砂引草（紫草科）大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育及其分類學意義

孫豪愽 孔冬瑞 胡德昌

（魯東大學生命科學學院，煙臺 264025）

砂引草屬（MesserschmidiaL.）為紫草科（BoraginaceaeJuss.）的寡種屬（3 種），廣泛分布于亞洲溫帶及熱帶，美洲也有分布。我國有2 種1 變種，分布于北部及東南部［1］。歷史上，砂引草屬和紫丹屬（TournefortiaL.）及天芥菜屬（HeliotropiumL.）的關系一直有爭議。據Diane 等［2］，林奈最早根據生活習性和果實形狀描述了天芥菜亞科（Subfam.Heliotropioideae Gürke）的3 個屬，天芥菜屬、紫丹屬和砂引草屬（單型屬），Gürke 于1893 年把砂引草屬并入天芥菜屬，Johnston 于1935 年重新恢復了砂引草屬，并根據外果皮形態(tài)把紫丹屬的3個種移入砂引草屬。后來，Dandy［3］又逐漸把包括砂引草（M.sibiricaL.）在內的砂引草屬的各個種移入ArgusiaB?hm.。因此，砂引草屬就又消失了。根據ITS1 序列結合形態(tài)學資料的研究結果顯示紫丹屬網結在天芥菜屬［2］。根據trnL 和ITS1 分子序列對天芥菜亞科的系統(tǒng)分析支持砂引草屬位于天芥菜屬［4］。Craven［5］建議把整個紫丹屬并入天芥菜屬。由一些學者組成的紫草目工作組（Boraginales Working Group）建立的紫草目分類系統(tǒng)中，也將紫丹屬并入天芥菜屬［6］。

分子系統(tǒng)的研究結果需要形態(tài)學驗證。砂引草用于系統(tǒng)分類的形態(tài)學研究十分匱乏，僅劉家熙等［7］用電子顯微鏡觀察了包括砂引草在內的中國產天芥菜亞科的花粉形態(tài)，發(fā)現(xiàn)砂引草的花粉形態(tài)和多數天芥菜屬種類十分相似，花粉均為長球形，赤道面觀為橢圓形，赤道部位略膨大；極面觀為六裂圓形，均為三孔溝與三假溝交替排列。胚胎學特征在被子植物各個分類等級都能提供重要的信息［8］。李璐等［9］研究的藤山柳（Clematoclethra scandensMaxim.）的花藥和胚珠發(fā)育特征支持其和獼猴桃屬（ActinidiaLindl.）有較近的親緣關系。Li 等［10］研究的毒藥樹屬（SladeniaKurz）的胚胎學特征建議該屬獨立為科。張梓袁等［11］研究的十齒花屬（DipentodonDunn）的花藥和雄配子體發(fā)育特征支持將其獨立為科，放在十齒花目（Dipentodontales）。Kong 等［12］研究的假海桐屬（PittosporopsisCraib）的花藥和胚珠發(fā)育特征支持將其從菊支Ⅰ（Asterids Ⅰ）的茶茱萸科（Icacinaceae）移入菊支Ⅱ的水?；疲∕etteniusaceae）。鑒于胚胎學特征重要的分類學意義，以砂引草為代表，對砂引草屬進行胚胎學研究，并與相關類群進行比較分析，為更好地理解砂引草屬的分類學位置提供胚胎學資料。

砂引草（Messerschmidia sibirica）是砂引草屬多年生草本植物，廣泛分布于我國北方內陸沙地和海濱砂地和蒙古、朝鮮及日本[1,13]。砂引草耐貧瘠、干旱和鹽堿[14-16]，蛋白質含量高，具止血作用，是一種優(yōu)良的防風固沙,飼用藥用植物[17-18]。迄今為止，鮮見砂引草胚胎學方面的研究報道。本研究對砂引草大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程進行詳細觀察，以補充砂引草屬及天芥菜亞科的胚胎學資料，并基于現(xiàn)有資料，比較分析其分類學意義，旨在為砂引草屬的分類學位置確定提供新資料。

1 材料與方法

試驗材料采自山東省煙臺市芝罘區(qū)海邊沙灘（37°31′35.88″N，121°26′26.73″E；憑證標本號：KONG20210425，存放于魯東大學生命科學學院標本室）。摘取不同發(fā)育時期的花蕾和開放花朵迅速放入FAA固定液（V（50%乙醇）∶V（冰醋酸）∶V（福爾馬林）=90∶6∶4）固定并保存。愛氏蘇木精整體染色，常規(guī)石蠟制片技術制片，切片厚度7～9 μm。OLYMPUS 顯微鏡（BX-50，日本）觀察，OLYMPUS數碼相機（DP-72，日本）攝影。

2 結果與分析

2.1 砂引草的花藥壁與小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

砂引草每個花藥含有4 個花粉囊（圖版Ⅰ：A）?；ㄋ幈诎l(fā)育早期的橫切面上可觀察到由孢原細胞分裂而來的初生壁細胞和初生造孢細胞（圖版Ⅰ：B）。初生壁細胞平周分裂成外層和內層，外層繼續(xù)平周分裂形成藥室內壁和中層，而內層直接發(fā)育成絨氈層（圖版Ⅰ：C～D）。初步發(fā)育成熟的花藥壁由4 層細胞構成，從外向內分別是表皮、藥室內壁、中層和絨氈層（圖版Ⅰ：D）；根據Bhandari［19］，砂引草的花藥壁發(fā)育類型屬于雙子葉型。絨氈層細胞發(fā)育成熟時含二核（圖版Ⅰ：D）?；ㄋ幈诟鲗与S著小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的進行發(fā)生相應的變化：中層和分泌型絨氈層先后解體退化；表皮細胞拉伸成扁長形；藥室內壁細胞為不規(guī)則2 層，具纖維性加厚（圖版Ⅰ：E）。

來源于孢原細胞的初生造孢細胞經幾次有絲分裂后行使小孢子母細胞的功能（圖版Ⅰ：B～D）。小孢子母細胞減數分裂過程中，胞質分裂為同時型（圖版Ⅰ：F～G），形成四面體型排列的四分體（圖版Ⅰ：G）。成熟花粉為2-細胞型。（圖版Ⅰ：I）。

圖版Ⅰ 砂引草的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育A.花藥四孢囊；B.發(fā)育中的花藥壁，顯示初生周緣層和初生造孢細胞；C.發(fā)育中的花藥壁，箭頭所指為次生周緣層分裂為藥室內壁和中層；D.成熟花藥壁由4層細胞組成，腺質型絨氈層細胞具2核；E.散粉前的花藥壁，表皮細胞宿存，藥室內壁2層，發(fā)生明顯的纖維狀加厚；F.小孢子母細胞減Ⅱ中期；G.小孢子母細胞減Ⅱ末期；H.小孢子四分體呈正四面體型排列；I，成熟花粉粒2-細胞型；en.藥室內壁；ep.表皮；gn.生殖核；ip.次生周緣層內層；mc.小孢子造孢細胞；ml.中層；pp.初生周緣層；pm.初生造孢組織；ta.絨氈層；vn.營養(yǎng)核。Plate Ⅰ Microsporogenesis and male gametogenesis in M. sibirica A.Tetra-sporangial anther；B.Developing anther wall，showing the primary peripheral layer cells and the primary micro-sporogenous cells；C.Anther wall in development，indicating the endothecium and middle layer resulted from the division of the outer secondary peripheral layer（arrows indicated）；D.Developed anther wall comprised four layers，including an epidermis，one endothecium，a middle layer，and a 2-nucleated tapetum；E.Ripened anther wall including a collapsed epidermis，irregular 2-layered，fibrous thickened endothecium；F.Microspore mother cell at metaphaseⅡ；G.Microspore mother cell at telophase Ⅱ；H.Tetrahedral microspore tetrad；I.2-celled mature pollen grain；en.Endothecium；ep.Epidermis；gn.Generative nucleus；ip.Inner secondary peripheral layer；mc.Micro-sporogenous cell；ml.Middle layer；pp.Primary peripheral layer；pm.Primary micro-sporogenous tissue；ta.Tapetum；vn.Vegetative nucleus.

2.2 砂引草的胚珠解剖特征與大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

砂引草的雌蕊為兩心皮合生，中軸胎座。胚珠倒生，單珠被（圖版Ⅱ：A）。胚珠發(fā)育早期，表皮細胞下孢原細胞體積增大并伸長，直接發(fā)育為大孢子母細胞（圖版Ⅱ：B～E）；在大孢子母細胞形成時，珠心頂端表皮細胞進行2 次平周分裂，產生4 層珠心細胞（圖版Ⅱ：B～E），屬于假厚珠心［20］。珠被最內層在四核胚囊時期發(fā)育為珠被絨氈層（圖版Ⅱ：I～J）。到成熟胚囊時期，珠被絨氈層變得不明顯（圖版Ⅱ：K～L）。由于珠被頂端的延伸生長，珠孔狹長（圖版Ⅱ：L）。珠心細胞從單核胚囊時期開始退化，到成熟胚囊時期，僅合點端有部分殘留（圖版Ⅱ：G～L）。

大孢子母細胞減數分裂形成直線形排列的4個大孢子，其中珠孔端的3個退化，合點端的1個為功能大孢子，直接轉變?yōu)閱魏伺吣遥▓D版Ⅱ：F～G）。隨后，核進行1 次有絲分裂，形成2 個單倍體的子核；2 個核被中央液泡分開，核移向胚囊兩端（圖版Ⅱ：H）。2-核胚囊的2 個核再分別進行2 次有絲分裂，順序形成4-核胚囊（圖版Ⅱ：I～J）和8-核胚囊。8-核胚囊分化為成熟胚囊（圖版Ⅱ：K～L）。根據Willemse 等［21］，砂引草的胚囊發(fā)育類型為蓼型。成熟胚囊梭形。卵細胞近似洋梨形。助細胞具“鉤”和“喙”（圖版Ⅱ：K）。反足細胞退化早。極核在受精前融合為次生核（圖版Ⅱ：K～L）。

3 討論

本研究首次觀察了砂引草的大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程，結合Pal［22］和Khaleel［23］對天芥菜屬其他植物的研究結果，總結了21 個砂引草和天芥菜屬可比較的分類學特征（見表1），討論了幾個重要特征的分類學意義，為更好地理解砂引草屬的分類學位置及親緣關系提供了胚胎學證據。

表1 砂引草和天芥菜屬胚胎學特征比較Table 1 Comparison of embryological characters between Messerschmidia sibirica and Heliotropium

3.1 砂引草小孢子發(fā)生及雄配子發(fā)育特征的分類學意義

砂引草與天芥菜屬植物的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征基本一致，略有不同。在花藥壁發(fā)育方面，二者的相同特征包括雙子葉型的發(fā)育類型、表皮宿存、藥室內壁細胞具纖維性加厚、分泌型絨氈層細胞含2核，不同之處在于砂引草藥室內壁為不規(guī)則2層，而天芥菜屬的藥室內壁為1層。

在雄配子體發(fā)生和發(fā)育方面，砂引草和天芥菜屬的小孢子母細胞減數分裂過程中胞質分裂皆為同時型，成熟花粉粒皆為2-細胞型［22-23］。砂引草小孢子四分體為四面體形排列。天芥菜屬的H.curussavicum、H.indicum、H.ovalifolium和H.peruvianum小孢子四分體也都為四面體形排列，只有H.scabrum和H.strigosum的小孢子四分體除了四面體形，還偶有十字交叉形排列的［23］。

3.2 砂引草胚珠和胚囊發(fā)育特征的分類學意義

本研究觀察到的砂引草胚珠特征與天芥菜屬大部分物種十分相似，稍有不同［22-23］。砂引草胚珠為倒生，具單珠被及長珠孔，珠被絨氈層不發(fā)達，缺乏珠柄珠孔塞。天芥菜屬的H.curussavicum、H.peruvianum和H.scabrum的胚珠倒生，而H.indicum、H.ovalifolium和H.strigosum的胚珠橫生［22-23］。天芥菜屬的H.curussavicum、H.peruvianum具有微弱的珠柄珠孔塞，但珠孔塞不是本屬的典型特征，因為H.indicum、H.ovalifolium、H.scabrum和H.strigosum缺少珠柄珠孔塞［22-23］。和天芥菜屬多數種一樣，砂引草也沒有珠柄珠孔塞。

砂引草的珠心表皮細胞平周分裂形成周緣層。根據Endress［20］，砂引草的珠心為假厚珠心胚珠。天芥菜屬的H.curussavicum、H.indicum、H.ovalifolium和H.peruvianum的珠心表皮細胞和砂引草珠心表皮細胞一樣進行平周分裂形成周緣層，為假厚珠心［22］。H.scabrum和H.strigosum的珠心表皮細胞不分裂，初生周緣細胞來源于孢原細胞的平周分裂，為厚珠心［23］。成熟胚囊時期，砂引草珠心組織有部分殘留，這和天芥菜屬的珠心組織完全退化不同［22-23］。

在胚囊發(fā)育方面，砂引草和天芥菜屬植物也十分相似。相同的特征包括蓼型胚囊、成熟胚囊為梭形、助細胞具有鉤和喙、極核在受精前融合等［22-23］。天芥菜屬反足細胞變異較大。H.peruvianum的反足細胞在成熟胚囊時期已退化，H.strigosum的反足細胞在受精后退化，H.curussavicum、H.indicum和H.ovalifolium的反足細胞宿存最晚至8-細胞胚乳時期［22-23］。砂引草反足細胞和H.peruvianum的一樣，在成熟胚囊時期已退化，沒有超出天芥菜屬反足細胞的變異范圍。

根據現(xiàn)有資料比較分析，砂引草大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育的胚胎學特征和天芥菜屬的十分相似。鑒于胚胎學特征在屬內比較穩(wěn)定，胚胎學證據支持分子系統(tǒng)中將砂引草屬置于天芥菜屬的處理。

圖版Ⅱ 砂引草的胚珠結構、大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育A.胚珠倒生，單珠被；B.大孢子孢原細胞起源于珠心表皮下；C～E.孢原細胞發(fā)育為大孢子母細胞過程中，珠心細胞平周分裂為4層（箭頭所指）；F.直線型排列的大孢子四分體細胞，其中珠孔端的3個退化，合點端的為功能大孢子；G.單核胚囊；H.二核胚囊，箭頭指示2個核；I～J.連續(xù)切片，顯示四核胚囊，箭頭指示4個核，白色虛線指示珠被絨氈層；K～L.連續(xù)切片，顯示成熟胚囊及合點端殘存珠心細胞；ac.大孢子孢原細胞；dtc.退化四分體細胞；fm.功能大孢子；fu.珠柄；eg.卵細胞；in.珠被；nc.珠心細胞；nu.珠心；pn.極核；sy.助細胞。Plate Ⅱ Ovule structure，mega-sporogenesis，and female gametophyte development in M. sibirica A.Unitegmic anatropous ovule；B.Archesporial cell beneath the nucellar epidermal cell；C-E.The nucellar epidermal cells divided into 4 layer（sarrows point to） when the archesporial cell developed into the megaspore mother cell；F.Linear megaspore tetrad， three micropyle tetrad cells degenerated with the functional chalaza；G.1-nuclear embryo sac；H.2-nuclear embryo sac， arrow indicates two nuclei；I-J.Serial sections，showing a 4-nuclear embryo sac with arrows indicating four nuclei，the white dotted line indicates the tapetum layer；K-L.Serial sections showing mature embryo sac and residual nucellar cells at chalaza；ac.Archesporial cell；dtc.Degenerated tetrad cell；fm.Functional megaspore；fu.Funicle；eg.Egg cell；in.Integument；nc.Nucellar cells；nu.Nucellus；pn.Polar nucleus；sy.Synergid.

致謝感謝魯東大學菌物科學與技術研究院提供顯微攝影設備。