米糠油不飽和脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

梁 盈 劉 穎 魯 倩 吳 偉 高 宇 田明慧 林親錄

(稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué)，長(zhǎng)沙 410004)

米糠油不飽和脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

梁 盈 劉 穎 魯 倩 吳 偉 高 宇 田明慧 林親錄

(稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué)，長(zhǎng)沙 410004)

采用MTT比色法研究米糠油不飽和脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明：米糠油不飽和脂肪酸在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯抑制作用，當(dāng)米糠油和亞麻酸濃度達(dá)到0.15 mmol/L、油酸 0.2 mmol/L、亞油酸0.08 mmol/L以上時(shí)，抑制作用明顯。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示米糠油不飽和脂肪酸處理肝癌細(xì)胞后G2期細(xì)胞含量下降，發(fā)生了明顯的S期阻滯。光鏡觀察結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞呈多邊形，輪廓清晰，核仁2～5個(gè)，細(xì)胞增殖旺盛，貼壁牢固，胞間連接緊密；而經(jīng)米糠油不飽和脂肪酸處理后的肝癌細(xì)胞明顯收縮變圓，胞體變小，細(xì)胞間隙增大，胞核模糊不清，部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落，核仁外溢，說明米糠油不飽和脂肪酸體外對(duì)HepG2有顯著的增殖抑制作用。

米糠油 不飽和脂肪酸 肝癌細(xì)胞 增殖抑制

米糠是大米加工過程中的重要副產(chǎn)物之一，是糙米在碾白時(shí)分離出的胚芽和糠層的混合物[1]。有數(shù)據(jù)表明，雖然米糠只占稻谷總量的6%～8%，但卻有著整個(gè)稻谷64%的重要營(yíng)養(yǎng)成分[2]。米糠也是一種很好的油料資源，米糠油的制取方法主要有壓榨法、浸出法、超臨界法等，我國(guó)主要應(yīng)用的是壓榨法和浸出法[3]。粗制米糠油中一般含有4%左右的不皂化物[4-5]，不皂化物中含量較多的活性物質(zhì)有植物固醇(1.5%～2%)，谷維素(1.2%～1.8%)，生育酚以及生育三烯酚(0.15%～0.2%)[6-8]。米糠油中的不飽和脂肪酸含量比飽和脂肪酸多，其中單不飽和脂肪酸的OA(Oleic acid,油酸)和多不飽和脂肪酸的LA(Linoleic acid,亞油酸)占70%左右，且OA與LA 比例約為1.1∶1，符合國(guó)際衛(wèi)生組織推薦的OA和LA比例為1∶1的最佳比例[9]。米糠油作為一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物油，其不飽和脂肪酸含量與組成也有其他植物油不可比擬的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)在對(duì)于從其他植物油中提取不飽和脂肪酸的研究報(bào)道較多，但對(duì)米糠油中的不飽和脂肪酸報(bào)道較少。且目前對(duì)米糠油的功能特性及生理活性的研究主要集中在谷維素、生育酚等活性成分上，缺乏對(duì)其中不飽和脂肪酸的關(guān)注，限制了其開發(fā)利用[10-11]。近年來的研究表明，某些不飽和脂肪酸對(duì)如乳腺癌[12]、結(jié)腸癌[13]、前列腺癌[14]等癌癥有較好的抑制作用，而米糠油蘊(yùn)含豐富的不飽和脂肪酸資源，主要研究了米糠油不飽和脂肪酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用米糠油提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

米糠：金健米業(yè)股份有限公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞凍存液：北京索萊寶科技有限公司；抗熒光淬滅封片液：碧云天生物技術(shù)研究所；人肝癌組織細(xì)胞(HepG2：Hepatocellular carcinoma cells)：長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。XDS-10型倒置顯微鏡：上海團(tuán)結(jié)儀器制造有限公司；OLYMPUS IX71熒光倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米糠油的制備

經(jīng)過課題組前期工作，已從米糠中提取出純度高的米糠油并對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行了測(cè)定，得到的結(jié)果如表1所示[15-16]。

表1 米糠自提米糠油的主要脂肪酸測(cè)定結(jié)果/%

表1(續(xù))

1.2.2 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)[17]

HepG2在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，隔天傳代1次。細(xì)胞生長(zhǎng)至3～5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成單層時(shí)進(jìn)行消化，開展試驗(yàn)。將儲(chǔ)藏于-20 ℃的米糠油、油酸、亞油酸及亞麻酸放置于室溫下使其成液體狀。用少量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇將米糠油、油酸、亞油酸及亞麻酸溶解后與10% FBS-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液混合，配制成0.5 mmol/L濃度的米糠油、油酸、亞油酸、亞麻酸母液。充分搖勻，4℃保存，臨用前再用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度的處理液。

1.2.3 米糠油不飽和脂肪酸處理HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[18]

取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)且生長(zhǎng)融合成單層的細(xì)胞，隨機(jī)分為5組(正常對(duì)照組、米糠油處理組、油酸處理組、亞油酸處理組、亞麻酸處理組)。用0.25%胰蛋白酶消化液消化后以104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后分別換用相應(yīng)培養(yǎng)液和處理液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；至相應(yīng)處理時(shí)間后，向各組細(xì)胞每孔加入20 μL MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光值(OD值)。分別測(cè)定0、24、48、72 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的OD值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4 米糠油不飽和脂肪酸處理HepG2細(xì)胞HE染色觀察檢測(cè)[19]

取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)且生長(zhǎng)融合成單層的細(xì)胞，隨機(jī)分為5組：1)正常對(duì)照組：加入普通DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；2)米糠油處理組：加入0.15 mmol/L 米糠油處理液培養(yǎng)48 h；3)油酸處理組：加入0.2 mmol/L油酸處理液培養(yǎng)48 h；4)亞油酸處理組：加入0.08 mmol/L 亞油酸處理液培養(yǎng)48 h；5)亞麻酸處理組：加入0.15 mmol/L 亞麻酸處理液培養(yǎng)48 h。

將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并融合成單層時(shí)按分組要求處理細(xì)胞。48 h后取出長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片，Bouin’s固定液固定1 h以上，70%乙醇脫色后，蒸餾水漂洗干凈。蘇木素液中染色5～15 min，流水洗去殘余的蘇木素液，分化液分色5～10 s后，1%氨水返藍(lán)3～5 min，流水沖洗，梯度乙醇溶液脫水。用伊紅染液染色1～5 min后，95%乙醇和100%乙醇中迅速通過以洗去玻片表面多余伊紅染液。乙醇與二甲苯1∶1混合溶液中浸泡，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，并進(jìn)行拍照。

1.2.5 米糠油不飽和脂肪酸處理HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期流式檢測(cè)[20]

試驗(yàn)分組同1.2.4，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成105個(gè)/mL的懸液接種于6孔板，每孔接種3 mL，貼壁培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，每孔加一定濃度不飽和脂肪酸溶液于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用冷的PBS洗2遍后再用1 mL PBS溶液重懸，1 500 g轉(zhuǎn)速下離心5 min，去上清液。加入2 mL預(yù)冷的70%酒精，-20 ℃固定過夜，然后用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)均重復(fù)操作3次。數(shù)據(jù)都使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件(17.0中文版)處理分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著性意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同處理組HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

有研究表明，不飽和脂肪酸對(duì)癌細(xì)胞最佳處理時(shí)間在48 h為宜，處理濃度在0.05～0.20 mmol/L時(shí)，就能較大程度誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[21]。而試驗(yàn)一般選擇IC50或者靠近IC50值的濃度作為處理濃度最佳[22]。

不同處理組的細(xì)胞增殖曲線(圖1)結(jié)果顯示，不同濃度的米糠油及不飽和脂肪酸處理組細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞生存活力(OD值)均有所降低，并隨著處理濃度的升高，OD值下降的趨勢(shì)增大。米糠油處理組(圖1a)在0.1 mmol/L時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響不大，當(dāng)濃度增加到0.15 mmol/L時(shí)OD值約為正常對(duì)照組的56%左右。處理組細(xì)胞經(jīng)處理后48 h內(nèi)接近對(duì)照組細(xì)胞增殖能力50%時(shí)視為造模成功，而在0.15 mmol/L處理濃度下細(xì)胞存活率接近50%，故選取0.15 mmol/L為米糠油最佳處理濃度。同理從結(jié)果可以看出，油酸處理組(圖1b)在濃度為0.2 mmol/L時(shí)，OD值約為正常對(duì)照組的57%左右，亞油酸處理組(圖1c)在濃度僅為0.08 mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率即降到50%以下，亞麻酸處理組(圖1d)在濃度為0.15 mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率下降至54%，因此油酸、亞油酸、亞麻酸的最佳處理濃度分別選定為0.2 mmol/L、0.08 mmol/L和0.15 mmol/L。

圖1 不同處理組HepG2細(xì)胞增殖曲線

2.2 處理前后 HepG2細(xì)胞光鏡下的形態(tài)變化

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示(如圖2)：正常對(duì)照組的細(xì)胞具有肝癌細(xì)胞典型的形態(tài)特征，呈多邊形、多角形等肝癌細(xì)胞的形態(tài)，大小均勻鋪展開來，表面光滑，較圓。邊緣清晰，呈單層均勻排列；細(xì)胞核呈藍(lán)色而細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅紫色，核質(zhì)區(qū)別分明。細(xì)胞核處于細(xì)胞的中央，核仁清晰可見，顏色深，一般呈不規(guī)則的橢圓形。幾乎每個(gè)細(xì)胞都能看到2～5個(gè)細(xì)胞核仁，說明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。而細(xì)胞質(zhì)鋪展，但看到紅紫色染色不均勻，顏色深淺有些區(qū)別。從圖片上還能明顯看到部分細(xì)胞處于細(xì)胞分裂的狀態(tài)(圖2a)。米糠油、油酸、亞油酸和亞麻酸處理組中的細(xì)胞數(shù)目明顯較少，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出損傷特征；細(xì)胞胞體大部分變小變圓，細(xì)胞團(tuán)縮，呈極性狀；核藍(lán)質(zhì)紅仍可觀察到，但核質(zhì)不分明，細(xì)胞核變小，核仁不清晰且數(shù)目明顯減少；細(xì)胞質(zhì)皺縮、拉長(zhǎng)，HE染色較深(圖2b、圖2c、圖2d、圖2e)。

圖2 48 h不同處理組對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(×400)

2.3 處理前后HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的變化

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HepG2生長(zhǎng)周期結(jié)果如圖3和圖4。在G1期正常對(duì)照組、米糠油處理組、油酸處理組、亞油酸處理組、亞麻酸處理組細(xì)胞百分比分別為65.514、45.456、59.351、51.769、57.357，S期細(xì)胞百分比分別為31.939、53.242、39.251、48.231、41.318，G2期細(xì)胞百分比分別為2.546、1.303、1.398、0、1.325。G1期米糠油、亞油酸處理組與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，S期與G2期各處理組與正常對(duì)照組比較，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各處理組G1、G2期細(xì)胞相比正常對(duì)照組減少，S期細(xì)胞明顯增加，說明經(jīng)過米糠油及不飽和脂肪酸處理后，細(xì)胞幾乎都在S期被阻滯，進(jìn)入G2期的細(xì)胞減少，細(xì)胞分裂的趨勢(shì)明顯降低。值得一提的是，亞油酸處理組無G2期細(xì)胞，細(xì)胞都被阻滯在S期，DNA二倍體變成四倍體的過程被停滯，對(duì)抑制HepG2細(xì)胞增殖效果相比于其他各組更好。

圖3 48 h不同處理組對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

注：*P<0.05 ,與正常組對(duì)照。

3 結(jié)論

結(jié)果表明：米糠油不飽和脂肪酸對(duì)HepG2有明顯的增殖抑制作用，當(dāng)米糠油和亞麻酸在0.15 mmol/L、油酸0.2 mmol/L、亞油酸0.08 mmol/L以上時(shí)，抑制作用明顯，其中，多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)比米糠油抑制效果好，而單不飽和脂肪酸(油酸)的抑制效果不明顯；經(jīng)米糠油不飽和脂肪酸處理后，肝癌細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞形態(tài)與正常肝癌細(xì)胞相比發(fā)生明顯變化，可以看到多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)凋亡或有凋亡的跡象；米糠油不飽和脂肪酸使HepG2細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，抑制其增殖。

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Effect of Unsaturated Fatty Acids from Rice Bran Oil on HepG2 Cell Proliferation

Liang Ying Liu Ying Lu Qian Wu Wei Gao Yu Tian Minghui Lin Qinlu

(National Engineering Laboratory for Rice and By-product Deep Processing,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004)

This paper mainly determines the inhibition of unsaturated fatty acids from rice bran oil on the growth of liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells. The results show that the inhibition ability of unsaturated fatty acids within a certain concentration scope from rice bran oil on HepG2 was obvious.When the concentration of RBO, linolenic acid, oleic acid and linoleic acid reached 0.15 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L and over 0.08 mmol/L, respectively ，the effect of inhibition was evident. Cell cycle detection showed that the percentage of G2 phase cells was decreased and block in S phase appeared after HepG2 cells were treated with unsaturated fatty acids from rice bran oil. Result of light microscopic observation showed that cells were polygon,had clear edge and 2～5 nuclears in each cell with vigorous cell proliferation，and cells were strongly adhered and intercellular connection is closed; and cells were significantly shrunk, cell body became smaller, and intercellular space was increased, andnucleus became blurred following treatment with unsaturated fatty acids from rice bran oil; Additionally, cell membrane cell fell off in part of cells, and nucleolus overflew. On this basis, t unsaturated fatty acids from rice bran oil may significantly inhibit proliferation capability HepG2 cells.

rice bran oil, unsaturated fatty acids, hepatocellular carcinoma cells, proliferation inhibition

TS213.3

A

1003-0174(2016)06-0098-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201348)，湖南省自然科學(xué)基金(13JJ4086)，湖南省農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化(2013NK 4002)，長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃(K1403039-21)

2014-10-13

梁盈，女，1981年出生，副教授，分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)

林親錄，男，1966年出生，教授，稻谷深加工