高表示病情越嚴(yán)重。

1.4 HE染色檢測(cè)

取膝關(guān)節(jié)軟骨組織的石蠟切片,二甲苯脫蠟,經(jīng)乙醇逐步脫水,二甲苯5 min×2,100%乙醇2 min,95%乙醇1 min,80%乙醇1 min,75%乙醇1 min,蒸餾水洗2 min,蘇木精染色5 min,自來(lái)水沖洗,鹽酸乙醇分化30 s,自來(lái)水浸泡15 min,置伊紅液2～3 min,常規(guī)脫水,透明,封片,95%乙醇30 s,100%乙醇30 s×2,100%乙醇1 min×2,二甲苯15 min,中性樹(shù)脂封片,顯微鏡下觀察軟骨下骨變化情況。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)TRPV4 mRNA表達(dá)水平

假手術(shù)組、模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織磨碎勻漿提取總RNA,然后加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:95 ℃變性15 min、94 ℃變性30 s、37 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,28～36個(gè)循環(huán),4 ℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。TRPV4引物序列:正向?yàn)?′-ACCTTCTGCACCAACCTCCT-3′,反向?yàn)?′-AGCCCGTAGAGCATGAATTG-3′;GAPDH引物序列:正向?yàn)?′-ACAGCTTFTGGGTGGGTCCACGAC-3′,反向?yàn)?′-TTTGAGGGACGTCCGAACTT-3′。采用2-ΔΔCt計(jì)算法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 免疫印跡檢測(cè)TRPV4和焦亡相關(guān)蛋白水平

取膝關(guān)節(jié)軟骨組織磨碎勻漿,加入裂解液充分振蕩搖勻并放置冰上充分裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取組織上清,參照BCA蛋白定量試劑盒要求測(cè)定其中總蛋白含量,90 V、90 min電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入TRPV4(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、GSDMD(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、IL-18(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、β-tubulin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST緩沖液洗滌3次,每次10 min,室溫下加二抗(1∶5 000)孵育2 h。采用凝膠成像儀顯影。

1.7 ELISA檢測(cè)

將100 μL各組血清加入標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔中,置于37 ℃溫育箱中90 min,甩干孔中液體后加入100 μL抗體工作液置于37 ℃溫育箱中1 h,甩干液體后加225 μL洗滌液,靜置1 min甩干板內(nèi)液體,加100 μL酶結(jié)合物,置于37 ℃溫育箱30 min;棄去孔內(nèi)液體洗板5次,在每孔中加90 μL底物溶液,置于37 ℃避光孵育15 min,加終止液50 μL,測(cè)量各孔在450 nm波長(zhǎng)的光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TRPV4對(duì)KOA小鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨骨量的影響

番紅固綠染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨界限清楚,潮線清晰,骨小梁排列正常,番紅染色范圍大、顏色深,軟骨表面光滑。模型組軟骨表面膜樣結(jié)構(gòu)破壞,軟骨層明顯變薄,潮線不完整,骨小梁排列紊亂,番紅染色范圍減小、顏色較淺,OARSI評(píng)分較假手術(shù)組升高(P<0.05)。與模型組比較,HC067047組減緩軟骨破壞進(jìn)程,軟骨層變薄改善,潮線完整,骨小梁排列輕微紊亂,番紅染色范圍增加、顏色較深,OARSI評(píng)分降低(P<0.05)。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨量顯著增高(P<0.001),給予HC067047干預(yù)后,膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨量顯著降低(P<0.05;圖1)。

圖1 TRPV4對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨骨量的影響A為番紅固綠染色(4×)和HE染色結(jié)果(20×);B為OARSI評(píng)分;C為軟骨下骨骨量。a為P<0.05,與假手術(shù)組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.2 KOA小鼠軟骨組織中TRPV4的表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較,模型組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TRPV4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05;圖2)。

圖2 膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨組織中TRPV4的表達(dá)水平A為RT-PCR檢測(cè)TRPV4 mRNA;B為Western blotting檢測(cè)TRPV4蛋白。a為P<0.05,與假手術(shù)組比較。

2.3 TRPV4對(duì)KOA小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,HC067047組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05;圖3)。

圖3 TRPV4對(duì)KOA小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響A為Western blotting;B為柱狀圖。a為P<0.05,與假手術(shù)組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.4 TRPV4對(duì)KOA小鼠血清和關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥因子表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組小鼠血清及關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-1β、IL-18水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,HC067047組小鼠血清及關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-1β、IL-18水平顯著降低(P<0.05;圖4)。

圖4 TRPV4對(duì)KOA小鼠血清和關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥因子表達(dá)水平的影響A為ELISA檢測(cè)小鼠血清炎癥因子的水平;B為軟骨組織炎癥因子蛋白相對(duì)表達(dá)水平;C為軟骨組織炎癥因子相對(duì)灰度值。a為P<0.05,與假手術(shù)組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)病以逐年年輕化且不可逆的慢性變性關(guān)節(jié)炎疾病,以軟骨、半月板、韌帶退化,滑膜炎癥,軟骨下骨改變?yōu)樘卣鱗8-9]。盡管多種因素如衰老、創(chuàng)傷、炎癥等一系列因素都能影響KOA的發(fā)生發(fā)展[10],但是,目前對(duì)KOA的病理機(jī)制仍知之甚少。研究表明,炎癥在促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色,因此抗炎治療可有效延緩KOA的發(fā)病[11],然而目前長(zhǎng)期服用非甾體類(lèi)抗炎藥會(huì)引起高血壓、充血性心力衰竭和腎毒性等不良反應(yīng)[12-13],因此尋找新的KOA抗炎靶點(diǎn)至關(guān)重要。

TRPV4在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá),可被多種內(nèi)源性物質(zhì)、炎癥等多種刺激激活。研究發(fā)現(xiàn),TRPV4受體在銀肩病關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中表達(dá)上調(diào)[14-15],而TRPV4的缺失可能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的惡化[16]。Walter等[17]發(fā)現(xiàn),在退變的椎間盤(pán)組織中TRPV4表達(dá)增多,參與椎間盤(pán)的退變過(guò)程。而姚旺祥等[18]研究證實(shí),關(guān)節(jié)軟骨組織中TRPV4的陽(yáng)性細(xì)胞率與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組小鼠比較,KOA小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TRPV4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著增加,表明抑制軟骨組織中TRPV4的表達(dá)可能延緩KOA的發(fā)展;與模型組比較,HC067047處理組小鼠膝關(guān)節(jié)中的軟骨層變厚,潮線完整,骨小梁排列紊亂減輕,OARSI評(píng)分降低,提示抑制TRPV4的表達(dá)水平能夠改善骨關(guān)節(jié)炎小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨退變,但TRPV4影響軟骨退變的機(jī)制目前尚不十分清楚。

細(xì)胞焦亡是一種伴有炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡,可由多種病理刺激引起,如氧化應(yīng)激、高血糖、炎癥等[19-21],主要包括由Caspase-1的介導(dǎo)經(jīng)典途徑和由Caspase-4、5、11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑[22]。細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體有NLRP3、AIM2和pyrin等[23],當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NLRP3被刺激因子激活,激活后NLRP通過(guò)ASC蛋白連接Caspase-1前體即pro-Caspase-1,pro-Caspase-1被活化后能夠發(fā)生自我剪切,形成Caspase-1[24]。研究發(fā)現(xiàn),Caspase-1的活化一方面能夠促進(jìn)促炎因子的成熟,另一方面也能切割GSDMD蛋白使其生成GSDMD-N片段,GSDMD-N片段能夠轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜,造成細(xì)胞膜穿孔,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)促炎因子如IL-1β、IL-18的大量釋放,進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生腫脹形成焦亡[25-26]。研究證實(shí),IL-1β是骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的重要誘導(dǎo)因子,能促進(jìn)軟骨破壞,而IL-18促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解方面發(fā)揮重要作用[27-28]。本研究結(jié)果顯示,HC067147能顯著抑制KOA小鼠軟骨組織中NLRP3、Caspase-1、AIM2和GSDMD-N的表達(dá),降低KOA小鼠血清和軟骨組織中IL-1β、IL-18的水平,提示TRPV4抑制劑HC067047在KOA小鼠的軟骨組織中能夠抑制細(xì)胞焦亡。TRPV4可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞焦亡影響小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化,但細(xì)胞焦亡的發(fā)生在此過(guò)程中也可能是伴隨發(fā)生的,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要通過(guò)特異性敲除TRPV4證實(shí)其與細(xì)胞焦亡在骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨組織中的直接關(guān)系。

綜上,TRPV4可能通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨退變,TRPV4抑制劑HC067047有望成為骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。