牛支原體的分離培養(yǎng)與分子生物學(xué)鑒定

胡 茜, 趙 超, 王永璇, 羅小芬, 冉芳菲, 成虹松, 朱二鵬,2, 牟真權(quán), 程振濤,2*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025;3. 德江縣平原鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心畜牧站,貴州 德江 565200)

牛支原體屬于原核生物,兼性厭氧,無(wú)細(xì)胞壁,體外培養(yǎng)周期較長(zhǎng),且對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求較高,條件適宜時(shí)可觀察到“煎蛋”樣菌落[1,2]。牛支原體感染可引起以肺炎為主的臨床癥狀,導(dǎo)致關(guān)節(jié)、結(jié)膜、乳腺、耳道等多處發(fā)生炎癥,并能誘發(fā)妊娠母牛流產(chǎn)[3]。此外,牛支原體攻擊機(jī)體的免疫系統(tǒng),增加繼發(fā)感染其他病原的概率[4]。2008年,我國(guó)首次從病牛肺臟中分離出牛支原體,此后牛支原體病在我國(guó)多個(gè)地區(qū)陸續(xù)有報(bào)道,并嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[5]。牛感染呼吸道疾病的病原復(fù)雜多樣,牛支原體是其中常見(jiàn)且危害較大的1種,快速鑒定診斷此病并采取相應(yīng)防治措施對(duì)于控制其流行和發(fā)展具有重要意義。在鑒別牛支原體的方法中,普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為檢測(cè)效率較高的技術(shù)而常用于實(shí)驗(yàn)室診斷[6]。2022年10月,貴州省平壩區(qū)某牛場(chǎng)出現(xiàn)發(fā)熱、氣喘病例,剖檢病死牛見(jiàn)肺臟有干酪樣病灶,疑似支原體感染。為確診其發(fā)病原因,本研究采集病死牛的肺臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷,現(xiàn)將相關(guān)情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集

無(wú)菌條件下采集病死牛的肺臟組織,4 ℃冷藏送至貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

改良Hayflick液體培養(yǎng)基:PPLO肉湯、馬血清(均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司),酵母粉(購(gòu)自英國(guó)OXOID公司),氨芐西林鈉(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司),葡萄糖、乙酸鈉(購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司);改良Frey氏固體培養(yǎng)基(購(gòu)自北京中海生物有限公司),柱提法病毒DNA/RNA提取試劑盒(購(gòu)自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司),支原體通用型(MYCO-U)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司),2×TaqPCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker(均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào):BPN-150CW,上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、生物顯微鏡(型號(hào):C33,上海普赫光電科技有限公司)、高速冷凍離心機(jī)[型號(hào):Sorvall Legend Micro 17R,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(型號(hào):FQD-96A,杭州博日科技股份有限公司)、基因擴(kuò)增儀(型號(hào):T20,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 病原分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取病死牛肺臟組織加入改良Hayflick液體培養(yǎng)基[7],置于37 ℃搖床中培養(yǎng)3 d,觀察到培養(yǎng)基顏色由紅色轉(zhuǎn)為黃色時(shí),無(wú)菌條件下以相同條件傳代2次。傳代完成后取菌液200 μL接種于改良Frey氏固體培養(yǎng)基,倒置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,用接種環(huán)挑取單個(gè)典型菌落接種于改良Hayflick液體培養(yǎng)基。重復(fù)上述操作培養(yǎng)純化3次,分別于 -80 ℃甘油及凍干保存菌種。

1.5 病原實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定

取培養(yǎng)菌液1 mL,12 000 r/min離心15 min,按照柱提法病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA作為模板。根據(jù)支原體通用型核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),設(shè)置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μL:MYCO-U反應(yīng)液19 μL,混合酶液1 μL,模板5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;擴(kuò)增95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)),共45個(gè)循環(huán)。判定條件:各樣品達(dá)到閾值線的循環(huán)數(shù)即為Ct值,陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤32并出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線,陰性對(duì)照無(wú)特征性擴(kuò)增曲線(無(wú)Ct值),以上條件同時(shí)滿足則試驗(yàn)有效,否則視為無(wú)效。當(dāng)被檢樣品出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線且Ct值≤40判為陽(yáng)性,被檢樣品Ct值>40或無(wú)Ct值判為陰性。

1.6 基因測(cè)序分析

參考GenBank收錄的牛支原體PG45(登錄號(hào):CP002188.1)基因序列設(shè)計(jì)牛支原體特異引物(F:5’-ATAAAAAAATCTAACAAT-3’,Tm值35.4 ℃;R:5’-TTAGTGAACAATTAACTTGGAAT-3’,Tm值46.4 ℃;預(yù)擴(kuò)增片段345 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL:上、下游引物各1 μL,模板4 μL,Mix 10 μL,ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共循環(huán)35次;72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),取陽(yáng)性產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中收錄的10株不同支原體參考株(見(jiàn)表1)進(jìn)行同源性比較,繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)菌落形態(tài)

在改良Frey氏固體培養(yǎng)基上可見(jiàn)針尖大小的單個(gè)菌落,顯微鏡下觀察呈現(xiàn)“煎蛋”樣菌落(見(jiàn)圖1),符合支原體培養(yǎng)特征。

圖1 改良Frey氏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)(10×10)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定結(jié)果

由圖2可見(jiàn):分離菌株Ct值為28.91,且有特征性擴(kuò)增曲線,判為陽(yáng)性,提示為支原體。

1:分離菌株;+:陽(yáng)性對(duì)照;-:陰性對(duì)照?qǐng)D2 分離菌株實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定結(jié)果

M:DL 2 000 DNA Marker;1:分離菌株;+:陽(yáng)性對(duì)照;-:陰性對(duì)照?qǐng)D3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 基因測(cè)序結(jié)果

由圖3可見(jiàn):PCR擴(kuò)增出與預(yù)期片段相符的345 bp目的條帶,將分離菌株命名為GZ-PB1?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果顯示,分離菌株與各牛支原體參考株的同源性均高達(dá)95.6%(見(jiàn)圖4),且處于同一進(jìn)化分支(見(jiàn)圖5);與豬、羊、雞支原體參考株的同源性均小于30%,并處于不同進(jìn)化分支。分離菌鑒定為牛支原體。

圖4 分離菌株與10株支原體的同源性比較

圖5 分離菌株與10株支原體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論

通過(guò)病原分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定,診斷發(fā)病牛為牛支原體感染。

4 討論

牛支原體病的傳染源及傳播方式多種多樣,難以防范[8]。牛感染支原體病后生產(chǎn)性能下降,且易繼發(fā)感染其他病原造成嚴(yán)重?fù)p害,因此需及時(shí)診斷并制定隔離、治療和淘汰等措施。牛支原體的分離鑒定是常用診斷方法之一,可用于DNA提取、菌種保存、流調(diào)及分析與其他菌株的親緣關(guān)系等,但由于牛支原體在體外培養(yǎng)較困難、生長(zhǎng)周期長(zhǎng),因此存在一定的局限性[9,10]。普通PCR方法的檢測(cè)效率、靈敏度和特異性都較高,可用于臨床樣本的快速檢測(cè),但其耗時(shí)較長(zhǎng),且可能出現(xiàn)假陽(yáng)性[11,12]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度是普通PCR的4～10倍,具有檢測(cè)速度快、定量準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究通過(guò)病原分離培養(yǎng)初步判斷病牛為支原體感染,再結(jié)合分子生物學(xué)鑒定和遺傳進(jìn)化分析,相互彌補(bǔ)各檢測(cè)方法的不足,快速、準(zhǔn)確地診斷出本次感染病原為牛支原體。