超支化修飾親水型陰離子色譜柱的制備與應(yīng)用

蒙素仟，劉 博*，劉偉俊，劉 瑞，桑柳波，賴華杰*

（1.中科檢測技術(shù)服務(wù)（廣州）股份有限公司，廣東 廣州 510650；2.中科檢測技術(shù)服務(wù)（重慶）有限公司，重慶400700；3.中國科學(xué)院廣州化學(xué)研究所，廣東 廣州 510650）

自1975年Small等［1］提出使用電導(dǎo)檢測離子化合物的離子色譜方法后，離子色譜技術(shù)得到了快速的商業(yè)化發(fā)展，已成為環(huán)境檢測、食品分析、醫(yī)學(xué)制藥、生物科學(xué)等行業(yè)十分有效的分析工具［2-7］。色譜柱是離子色譜儀的心臟，而聚合物因具有pH耐受范圍廣等特點成為色譜柱的主要基質(zhì)之一，但其疏水性使之在色譜分離過程中表現(xiàn)出峰展寬、拖尾、強保留等不良性能。因此，聚合物基離子色譜柱分離性能的改進主要聚焦于功能基團的修飾和新基質(zhì)材料的開發(fā)［8-12］。

離子色譜固定相功能基團的修飾方法主要包括乳膠聚附、衍生化法、樹狀超支化法、涂覆修飾等［13-16］。其中，超支化法修飾的固定相內(nèi)外表面可交聯(lián)成三維重復(fù)單元，在結(jié)構(gòu)上高度對稱并具有可修飾的末端基團。所形成的三維空間結(jié)構(gòu)可有效屏蔽聚合物基質(zhì)的疏水性，改善目標離子的峰形并改變其保留行為，備受色譜工作者的關(guān)注［10，13，16-19］。Chen等［10］使用聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯微球接枝聚乙烯胺，采用環(huán)氧-胺的聚合方法制備離子色譜固定相。Zhang等［20］以聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯微球為基質(zhì)微球，采用連續(xù)接枝和巰基修飾法制備聚電解質(zhì)接枝陰離子型固定相。Zhou 等［21］以硅膠為基質(zhì)微球，采用環(huán)氧-多巴胺連續(xù)接枝方式制備混合模式固定相。超支化修飾的離子色譜柱可應(yīng)用于復(fù)雜樣品檢測，但有關(guān)該類色譜柱對目標物保留機理的研究甚少。而目標物的保留行為是色譜在分離過程中識別離子、分子物理化學(xué)性質(zhì)的體現(xiàn)［22］。功能基團是影響目標物保留的因素之一，其選擇性主要受自身結(jié)構(gòu)、大小、分布的影響。因此，研究超支化修飾離子色譜固定相的功能基團對目標物的保留行為具有重要意義。

樹狀超支化修飾的功能基團末端具有活性，可實現(xiàn)分子大小、形狀、結(jié)構(gòu)的設(shè)計和控制，因此，可用于超支化修飾的固定相的保留行為研究［23-24］。本文以聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）作為基質(zhì)微球，通過磺化處理引入磺酸基團；接著采用樹狀超支化修飾方式，加入四乙烯五胺（TEPA）和1，4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDGE），待胺基與環(huán)氧鍵支化反應(yīng)生成羥基基團后以甲胺（MA）封端?；腔统Щ揎椧氲拇罅苛u基基團，可有效增加和固定相的親水性，進而可改變固定相對離子的選擇性。采用所制備的色譜柱對自來水、地表水、工業(yè)廢水等實際樣品進行檢測，考察其分離性能。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

XH-100B微波反應(yīng)儀、XH-2008DE超聲反應(yīng)儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；GLK-1000/2000壓柱機、色譜空柱（無錫加萊克色譜科技有限公司）；CIC-D120 離子色譜儀（青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司），配自動進樣器、柱溫箱和電導(dǎo)檢測器；L100BD-HK830 高倍光學(xué)顯微鏡（深圳市奧斯微光學(xué)儀器有限公司）；Sigma 300掃描電子顯微鏡（德國卡爾·蔡司股份公司）；TENSOR 27傅里葉變換-紅外光譜儀（FTIR，德國布魯克分析儀器公司）；Scientific K-Alpha X 射線光電能譜（美國賽默飛世爾科技有限公司）；ASAP 2460全自動比表面積及孔徑測定儀（美國麥克儀器公司）。

十二烷基硫酸鈉（SDS）、二乙烯基苯（55%，DVB）、MA（30%水溶液）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（K30、K90，PVP）、偶氮二異丁腈（重結(jié)晶，AIBN）、過氧化苯甲酰（BPO）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、苯乙烯（ST）、BDDGE 和TEPA 購自上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉（優(yōu)級純）、碳酸氫鈉和氫氧化鉀（優(yōu)級純）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲苯、丙酮（均為色譜純）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；無水乙醇購自廣東光華科技股份有限公司；濃硫酸（98%，優(yōu)級純）購自廣州化學(xué)試劑廠。以上試劑純度除特別說明外均為分析純。

1.2 色譜固定相的制備

固定相的制備主要分基質(zhì)微球的制備和在微球表面進行樹狀超支化修飾兩個步驟。色譜柱工藝流程圖如圖1所示。

圖1 陰離子色譜柱制備工藝流程圖Fig.1 Process scheme for preparation of anion chromatography column

1.2.1 PS-DVB微球的制備聚苯乙烯（PS）微球參考Huang等［14］的方法制備。

PS-DVB 微球的主要制備步驟如下：在100 mL H2O 中依次加入1.50 g SDS、0.24 g BPO、1.40 mL DBP、13.30 mL 甲苯，超聲分散，使液滴直徑均小于0.50 μm。將上述乳液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，加入3.96 g PS 微球，30 ℃下活化10 h。隨后加入13.30 mL ST、13.30 mL DVB，以及35.0 mL 質(zhì)量分數(shù)為4.28%的PVP 水溶液，繼續(xù)溶脹10 h。通入N2，升溫，70 ℃下反應(yīng)4 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物超聲、離心、洗滌、烘干，得到PS-DVB微球（OSD），待用。

1.2.2 固定相的制備將OSD微球與濃硫酸反應(yīng)得到磺化微球（SSD）。隨后，采用超支化法制備陰離子固定相，具體步驟為：①稱取5.00 g SSD 置于三口瓶中，分別加入15.0 mL 濃度為0.35 mol/L 的BDDGE 和TEPA；②將三口燒瓶放入微波反應(yīng)儀內(nèi)，70 ℃下反應(yīng)30 min；③將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管，用H2O 離心洗滌，再轉(zhuǎn)移至燒瓶中；④加入10 mL 0.58 mol/L 的BDDGE，在70 ℃下反應(yīng)15 min 后，重復(fù)步驟③；⑤加入10 mL 0.35 mol/L 的TEPA，70 ℃下反應(yīng)15 min，重復(fù)步驟③；⑥重復(fù)一次步驟④～步驟⑤；⑦重復(fù)一次步驟④；⑧加入10 mL 濃度為1.53 mol/L 的MA 溶液，70 ℃反應(yīng)15 min，以H2O-乙醇離心洗滌2～3次，即可獲得陰離子固定相（HSD）。

1.3 離子色譜柱的裝填

色譜柱規(guī)格為250 mm×4.6 mm。稱取5.0 g 上述制備的HSD 固定相，在25 mL H2O 中超聲分散30 min，轉(zhuǎn)移至勻漿罐中，以H2O 為頂流液，通過N2加壓（25 MPa）使流出液超過500 mL，隨后卸壓拆柱，即獲得離子色譜柱。

1.4 離子色譜儀工作條件

離子色譜儀的柱溫范圍為35～45 ℃，流速為0.7～1.2 mL/min，流動相分別為不同濃度的Na2CO3和Na2CO3-NaHCO3，等度洗脫，進樣體積為25 μL，檢測器為電導(dǎo)檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相形貌分析

圖2分別為PS、OSD、SSD以及HSD微球的SEM圖。由圖2A可知，PS為表面光滑的無孔微球，大小一致，粒徑約2 μm。由圖2B 可知，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)后，OSD 表面粗糙，內(nèi)附圖顯示其表面粗糙度均勻。從圖2中可以看出，磺化反應(yīng)（SSD，圖2C）和超支化反應(yīng)（HSD，圖2D）對微球的整體形貌無顯著影響，其粒徑約5 μm。

圖2 PS（A）、OSD（B）、SSD（C）、HSD（D）微球的SEM圖Fig.2 SEMs of PS（A），OSD（B），SSD（C） and HSD（D） microspheres

使用BET 分析微球的比表面積、孔徑大小、孔體積等相關(guān)參數(shù)。由圖3A 可知，OSD、SSD 以及HSD 三者的吸附脫附等溫線回滯，磺化、超支化反應(yīng)后，N2的吸附體積變小，微球的比表面積降低。BJH 模型計算結(jié)果（圖3B）顯示，HSD 與OSD、SSD 的孔徑相差較大，大孔的數(shù)量增加，表明超支化修飾后，大孔結(jié)構(gòu)的微球數(shù)量增多，材料的比表面積降低［25］。具體結(jié)果如表1所示。

表1 OSD、SSD、HSD的比表面積、孔體積和孔徑Table 1 Specific surface area，pore volume and pore diameter of OSD，SSD and HSD

圖3 OSD、SSD、HSD的吸附脫附等溫線（A）和孔徑大小分布圖（B）Fig.3 The adsorption and desorption curves（A） and pore size distribution（B）of OSD，SSD and HSD

2.2 固定相結(jié)構(gòu)分析

圖4 為OSD、SSD、HSD 的FTIR 圖。由圖可知，位于1 182、1 035 cm-1處的峰分別為S=O 的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動［26-27］，1 190 cm-1處的特征吸收峰為C—N 的伸縮振動，680 cm-1處為N—H的面外彎曲振動，3 450 cm-1處為—OH和N—H的伸縮振動［28］。上述吸收振動峰分別對應(yīng)—SO3-、N—H鍵和—OH 基團，表明磺化反應(yīng)使基質(zhì)苯環(huán)開環(huán)，與—SO3-發(fā)生取代反應(yīng)，在微球表面形成薄負電層，超支化反應(yīng)將胺基引入到基質(zhì)微球中，因此固定相表面具有磺酸和叔胺、季胺結(jié)構(gòu)。

圖4 OSD、SSD、HSD的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of OSD，SSD and HSD

用XPS 分析微球表面N、S 等元素的含量，結(jié)果如表2 所示。由表可知，磺化反應(yīng)后，微球表面C 元素的含量降低，超支化反應(yīng)后，C 元素進一步下降。而磺化反應(yīng)后S 元素含量明顯增加，說明磺酸基團有效引入到微球表面，這與FTIR 結(jié)論一致；而超支化反應(yīng)后，N 元素明顯增加，S 元素占比雖有所降低，但仍有部分S 元素保留，說明微球表面既有磺化反應(yīng)引入的磺酸基團又有超支化反應(yīng)引入的叔胺、季胺等胺基基團，與FTIR分析結(jié)果一致。

表2 OSD、SSD、HSD表面的元素分析結(jié)果Table 2 Elemental analysis results for OSD，SSD and HSD

2.3 色譜柱分離性能分析

將HSD 固定相裝填成色譜柱，以常見的7 種陰離子（F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-、SO42-、HPO42-）和5 種酸根離子為目標物，考察離子色譜固定相的分離效果和色譜保留行為。

圖5A 為HSD 色譜柱分離7 種陰離子（0.2～10.0 mg/L）的色譜圖，由圖可知，HSD 柱可在20 min 內(nèi)完成7種目標物的分離。其中，SO42-、HPO42-出峰較快（分別為11.2 min 和9.07 min），NO3-的保留時間為18.1 min。推測該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是超支化修飾改善了HSD 色譜柱固定相的疏水性，同時叔胺長鏈的空間位阻與離子交換［29-30］也起到了一定的作用。

圖5 7種陰離子在HSD柱（A～B）、商業(yè)色譜柱a（C）和商業(yè)色譜柱b（D）上的分離色譜圖Fig.5 Ion chromatograms of 7 anions separated at HSD column（A-B），commercial column a（C） and commercial column b（D）

如圖5B 所示，溫度≥40 ℃時，HSD 色譜柱可完全分離7 種陰離子。這是因為環(huán)境溫度升高，分子的布朗運動加劇，目標物與固定相的結(jié)合更快，色譜峰的出峰時間縮短，但保留能力即出峰順序未發(fā)生變化。

圖5C 和圖5D 分別為商品色譜柱在推薦條件（3.6 mmol/L Na2CO3淋洗液，30 ℃柱溫，流速分別為0.8 mL/min 和1.2 mL/min）下分離上述7種陰離子的色譜圖。在相同的實驗條件下，HSD 色譜柱由于采用磺化、超支化修飾，能夠完全分離目標物，達到與商品柱一樣的分離效果，且成本遠低于商品柱。

淋洗液的濃度和種類也會影響目標物在色譜柱上的保留行為。圖6A 為不同濃度Na2CO3淋洗液下HSD色譜柱分離7種陰離子的色譜圖。由圖可知，當淋洗液濃度改變時，二價目標物（SO42-、HPO42-）的保留時間均早于一些一價離子（Br-、NO3-）。由圖6B 可知，當淋洗液加入NaHCO3溶液時，除F-、Cl-外，其他陰離子的保留時間均發(fā)生變化。結(jié)果顯示，淋洗液種類會影響離子的保留時間，但不影響其出峰順序。

圖6 HSD柱在不同淋洗液質(zhì)量濃度下分離7種陰離子（10.0 mg/L）的色譜圖Fig.6 Chromatograms of 7 anions（10.0 mg/L） in different types of eluents using HSD column 1.0 mL/min，40 ℃；peaks：1.F-，2.Cl-，3.Br-，4.NO2-，5.NO3-，6.SO42-，7.HPO42-

2.4 實際樣品測定

為進一步驗證離子色譜柱的穩(wěn)定性及實用性，將HSD 色譜柱用于實際樣品中陰離子的檢測。地表水、自來水和工業(yè)廢水均于2023 年6月采自廣東省，樣品采集后1～5 ℃避光冷藏，24 h 內(nèi)上機檢測。配制7 種陰離子的標準溶液（0.05～50.0 mg/L），并繪制標準曲線，見表3。結(jié)果顯示7 種陰離子線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.995。以信噪比S/N=3 計算檢出限（LOD），S/N=10 計算定量下限（LOQ），得到各目標物的LOD和LOQ分別為0.003～0.160 mg/L和0.010～0.530 mg/L。

表3 7種陰離子的保留時間、線性關(guān)系和在地表水、自來水和工業(yè)廢水中的檢出限和定量下限Table 3 Retention times，linear relationships of 7 anions and their detection limits and quantitation limits in surface water，tap water and wastewater

每個樣品平行測定3 次，得到地表水中F-、Cl-、SO42-、NO3-的質(zhì)量濃度分別為0.18、4.35、15.39、4.38 mg/L，其他離子未檢出；自來水中F-、Cl-、SO42-、NO3-的質(zhì)量濃度分別為0.12、9.68、15.20、8.10 mg/L；工業(yè)廢水中F-、Cl-、SO42-、Br-的質(zhì)量濃度分別為0.32、323.83、149.88、1.79 mg/L。離子色譜柱對自來水、地表水、工業(yè)廢水樣品中陰離子檢測的相對標準偏差（RSD，n=3）為0.17%～3.7%。

2.5 HSD色譜柱的理論塔板數(shù)

以7 種常見陰離子（F-、Cl-、HPO42-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-）和5 種常見酸根離子（CH3COO-、ClO2-、BrO3-、ClO3-、C2O42-）為目標物，考察HSD色譜柱同時分離常見陰離子和酸根離子的效果，色譜圖如圖7所示。在40 ℃、1.0 mL/min、3.6 mmol/L Na2CO3淋洗液條件下，HSD 色譜柱可在20 min 內(nèi)完全分離上述12 種離子，相關(guān)色譜參數(shù)及理論塔板數(shù)見表4。由表可知，12 種離子色譜峰的拖尾因子、分離度良好，能夠滿足日常檢測需求。

表4 12種離子的不對稱因子、拖尾因子、分離度、理論塔板數(shù)Table 4 Asymmetry factor，tailing factor，resolution and number of theoretical plate of 12 anions

圖7 HSD柱分離12種離子（5.0 mg/L）的色譜圖Fig.7 Chromatogram of 12 anions（5.0 mg/L） separated using HSD column

3 結(jié) 論

本文以O(shè)SD為基質(zhì)微球，通過磺化反應(yīng)引入磺酸基團，再通過超支化修飾引入叔胺和季胺功能基團，制備出親水型離子色譜固定相。通過SEM、BET、FTIR、XPS 等方法表征陰離子固定相的形貌和結(jié)構(gòu)，并填充成色譜柱考察了其分離性能。結(jié)果顯示，磺化和超支化修飾方式可引入大量羥基基團，有效增加固定相的親水性，改變固定相對離子的選擇性，使二價離子（SO42-、HPO42-）的保留低于一些一價離子（Br-、NO3-）。在3.6 mmol/L Na2CO3淋洗液條件下，制備的色譜柱可在20 min內(nèi)實現(xiàn)12種離子的完全分離。將制備的HSD色譜柱用于實際樣品檢測，目標離子的RSD均低于4.0%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。