褪黑素抑制人血管平滑肌細(xì)胞的巨噬樣表型轉(zhuǎn)化

李雙, 譚翠鈺, 侯連杰, 趙國軍

1.大理大學(xué),云南大理 671003;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院,廣東清遠(yuǎn) 511518

心血管疾病的病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)[1],血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在As發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)和細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)VSMC至少包括6種不同亞型,除了所熟知的收縮表型外,還包括間充質(zhì)樣、巨噬細(xì)胞樣、成纖維細(xì)胞樣、成骨樣和脂肪細(xì)胞樣表型[3],提示VSMC表型轉(zhuǎn)化在As發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要且復(fù)雜的調(diào)控作用。

遺傳譜系追蹤研究表明,小鼠As斑塊中約30%的泡沫細(xì)胞來源于VSMC,該比例在人類斑塊中超過40%[4]。水溶性膽固醇負(fù)荷導(dǎo)致小鼠原代主動脈VSMC獲得巨噬樣細(xì)胞表型,其特征是VSMC標(biāo)志物表達(dá)降低、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)和脂質(zhì)吞噬能力增加,細(xì)胞發(fā)生泡沫化[5]。通過抑制小鼠VSMC的巨噬樣表型轉(zhuǎn)化,能顯著減少小鼠As斑塊泡沫細(xì)胞數(shù)量并增加纖維帽厚度,增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性[6]。褪黑素是由松果體分泌的一種激素,可從調(diào)控巨噬細(xì)胞極化[7]、降低內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[8]和抑制VSMC增殖和成骨分化[9]等多方面發(fā)揮抗As作用,但褪黑素在VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化過程中的作用未見報道。本研究檢測了褪黑素對VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)和細(xì)胞脂質(zhì)吞噬能力的影響,并觀察了褪黑素在VSMC表型轉(zhuǎn)化所涉及細(xì)胞增殖和遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國GIBCO公司,油紅O、水溶性膽固醇(膽固醇∶甲基-β-環(huán)糊精復(fù)合物)和褪黑素為美國Sigma公司產(chǎn)品,CCK-8試劑盒購于南京建成公司,RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR相關(guān)試劑均購于TAKARA公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人VSMC系(PCS-100-012)購自ATCC公司。VSMC分為對照組、膽固醇組(水溶性膽固醇)、褪黑素組(水溶性膽固醇+褪黑素)。細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2空氣中培養(yǎng)。將VSMC按4×105個/孔接種于6孔板,細(xì)胞達(dá)80%匯合后,膽固醇組使用終質(zhì)量濃度10 mg/L水溶性膽固醇處理細(xì)胞72 h,每24 h換1次培養(yǎng)基,保證水溶性膽固醇的終質(zhì)量濃度以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的巨噬樣表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞泡沫化。褪黑素組使用0.5 μmol/L褪黑素與10 mg/L水溶性膽固醇共同處理血管平滑肌72 h。

1.3 CCK-8測定細(xì)胞活力

將VSMC按1×105個/孔接種于96孔板中,貼壁生長12 h后,分別用5、10、50、100 mg/L水溶性膽固醇或0.5、5.0、50.0 μmol/L褪黑素分別處理VSMC 72 h,去除細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS清洗3次,每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基+10 μL CCK-8溶液孵育4 h,酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度值。

1.4 定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)

按照TAKARA公司RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明,提取VSMC總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于后續(xù)定量PCR實(shí)驗(yàn)。參考本團(tuán)隊(duì)前期文獻(xiàn)[10]實(shí)驗(yàn)操作,進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR,相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 油紅O染色

接種于6孔板的VSMC在不同因素處理后,PBS清洗2次,500 μL 4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次。然后每孔加入500 μL油紅O工作液,避光染色30 min。去除油紅O工作液,通過500 μL/孔60%異丙醇分化10 s,迅速加入1 mL PBS清洗3次。最后,每孔加入500 μL蘇木精染色液染色5 min,用1 mL PBS清洗3次,將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 Edu檢測細(xì)胞增殖

將VSMC以1×105個/孔接種于24孔板,VSMC在不同處理?xiàng)l件下達(dá)到70%匯合后,使用BeyoClick EdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照,隨機(jī)挑選若干視野拍照,統(tǒng)計(jì)視野中Edu陽性細(xì)胞率(%)=Edu陽性細(xì)胞數(shù)/全細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

接種于6孔板的VSMC在不同處理?xiàng)l件下達(dá)到90%匯合后,用10 μL移液器槍頭在孔內(nèi)豎直劃擦,DMEM高糖培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞,去除懸浮細(xì)胞后照相,用不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后第18 h與36 h分別在鏡下觀察劃痕處細(xì)胞遷移狀態(tài),并拍照。細(xì)胞遷移率通過Image J軟件測量計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素逆轉(zhuǎn)水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC的巨噬樣表型相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:≤50 mg/L水溶性膽固醇對VSMC活力無影響;≤5.0 μmol/L褪黑素對VSMC活力無明顯毒性(P>0.05;圖1A和B)。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 mg/L水溶性膽固醇和0.5 μmol/L褪黑素。

圖1 褪黑素和水溶性膽固醇對VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響A和B為CCK-8實(shí)驗(yàn);C為定量PCR實(shí)驗(yàn)(n=3)。

定量PCR檢測結(jié)果表明:10 mg/L水溶性膽固醇處理顯著降低平滑肌收縮表型相關(guān)標(biāo)志基因α-actin和α-tropomyosin的mRNA水平,并顯著升高巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因CD68和MAC2的mRNA水平;而0.5 μmol/L褪黑素可逆轉(zhuǎn)上述趨勢(P<0.05;圖1C),提示褪黑素可抑制血管平滑肌巨噬樣表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)。

2.2 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導(dǎo)VSMC脂質(zhì)蓄積

油紅O染色結(jié)果顯示:水溶性膽固醇顯著增加VSMC脂質(zhì)蓄積,但褪黑素處理后可逆轉(zhuǎn)水溶性膽固醇對VSMC脂質(zhì)蓄積的誘導(dǎo)作用(圖2)。

圖2 油紅O染色評估褪黑素和水溶性膽固醇對VSMC脂質(zhì)蓄積的影響(n=3,400×)

2.3 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC增殖

Edu染色結(jié)果顯示:水溶性膽固醇增加VSMC Edu陽性率(P<0.05),而褪黑素降低膽固醇引起的VSMC Edu陽性率增加(P<0.05;圖3),提示褪黑素顯著抑制水溶性膽固醇引起的VSMC增殖。

圖3 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC增殖(n=3,200×)

2.4 褪黑素對水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC遷移無影響

與對照組相比,膽固醇組18 h和36 h細(xì)胞遷移率顯著增加(P<0.05),而褪黑素不能減緩水溶性膽固醇共處理引起的細(xì)胞遷移率升高(P>0.05;圖4)。

圖4 褪黑素對水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC遷移無影響(n=3,40×)

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種由動脈血管內(nèi)脂質(zhì)聚積引起的慢性炎癥性疾病,膽固醇誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞巨噬樣表型轉(zhuǎn)化與動脈粥樣硬化易損斑塊形成密切相關(guān),但是目前其分子機(jī)制尚未完全闡明。因此,解析VSMC的巨噬樣表型轉(zhuǎn)化分子機(jī)制并探尋相關(guān)治療藥物,對于動脈粥樣硬化早期治療及預(yù)防不良心血管事件發(fā)生具有重要意義。

水溶性膽固醇也叫膽固醇∶甲基-β-環(huán)糊精復(fù)合物。Rong等[11]研究結(jié)果表明,10 mg/L水溶性膽固醇處理小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞72 h可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生巨噬樣表型轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為VSMC標(biāo)志基因α-actin和α-tropomyosin表達(dá)顯著降低,巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CD68和MAC2表達(dá)顯著增加,且油紅O染色結(jié)果顯示VSMC脂質(zhì)吞噬能力增強(qiáng)。之后,Shankman等[6]也使用水溶性膽固醇處理VSMC,誘導(dǎo)其發(fā)生巨噬樣表型轉(zhuǎn)化,生成泡沫細(xì)胞。然而,前期關(guān)于水溶性膽固醇誘導(dǎo)VSMC出現(xiàn)巨噬樣泡沫細(xì)胞表型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑樵∈笾鲃用}平滑肌細(xì)胞,目前尚無水溶性膽固醇處理人VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)報道。本研究先通過CCK-8細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn),評估水溶性膽固醇的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)≤50 mg/L水溶性膽固醇對VSMC活力無影響,且10 mg/L水溶性膽固醇處理即可降低平滑肌收縮表型相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá),并升高巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá),此外10 mg/L水溶性膽固醇處理增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,提示水溶性膽固醇可誘導(dǎo)人VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化。

VSMC轉(zhuǎn)分化為巨噬樣細(xì)胞過程與VSMC增殖和遷移過程密切相關(guān)。VSMC去分化生成間充質(zhì)樣細(xì)胞,隨后發(fā)生增殖和遷移。在受到不同刺激后,間充質(zhì)樣細(xì)胞可分別向巨噬細(xì)胞樣、成纖維細(xì)胞樣、成骨樣或脂肪細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化[3]。褪黑素是色氨酸代謝的產(chǎn)物,由松果腺按照晝夜節(jié)律分泌;近年來研究表明,褪黑素通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和降低內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[12];因此,本文也觀察了褪黑素對VSMC增殖和遷移的影響,以進(jìn)一步闡釋褪黑素調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制。有研究表明,在ApoE-/-小鼠中,褪黑素通過抑制VSMC炎癥反應(yīng)和增殖,減緩小鼠As進(jìn)展[13],這與本研究發(fā)現(xiàn)0.5 μmol/L褪黑素可逆轉(zhuǎn)水溶性膽固醇誘導(dǎo)的VSMC增殖的結(jié)果一致。另有研究表明,在膽囊癌中褪黑素通過抑制細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路,可抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[14],然而本研究中并未發(fā)現(xiàn)褪黑素有抑制VSMC遷移的作用,這種差異的具體原因還不清楚,可能是由于細(xì)胞系不同造成。

綜上所述,本研究結(jié)果表明褪黑素可抑制VSMC巨噬樣表型轉(zhuǎn)化。