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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹參抑制FASN表達(dá)治療膀胱癌的分子機(jī)制研究

    2024-01-02 10:42:24桂志明黃健李世豪吳昊開汪前亮
    關(guān)鍵詞:膀胱癌丹參靶點(diǎn)

    桂志明 黃健 李世豪 吳昊開 汪前亮

    廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,湛江 524001

    膀胱癌作為泌尿系最常見的惡性腫瘤,位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第9 位及病死率第13 位[1],其極易復(fù)發(fā)并伴隨著較差的預(yù)后,使臨床治療困難。目前,針對(duì)膀胱癌尚無(wú)較好的藥物治療策略,仍以手術(shù)切除為主,但淺表性膀胱癌電切術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%~70%,其中10%~20%患者可進(jìn)一步發(fā)展為浸潤(rùn)性膀胱癌[2]。但傳統(tǒng)意義上的放化療則往往治療效果不佳,不論是針對(duì)膀胱癌細(xì)胞的腫瘤殺傷指數(shù)偏低,或是治療不良反應(yīng)偏大,使這種治療手段無(wú)法在臨床獲益[3]?;谶@一現(xiàn)狀,研究新的治療策略,開發(fā)新的治療藥物,提高臨床治療效果,已極為迫切。目前,臨床上藥物治療膀胱癌除了絲裂霉素C 及表柔比星等化療藥物外,還有一些較好的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn),卡介苗可通過刺激患者免疫進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展,是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌最有效的治療方法,此外,部分中藥及腺相關(guān)病毒也在近年來展現(xiàn)出足夠的治療潛力,有望為膀胱癌的治療提供助力[4]。尤其是中藥,在近年來,逐漸在腫瘤治療領(lǐng)域展露光彩,但因缺乏系統(tǒng)性的研究框架,未能深入揭示中藥治療腫瘤的功能機(jī)制。較單靶點(diǎn)藥物而言,傳統(tǒng)中藥(TCM)具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)[5]。此外,與化學(xué)合成的藥物相比,TCM 以其天然產(chǎn)物的身份往往更易于人體吸收,且在很大程度上對(duì)機(jī)體是無(wú)害的,這極大彌補(bǔ)了其他治療藥物不良反應(yīng)大的巨大缺陷[6]。丹參作為著名藥材應(yīng)用于臨床治療中,尤其在心腦血管方面具備悠久的使用歷史,療效顯著[7]。隨著研究深入,丹參在癌癥治療中的作用日益凸顯,大量文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道[8-10],但并未系統(tǒng)闡明丹參在膀胱癌治療中的作用機(jī)制。隨著生物大數(shù)據(jù)的精確性不斷提高以及生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與藥理學(xué)的不斷融合,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示中藥有效成分及精準(zhǔn)靶點(diǎn)的Network 模式已被認(rèn)為是一種極具潛力的研究方法[11-15]。本研究基于這一方法,深入分析丹參的有效活性成分及其潛在分子靶點(diǎn),結(jié)合膀胱癌患者的癌癥基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集,進(jìn)行預(yù)后及風(fēng)險(xiǎn)回歸分析等,確定其治療靶點(diǎn),并在體外細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,為丹參治療膀胱癌提供詳細(xì)的分子機(jī)制基礎(chǔ),為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材料與方法

    1.材料

    膀胱癌細(xì)胞系:5637、T24、J82、UMUC3(ATCC 細(xì)胞庫(kù));正常膀胱上皮細(xì)胞:SV-HUC-1(ATCC 細(xì)胞庫(kù))??贵w:脂肪酸合成酶(FASN)(Proteintech;10624-2-AP)。丹參提取物:扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司購(gòu)買。培養(yǎng)液:1640培養(yǎng)基(GIBCO);DMEN 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO);MEM 培養(yǎng)基(GIBCO);FBS(胎牛血清,依客賽);L-Glutamine 200mM(100X)(GIBCO)。耗材:培養(yǎng)皿(耐思NEST),Transwell 小室(REF,353097)。研究時(shí)間:2022 年1 月至2023年6月。

    2.方法

    2.1.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹參有效成分及分子靶點(diǎn) 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲得丹參的成分信息,根據(jù)生物利用度(OB)≥30%,類藥性指數(shù)(DL)≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選有效藥物成分,通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)收集有效成分的治療靶點(diǎn)并在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析。

    2.2.基因本體論(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)功能富集分析 通過WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.webgestalt.org/)對(duì)這些分子靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 功能分析,并對(duì)前十位的通路進(jìn)行可視化。

    2.3.TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)集篩選 從TCGA數(shù)據(jù)集(https://tcga-data.nci.nih.GOv/tcga/)下載截至2023年7月11日前膀胱癌患者的RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床資料,包括生存狀態(tài)等臨床信息,納入上述獲得的藥物分子靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)后分析(P<0.05),篩選存在預(yù)后價(jià)值的丹參-疾病基因,同時(shí)應(yīng)用“l(fā)imma”包分析這些基因在癌與癌旁組織中的差異表達(dá)(P<0.05)。

    2.4.風(fēng)險(xiǎn)回歸模型構(gòu)建 本研究納入TCGA 數(shù)據(jù)集共408 個(gè)膀胱癌樣本,隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集,各204 個(gè)。訓(xùn)練集用于構(gòu)建丹參-疾病基因的風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,測(cè)試集用于驗(yàn)證所建立的模型?;谙惹矮@得的44 個(gè)具有預(yù)后價(jià)值的靶點(diǎn),使用R 軟件包“glmnet”進(jìn)行l(wèi)asso-Cox 回歸分析。進(jìn)而從TCGA 數(shù)據(jù)集中篩選出18 個(gè)與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)患者的總生存率顯著相關(guān)的丹參-疾病基因,基于這些基因成功建立風(fēng)險(xiǎn)模型。使用以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=coe(fRNA1)×expr(RNA1)+coe(fRNA2)×expr(RNA2)+……+coe(fRNA18)×expr(RNA18),coef 表示與存活相關(guān)的RNA 系數(shù),expr(RNA)表示RNA 的表達(dá)。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立包括低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的亞組。

    2.5.關(guān)鍵蛋白FASN 驗(yàn)證 在獲得風(fēng)險(xiǎn)基因后,進(jìn)一步結(jié)合其風(fēng)險(xiǎn)系數(shù),基因表達(dá)水平與預(yù)后信息進(jìn)行篩選,確定FASN 是最顯著高風(fēng)險(xiǎn)基因后,在常見膀胱癌細(xì)胞系中進(jìn)行Western blot 蛋白檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)至80%時(shí)停止生長(zhǎng),用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取。以7.5%的SDS-PAGE 分離膠進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后加入標(biāo)記FASN 和GAPDH 抗體在4 ℃冰箱孵育過夜,TBST 清洗聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后再加入對(duì)應(yīng)的二抗(Rabbit)室溫下孵育1 h,TBST清洗后借助ECL顯影液進(jìn)行顯影。

    2.6. 細(xì)胞分組和處理 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的J82 細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行處理,分別加入丹參提取物(1 mg/ml)與PBS(陰性對(duì)照)進(jìn)行處理。

    2.7.細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力檢測(cè) 細(xì)胞增殖:取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行鋪板(96 孔板),然后加入丹參提取物處理,分別在24 h、48 h、72 h 進(jìn)行MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;侵襲:首先將細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行鋪板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行藥物處理,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞橫向遷移能力變化;侵襲:同樣取正常細(xì)胞,在細(xì)胞長(zhǎng)至70%進(jìn)行藥物處理,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化,提前在Transwell 小室內(nèi)部進(jìn)行基質(zhì)膠處理,然后在小室內(nèi)加入5×103個(gè)藥物處理過的細(xì)胞與正常細(xì)胞,待24 h后取出小室以棉球擦除小室內(nèi)部未穿過的細(xì)胞,以結(jié)晶紫染色拍照,觀察細(xì)胞侵襲能力變化。

    3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    研究結(jié)果采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較。

    結(jié)果

    1.構(gòu)建丹參-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    將丹參有效成分及其靶點(diǎn)信息輸入Cytoscape_v3.8.2進(jìn)行可視化分析,得到藥物-有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖,其中丹參有效成分65個(gè),靶點(diǎn)270個(gè)(圖1)。

    2.丹參靶點(diǎn)的功能富集分析

    在獲得丹參靶點(diǎn)信息后,進(jìn)行GO 與KEGG 功能富集分析,結(jié)果顯示其主要富集在氮代謝、膀胱癌、內(nèi)分泌抵抗、催乳素信號(hào)通路、前列腺癌及其他癌癥等通路上,展現(xiàn)出丹參在膀胱癌及其他癌癥中的治療潛力(圖2)。

    圖2 丹參有效靶點(diǎn)的GO功能富集分析(A)及KEGG功能富集分析(B)

    3.膀胱癌有效靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

    將270個(gè)藥物靶點(diǎn)輸入膀胱癌TCGA 數(shù)據(jù)集中(Tumor:408 比Normal:19),結(jié)合患者預(yù)后信息進(jìn)行篩選,其中44 個(gè)基因在膀胱癌中具有預(yù)后價(jià)值(P<0.05),接著基于“l(fā)imma”R 包分析其在膀胱癌與癌旁之間的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,其中33個(gè)基因存在差異表達(dá)(圖3)。

    圖3 44個(gè)基因預(yù)后信息(A)及44個(gè)基因在膀胱癌與癌旁中的表達(dá)水平(B)

    4.基于18個(gè)基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

    研究基于其中的18 個(gè)基因在膀胱癌測(cè)序數(shù)據(jù)集中建立風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,其測(cè)試集(204 例)曲線下面積(AUC)=0.819,驗(yàn)證集(204 例)AUC=0.661,具備預(yù)測(cè)價(jià)值(圖4)。MAOA、NR1H3、PTPN6、PDE10A、CASP9、POLB及EED是低風(fēng)險(xiǎn)基因,而MMP9、HCAR2、ADRA2C、PSMB5、SUZ12、FASN、MAP2K1、PGR、SLC6A2、HTR2B、ABCC9 則是高風(fēng)險(xiǎn)基因,研究結(jié)合患者臨床信息發(fā)現(xiàn),高風(fēng)險(xiǎn)基因在TNM 高等級(jí)患者中表達(dá)水平更高(圖5)。研究進(jìn)一步分析這些基因在癌與癌旁間的表達(dá),結(jié)果顯示,MAOA 作為低風(fēng)險(xiǎn)基因在癌中顯著低表達(dá),而HCAR2、FASN、MMP9及PSMB5則作為高風(fēng)險(xiǎn)基因在癌中顯著高表達(dá),其中又以FASN系數(shù)最高(圖6)。預(yù)后信息同樣顯示其預(yù)后較差??偵媛剩篐R=1.66,無(wú)復(fù)發(fā)生存期:HR=2.61,可作為促癌基因進(jìn)行后續(xù)研究分析(圖7)。

    圖4 基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。A:10倍交叉驗(yàn)證的LASSO回歸圖譜;B:18個(gè)基因的LASSO系數(shù)圖譜;Kaplan-Meier對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群中MIBC的生存分析(C:測(cè)試集:D:驗(yàn)證集);風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型ROC(E:測(cè)試集:F:驗(yàn)證集)

    圖6 風(fēng)險(xiǎn)基因在癌與癌旁中的表達(dá)水平分析

    5.丹參可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖侵襲及遷移能力

    在常見膀胱癌細(xì)胞系及正常膀胱上皮細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ASN 在J82 細(xì)胞系中顯著高表達(dá),而丹參提取物在10 mg/L 時(shí)不影響膀胱上皮細(xì)胞生長(zhǎng)但可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng),并可抑制其增殖、侵襲及遷移能力(圖8)。

    討論

    隨著我國(guó)對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展創(chuàng)新的日益重視,探索中藥在多種疾病尤其是腫瘤領(lǐng)域中的治療效用是重要方向,而科學(xué)的研究理念結(jié)合先進(jìn)技術(shù)手段可以更深入挖掘其間機(jī)制。丹參不僅可作為心腦血管治療藥物,其在腫瘤治療中同樣具備顯著治療作用。Zhou 等[16]研究發(fā)現(xiàn),丹參酮Ⅰ可通過使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/蛋氨酸合成酶通路失活,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬并最終減弱卵巢癌的惡性生物學(xué)特性;Chen 等[17]研究顯示,丹參多糖可通過激活Toll樣受體介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路進(jìn)而激活癌癥患者的T細(xì)胞免疫,緩解腫瘤患者免疫微環(huán)境抑制狀態(tài)。Cao等[18]研究同樣顯示,丹參提取物-二氫丹參酮能通過調(diào)節(jié)胱天蛋白酶與細(xì)胞色素C 進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖;而在泌尿系惡性腫瘤中,丹參同樣發(fā)揮著重要作用。Park 等[19]研究報(bào)道,從丹參中分離出來的主要成分-隱丹參酮可通過Bcl-2 和MAPK 調(diào)節(jié)使DU145 前列腺癌細(xì)胞對(duì)Fas(APO1/CD95)介導(dǎo)的凋亡敏感。Chen 等[20]研究發(fā)現(xiàn),丹參的水性成分丹酚酸B 可抑制YAP1 和Hippo 信號(hào)的激活,從而消除了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),并導(dǎo)致N-鈣黏蛋白表達(dá)降低,同時(shí)下調(diào)SNAIL1 和TWIST,并伴有高剪切應(yīng)力誘發(fā)的腎癌細(xì)胞凋亡。這些研究均顯示出丹參在腫瘤治療中的潛力,而在膀胱癌中,則分別發(fā)現(xiàn)了丹參酮ⅡA 及隱丁胺酮(CTT)均具有治療作用[21-22]。截至目前,其在膀胱癌中的功效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

    本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法及TCGA 等大數(shù)據(jù)分析,丹參提取物具備一定的抗癌活性,可通過抑制FASN 的表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。FASN 處于激活狀態(tài)時(shí),是一種具有7 種不同催化活性的同型二聚體,可在肝臟中產(chǎn)生脂質(zhì)后輸出到代謝活躍的組織或儲(chǔ)存在脂肪組織中。免疫組織化學(xué)染色表明FASN 水平與乳腺腫瘤大小直接相關(guān)[23],且FASN在肺癌和前列腺癌中高表達(dá),是乳腺癌和前列腺癌的預(yù)后不良指標(biāo)[24-26]。FASN作為癌癥和代謝綜合征診療中的一個(gè)潛在靶標(biāo)已受到越來越多的關(guān)注[27-28]。Xiong 等[29]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ASN 在膀胱癌正常組織和腫瘤組織中表達(dá)存在差異,并且與生存相關(guān),可獨(dú)立預(yù)測(cè)MIBC 進(jìn)展,與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān),研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FASN 低表達(dá)的患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)往往更好。而Deng 等[30]研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以靶向Clusterin 進(jìn)而通過SREBP-1c/FASN 軸調(diào)控脂肪生成并抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。這些研究展現(xiàn)出FASN 作為促癌基因在膀胱癌這重要功能。本研究在前期數(shù)據(jù)分析中顯示,丹參可下游作用于FASN并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步揭示其調(diào)控關(guān)系,即丹參提取物可抑制FASN表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌惡性表型。

    本研究表明丹參提取物可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系惡性表型,其有望作為一味中藥應(yīng)用于臨床上膀胱癌的預(yù)防或治療;本研究通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯矿w系結(jié)合大數(shù)據(jù)挖掘及實(shí)驗(yàn)技術(shù)等證明了丹參提取物在膀胱癌治療中的功能機(jī)制,同樣為后續(xù)藥物研發(fā)提供了新的研究策略。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    作者貢獻(xiàn)聲明 桂志明:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),起草文章,獲取研究經(jīng)費(fèi);黃?。悍治?解釋數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)分析;李世豪:實(shí)施研究;吳昊開:分析/解釋數(shù)據(jù);汪前亮:采集數(shù)據(jù),對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱,指導(dǎo)

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