• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析丹參抑制FASN表達(dá)治療膀胱癌的分子機(jī)制研究

    2024-01-02 10:42:24桂志明黃健李世豪吳昊開汪前亮
    關(guān)鍵詞:膀胱癌丹參靶點(diǎn)

    桂志明 黃健 李世豪 吳昊開 汪前亮

    廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,湛江 524001

    膀胱癌作為泌尿系最常見的惡性腫瘤,位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第9 位及病死率第13 位[1],其極易復(fù)發(fā)并伴隨著較差的預(yù)后,使臨床治療困難。目前,針對(duì)膀胱癌尚無(wú)較好的藥物治療策略,仍以手術(shù)切除為主,但淺表性膀胱癌電切術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%~70%,其中10%~20%患者可進(jìn)一步發(fā)展為浸潤(rùn)性膀胱癌[2]。但傳統(tǒng)意義上的放化療則往往治療效果不佳,不論是針對(duì)膀胱癌細(xì)胞的腫瘤殺傷指數(shù)偏低,或是治療不良反應(yīng)偏大,使這種治療手段無(wú)法在臨床獲益[3]?;谶@一現(xiàn)狀,研究新的治療策略,開發(fā)新的治療藥物,提高臨床治療效果,已極為迫切。目前,臨床上藥物治療膀胱癌除了絲裂霉素C 及表柔比星等化療藥物外,還有一些較好的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn),卡介苗可通過刺激患者免疫進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展,是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌最有效的治療方法,此外,部分中藥及腺相關(guān)病毒也在近年來展現(xiàn)出足夠的治療潛力,有望為膀胱癌的治療提供助力[4]。尤其是中藥,在近年來,逐漸在腫瘤治療領(lǐng)域展露光彩,但因缺乏系統(tǒng)性的研究框架,未能深入揭示中藥治療腫瘤的功能機(jī)制。較單靶點(diǎn)藥物而言,傳統(tǒng)中藥(TCM)具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)[5]。此外,與化學(xué)合成的藥物相比,TCM 以其天然產(chǎn)物的身份往往更易于人體吸收,且在很大程度上對(duì)機(jī)體是無(wú)害的,這極大彌補(bǔ)了其他治療藥物不良反應(yīng)大的巨大缺陷[6]。丹參作為著名藥材應(yīng)用于臨床治療中,尤其在心腦血管方面具備悠久的使用歷史,療效顯著[7]。隨著研究深入,丹參在癌癥治療中的作用日益凸顯,大量文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道[8-10],但并未系統(tǒng)闡明丹參在膀胱癌治療中的作用機(jī)制。隨著生物大數(shù)據(jù)的精確性不斷提高以及生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與藥理學(xué)的不斷融合,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示中藥有效成分及精準(zhǔn)靶點(diǎn)的Network 模式已被認(rèn)為是一種極具潛力的研究方法[11-15]。本研究基于這一方法,深入分析丹參的有效活性成分及其潛在分子靶點(diǎn),結(jié)合膀胱癌患者的癌癥基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集,進(jìn)行預(yù)后及風(fēng)險(xiǎn)回歸分析等,確定其治療靶點(diǎn),并在體外細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,為丹參治療膀胱癌提供詳細(xì)的分子機(jī)制基礎(chǔ),為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材料與方法

    1.材料

    膀胱癌細(xì)胞系:5637、T24、J82、UMUC3(ATCC 細(xì)胞庫(kù));正常膀胱上皮細(xì)胞:SV-HUC-1(ATCC 細(xì)胞庫(kù))??贵w:脂肪酸合成酶(FASN)(Proteintech;10624-2-AP)。丹參提取物:扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司購(gòu)買。培養(yǎng)液:1640培養(yǎng)基(GIBCO);DMEN 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO);MEM 培養(yǎng)基(GIBCO);FBS(胎牛血清,依客賽);L-Glutamine 200mM(100X)(GIBCO)。耗材:培養(yǎng)皿(耐思NEST),Transwell 小室(REF,353097)。研究時(shí)間:2022 年1 月至2023年6月。

    2.方法

    2.1.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹參有效成分及分子靶點(diǎn) 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲得丹參的成分信息,根據(jù)生物利用度(OB)≥30%,類藥性指數(shù)(DL)≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選有效藥物成分,通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)收集有效成分的治療靶點(diǎn)并在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析。

    2.2.基因本體論(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)功能富集分析 通過WebGestalt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.webgestalt.org/)對(duì)這些分子靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 功能分析,并對(duì)前十位的通路進(jìn)行可視化。

    2.3.TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)集篩選 從TCGA數(shù)據(jù)集(https://tcga-data.nci.nih.GOv/tcga/)下載截至2023年7月11日前膀胱癌患者的RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床資料,包括生存狀態(tài)等臨床信息,納入上述獲得的藥物分子靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)后分析(P<0.05),篩選存在預(yù)后價(jià)值的丹參-疾病基因,同時(shí)應(yīng)用“l(fā)imma”包分析這些基因在癌與癌旁組織中的差異表達(dá)(P<0.05)。

    2.4.風(fēng)險(xiǎn)回歸模型構(gòu)建 本研究納入TCGA 數(shù)據(jù)集共408 個(gè)膀胱癌樣本,隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集,各204 個(gè)。訓(xùn)練集用于構(gòu)建丹參-疾病基因的風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,測(cè)試集用于驗(yàn)證所建立的模型?;谙惹矮@得的44 個(gè)具有預(yù)后價(jià)值的靶點(diǎn),使用R 軟件包“glmnet”進(jìn)行l(wèi)asso-Cox 回歸分析。進(jìn)而從TCGA 數(shù)據(jù)集中篩選出18 個(gè)與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)患者的總生存率顯著相關(guān)的丹參-疾病基因,基于這些基因成功建立風(fēng)險(xiǎn)模型。使用以下公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=coe(fRNA1)×expr(RNA1)+coe(fRNA2)×expr(RNA2)+……+coe(fRNA18)×expr(RNA18),coef 表示與存活相關(guān)的RNA 系數(shù),expr(RNA)表示RNA 的表達(dá)。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立包括低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的亞組。

    2.5.關(guān)鍵蛋白FASN 驗(yàn)證 在獲得風(fēng)險(xiǎn)基因后,進(jìn)一步結(jié)合其風(fēng)險(xiǎn)系數(shù),基因表達(dá)水平與預(yù)后信息進(jìn)行篩選,確定FASN 是最顯著高風(fēng)險(xiǎn)基因后,在常見膀胱癌細(xì)胞系中進(jìn)行Western blot 蛋白檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)至80%時(shí)停止生長(zhǎng),用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取。以7.5%的SDS-PAGE 分離膠進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后加入標(biāo)記FASN 和GAPDH 抗體在4 ℃冰箱孵育過夜,TBST 清洗聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后再加入對(duì)應(yīng)的二抗(Rabbit)室溫下孵育1 h,TBST清洗后借助ECL顯影液進(jìn)行顯影。

    2.6. 細(xì)胞分組和處理 取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的J82 細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行處理,分別加入丹參提取物(1 mg/ml)與PBS(陰性對(duì)照)進(jìn)行處理。

    2.7.細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力檢測(cè) 細(xì)胞增殖:取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行鋪板(96 孔板),然后加入丹參提取物處理,分別在24 h、48 h、72 h 進(jìn)行MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;侵襲:首先將細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行鋪板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)進(jìn)行藥物處理,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞橫向遷移能力變化;侵襲:同樣取正常細(xì)胞,在細(xì)胞長(zhǎng)至70%進(jìn)行藥物處理,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化,提前在Transwell 小室內(nèi)部進(jìn)行基質(zhì)膠處理,然后在小室內(nèi)加入5×103個(gè)藥物處理過的細(xì)胞與正常細(xì)胞,待24 h后取出小室以棉球擦除小室內(nèi)部未穿過的細(xì)胞,以結(jié)晶紫染色拍照,觀察細(xì)胞侵襲能力變化。

    3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    研究結(jié)果采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較。

    結(jié)果

    1.構(gòu)建丹參-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    將丹參有效成分及其靶點(diǎn)信息輸入Cytoscape_v3.8.2進(jìn)行可視化分析,得到藥物-有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖,其中丹參有效成分65個(gè),靶點(diǎn)270個(gè)(圖1)。

    2.丹參靶點(diǎn)的功能富集分析

    在獲得丹參靶點(diǎn)信息后,進(jìn)行GO 與KEGG 功能富集分析,結(jié)果顯示其主要富集在氮代謝、膀胱癌、內(nèi)分泌抵抗、催乳素信號(hào)通路、前列腺癌及其他癌癥等通路上,展現(xiàn)出丹參在膀胱癌及其他癌癥中的治療潛力(圖2)。

    圖2 丹參有效靶點(diǎn)的GO功能富集分析(A)及KEGG功能富集分析(B)

    3.膀胱癌有效靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

    將270個(gè)藥物靶點(diǎn)輸入膀胱癌TCGA 數(shù)據(jù)集中(Tumor:408 比Normal:19),結(jié)合患者預(yù)后信息進(jìn)行篩選,其中44 個(gè)基因在膀胱癌中具有預(yù)后價(jià)值(P<0.05),接著基于“l(fā)imma”R 包分析其在膀胱癌與癌旁之間的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,其中33個(gè)基因存在差異表達(dá)(圖3)。

    圖3 44個(gè)基因預(yù)后信息(A)及44個(gè)基因在膀胱癌與癌旁中的表達(dá)水平(B)

    4.基于18個(gè)基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

    研究基于其中的18 個(gè)基因在膀胱癌測(cè)序數(shù)據(jù)集中建立風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,其測(cè)試集(204 例)曲線下面積(AUC)=0.819,驗(yàn)證集(204 例)AUC=0.661,具備預(yù)測(cè)價(jià)值(圖4)。MAOA、NR1H3、PTPN6、PDE10A、CASP9、POLB及EED是低風(fēng)險(xiǎn)基因,而MMP9、HCAR2、ADRA2C、PSMB5、SUZ12、FASN、MAP2K1、PGR、SLC6A2、HTR2B、ABCC9 則是高風(fēng)險(xiǎn)基因,研究結(jié)合患者臨床信息發(fā)現(xiàn),高風(fēng)險(xiǎn)基因在TNM 高等級(jí)患者中表達(dá)水平更高(圖5)。研究進(jìn)一步分析這些基因在癌與癌旁間的表達(dá),結(jié)果顯示,MAOA 作為低風(fēng)險(xiǎn)基因在癌中顯著低表達(dá),而HCAR2、FASN、MMP9及PSMB5則作為高風(fēng)險(xiǎn)基因在癌中顯著高表達(dá),其中又以FASN系數(shù)最高(圖6)。預(yù)后信息同樣顯示其預(yù)后較差??偵媛剩篐R=1.66,無(wú)復(fù)發(fā)生存期:HR=2.61,可作為促癌基因進(jìn)行后續(xù)研究分析(圖7)。

    圖4 基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。A:10倍交叉驗(yàn)證的LASSO回歸圖譜;B:18個(gè)基因的LASSO系數(shù)圖譜;Kaplan-Meier對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群中MIBC的生存分析(C:測(cè)試集:D:驗(yàn)證集);風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型ROC(E:測(cè)試集:F:驗(yàn)證集)

    圖6 風(fēng)險(xiǎn)基因在癌與癌旁中的表達(dá)水平分析

    5.丹參可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖侵襲及遷移能力

    在常見膀胱癌細(xì)胞系及正常膀胱上皮細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ASN 在J82 細(xì)胞系中顯著高表達(dá),而丹參提取物在10 mg/L 時(shí)不影響膀胱上皮細(xì)胞生長(zhǎng)但可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng),并可抑制其增殖、侵襲及遷移能力(圖8)。

    討論

    隨著我國(guó)對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展創(chuàng)新的日益重視,探索中藥在多種疾病尤其是腫瘤領(lǐng)域中的治療效用是重要方向,而科學(xué)的研究理念結(jié)合先進(jìn)技術(shù)手段可以更深入挖掘其間機(jī)制。丹參不僅可作為心腦血管治療藥物,其在腫瘤治療中同樣具備顯著治療作用。Zhou 等[16]研究發(fā)現(xiàn),丹參酮Ⅰ可通過使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/蛋氨酸合成酶通路失活,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬并最終減弱卵巢癌的惡性生物學(xué)特性;Chen 等[17]研究顯示,丹參多糖可通過激活Toll樣受體介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路進(jìn)而激活癌癥患者的T細(xì)胞免疫,緩解腫瘤患者免疫微環(huán)境抑制狀態(tài)。Cao等[18]研究同樣顯示,丹參提取物-二氫丹參酮能通過調(diào)節(jié)胱天蛋白酶與細(xì)胞色素C 進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖;而在泌尿系惡性腫瘤中,丹參同樣發(fā)揮著重要作用。Park 等[19]研究報(bào)道,從丹參中分離出來的主要成分-隱丹參酮可通過Bcl-2 和MAPK 調(diào)節(jié)使DU145 前列腺癌細(xì)胞對(duì)Fas(APO1/CD95)介導(dǎo)的凋亡敏感。Chen 等[20]研究發(fā)現(xiàn),丹參的水性成分丹酚酸B 可抑制YAP1 和Hippo 信號(hào)的激活,從而消除了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),并導(dǎo)致N-鈣黏蛋白表達(dá)降低,同時(shí)下調(diào)SNAIL1 和TWIST,并伴有高剪切應(yīng)力誘發(fā)的腎癌細(xì)胞凋亡。這些研究均顯示出丹參在腫瘤治療中的潛力,而在膀胱癌中,則分別發(fā)現(xiàn)了丹參酮ⅡA 及隱丁胺酮(CTT)均具有治療作用[21-22]。截至目前,其在膀胱癌中的功效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

    本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法及TCGA 等大數(shù)據(jù)分析,丹參提取物具備一定的抗癌活性,可通過抑制FASN 的表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。FASN 處于激活狀態(tài)時(shí),是一種具有7 種不同催化活性的同型二聚體,可在肝臟中產(chǎn)生脂質(zhì)后輸出到代謝活躍的組織或儲(chǔ)存在脂肪組織中。免疫組織化學(xué)染色表明FASN 水平與乳腺腫瘤大小直接相關(guān)[23],且FASN在肺癌和前列腺癌中高表達(dá),是乳腺癌和前列腺癌的預(yù)后不良指標(biāo)[24-26]。FASN作為癌癥和代謝綜合征診療中的一個(gè)潛在靶標(biāo)已受到越來越多的關(guān)注[27-28]。Xiong 等[29]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ASN 在膀胱癌正常組織和腫瘤組織中表達(dá)存在差異,并且與生存相關(guān),可獨(dú)立預(yù)測(cè)MIBC 進(jìn)展,與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān),研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FASN 低表達(dá)的患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)往往更好。而Deng 等[30]研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以靶向Clusterin 進(jìn)而通過SREBP-1c/FASN 軸調(diào)控脂肪生成并抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。這些研究展現(xiàn)出FASN 作為促癌基因在膀胱癌這重要功能。本研究在前期數(shù)據(jù)分析中顯示,丹參可下游作用于FASN并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步揭示其調(diào)控關(guān)系,即丹參提取物可抑制FASN表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌惡性表型。

    本研究表明丹參提取物可抑制FASN 表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞系惡性表型,其有望作為一味中藥應(yīng)用于臨床上膀胱癌的預(yù)防或治療;本研究通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯矿w系結(jié)合大數(shù)據(jù)挖掘及實(shí)驗(yàn)技術(shù)等證明了丹參提取物在膀胱癌治療中的功能機(jī)制,同樣為后續(xù)藥物研發(fā)提供了新的研究策略。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    作者貢獻(xiàn)聲明 桂志明:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),起草文章,獲取研究經(jīng)費(fèi);黃?。悍治?解釋數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)分析;李世豪:實(shí)施研究;吳昊開:分析/解釋數(shù)據(jù);汪前亮:采集數(shù)據(jù),對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱,指導(dǎo)

    猜你喜歡
    膀胱癌丹參靶點(diǎn)
    丹參“收獲神器”效率高
    VI-RADS評(píng)分對(duì)膀胱癌精準(zhǔn)治療的價(jià)值
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點(diǎn)
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點(diǎn)
    Analysis of compatibility rules and mechanisms of traditional Chinese medicine for preventing and treating postoperative recurrence of bladder cancer
    丹參葉干燥過程中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:02:46
    丹參葉片在快速生長(zhǎng)期對(duì)短期UV-B輻射的敏感性
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:12
    膀胱癌患者手術(shù)后癥狀簇的聚類分析
    心力衰竭的分子重構(gòu)機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)
    miRNA-148a在膀胱癌組織中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析
    男女免费视频国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 久久久国产精品麻豆| 精品卡一卡二卡四卡免费| 777米奇影视久久| 性少妇av在线| 亚洲人成电影免费在线| 日韩有码中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 天天操日日干夜夜撸| videosex国产| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲人成77777在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 午夜福利免费观看在线| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品一区二区三卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 一区在线观看完整版| av网站在线播放免费| 亚洲色图综合在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产亚洲欧美精品永久| 757午夜福利合集在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 1024视频免费在线观看| 极品人妻少妇av视频| 看免费av毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 香蕉国产在线看| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日本中文国产一区发布| 日本一区二区免费在线视频| 9191精品国产免费久久| 免费黄频网站在线观看国产| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品久久电影中文字幕 | 色94色欧美一区二区| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品国产高清国产av | 国产高清videossex| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美午夜高清在线| 香蕉国产在线看| 国产成人av激情在线播放| 一级黄色大片毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| av福利片在线| 看片在线看免费视频| 黄色 视频免费看| 高清视频免费观看一区二区| 欧美乱妇无乱码| 久久影院123| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品免费一区二区三区在线 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 中文字幕制服av| 久热这里只有精品99| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲综合色网址| 国产激情久久老熟女| 9色porny在线观看| 国产激情欧美一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜福利乱码中文字幕| av有码第一页| 91成年电影在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费观看a级毛片全部| 欧美午夜高清在线| 热re99久久国产66热| 夜夜躁狠狠躁天天躁| netflix在线观看网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线观看www视频免费| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 村上凉子中文字幕在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久中文看片网| 久久国产精品大桥未久av| 51午夜福利影视在线观看| 制服诱惑二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 9热在线视频观看99| 99re在线观看精品视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲成a人片在线一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一二三四社区在线视频社区8| 久久九九热精品免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲男人天堂网一区| 欧美日韩视频精品一区| 美女福利国产在线| 国产不卡一卡二| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品免费大片| 欧美 日韩 精品 国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 宅男免费午夜| 人人妻人人澡人人看| 韩国av一区二区三区四区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 麻豆成人av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 后天国语完整版免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 在线免费观看的www视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品第一国产精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲九九香蕉| 伦理电影免费视频| 国产精品影院久久| 亚洲五月天丁香| 最新美女视频免费是黄的| 久久婷婷成人综合色麻豆| 女性生殖器流出的白浆| 欧美另类亚洲清纯唯美| 热re99久久精品国产66热6| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩有码中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 国产精品 国内视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美日韩黄片免| 日本黄色日本黄色录像| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看. | 成人影院久久| 亚洲全国av大片| 午夜福利在线免费观看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 淫妇啪啪啪对白视频| 免费在线观看影片大全网站| 极品教师在线免费播放| 成人影院久久| 91成人精品电影| 色精品久久人妻99蜜桃| 看免费av毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| av国产精品久久久久影院| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黄色a级毛片大全视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 男女之事视频高清在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 91字幕亚洲| 性色av乱码一区二区三区2| 高清av免费在线| av免费在线观看网站| 男女午夜视频在线观看| 久久精品成人免费网站| 9191精品国产免费久久| 深夜精品福利| 色婷婷av一区二区三区视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 精品国产国语对白av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 激情视频va一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲av成人av| 久久久久久久久久久久大奶| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国精品久久久久久国模美| 成人永久免费在线观看视频| 午夜视频精品福利| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丝袜美足系列| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲 国产 在线| 男女床上黄色一级片免费看| 色精品久久人妻99蜜桃| 色综合婷婷激情| 美女视频免费永久观看网站| 国产在线一区二区三区精| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产成人精品久久二区二区91| 一区在线观看完整版| 欧美国产精品一级二级三级| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩欧美国产一区二区入口| 人妻 亚洲 视频| 日本a在线网址| 国产区一区二久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 99国产极品粉嫩在线观看| av视频免费观看在线观看| 久久亚洲真实| 在线观看免费高清a一片| 久久久久久久国产电影| 日韩人妻精品一区2区三区| 一级毛片高清免费大全| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品影院久久| 一级作爱视频免费观看| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 超碰97精品在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 天天添夜夜摸| 免费在线观看日本一区| 国产主播在线观看一区二区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 一二三四在线观看免费中文在| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜福利视频在线观看免费| 久久99一区二区三区| 国产成人欧美在线观看 | 午夜老司机福利片| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品久久久精品久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区在线观看完整版| 色老头精品视频在线观看| www.999成人在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费黄频网站在线观看国产| 一进一出抽搐动态| 亚洲熟女毛片儿| 久久中文字幕一级| 亚洲精品久久午夜乱码| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 高清av免费在线| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲av成人一区二区三| 人妻一区二区av| 国产单亲对白刺激| 亚洲伊人色综图| 在线观看午夜福利视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 这个男人来自地球电影免费观看| 精品第一国产精品| 十八禁高潮呻吟视频| 男女下面插进去视频免费观看| 成人影院久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品 国内视频| 精品第一国产精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 搡老岳熟女国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | а√天堂www在线а√下载 | 搡老岳熟女国产| 一级片免费观看大全| 国产精品一区二区免费欧美| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 黄色片一级片一级黄色片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天影视国产精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成人特级黄色片久久久久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久99久视频精品免费| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热国产这里只有精品6| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av欧美777| 国产精品偷伦视频观看了| 伦理电影免费视频| 妹子高潮喷水视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 免费在线观看日本一区| 新久久久久国产一级毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜福利乱码中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久中文字幕人妻熟女| 在线观看舔阴道视频| 捣出白浆h1v1| 欧美精品av麻豆av| 国产欧美日韩一区二区三| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人国产一区最新在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 十八禁人妻一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲午夜理论影院| 国产三级黄色录像| 亚洲av片天天在线观看| 五月开心婷婷网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲男人天堂网一区| 伦理电影免费视频| 精品乱码久久久久久99久播| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av成人av| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热只有精品国产| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产看品久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜免费成人在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 超碰成人久久| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产精品久久久人人做人人爽| 视频在线观看一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 性色av乱码一区二区三区2| x7x7x7水蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 99精国产麻豆久久婷婷| www.精华液| 欧美日韩亚洲高清精品| 天堂中文最新版在线下载| 正在播放国产对白刺激| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费观看精品视频网站| 久热这里只有精品99| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产欧美网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲五月天丁香| 久久 成人 亚洲| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产av又大| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美日本中文国产一区发布| 国产高清videossex| 欧美在线黄色| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美一区二区三区久久| 91精品三级在线观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲全国av大片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品福利观看| 久久久国产精品麻豆| 黄色丝袜av网址大全| 美女午夜性视频免费| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲一码二码三码区别大吗| 色播在线永久视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 夜夜夜夜夜久久久久| 超碰成人久久| 女性生殖器流出的白浆| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产男靠女视频免费网站| 男人操女人黄网站| 欧美日韩精品网址| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲五月婷婷丁香| 下体分泌物呈黄色| 久久精品91无色码中文字幕| 精品国产亚洲在线| 男人操女人黄网站| www.自偷自拍.com| 国产97色在线日韩免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲综合色网址| avwww免费| 国产精品免费大片| 国产不卡av网站在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| xxxhd国产人妻xxx| 90打野战视频偷拍视频| 国产免费男女视频| 男女免费视频国产| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99久久人妻综合| 欧美黄色淫秽网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美大码av| 欧美日本中文国产一区发布| 男男h啪啪无遮挡| 99精国产麻豆久久婷婷| a级毛片黄视频| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美激情在线| 后天国语完整版免费观看| 悠悠久久av| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品在线观看二区| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 国产欧美日韩一区二区三| 最新美女视频免费是黄的| 人妻一区二区av| 男男h啪啪无遮挡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 97人妻天天添夜夜摸| 国产色视频综合| 韩国精品一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产高清videossex| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日本a在线网址| 国精品久久久久久国模美| 精品久久久久久久毛片微露脸| 老司机亚洲免费影院| 国产精品久久视频播放| 天堂俺去俺来也www色官网| 99香蕉大伊视频| 韩国精品一区二区三区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品免费一区二区三区在线 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 久99久视频精品免费| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品免费大片| 男女床上黄色一级片免费看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美在线一区亚洲| 欧美成人午夜精品| 日本一区二区免费在线视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产高清videossex| 欧美日本中文国产一区发布| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看十八禁软件| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本黄色视频三级网站网址 | avwww免费| 欧美久久黑人一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | tube8黄色片| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产成人精品无人区| 又紧又爽又黄一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 曰老女人黄片| 成人手机av| 亚洲精品在线观看二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 99在线人妻在线中文字幕 | 黄色视频,在线免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 午夜久久久在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩欧美在线二视频 | 亚洲成人手机| 人成视频在线观看免费观看| 午夜激情av网站| 电影成人av| 日日夜夜操网爽| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲avbb在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲avbb在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 曰老女人黄片| 亚洲久久久国产精品| 精品久久久久久久久久免费视频 | 老熟女久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲美女黄片视频| 国产97色在线日韩免费| 久久狼人影院| 伦理电影免费视频| 久热这里只有精品99| 国产精品 欧美亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线观看免费视频网站a站| 校园春色视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人三级做爰电影| 搡老岳熟女国产| 在线av久久热| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av天堂在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 老司机福利观看| 一区福利在线观看| av天堂久久9| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| av有码第一页| 色综合婷婷激情| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产1区2区3区精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕高清在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| tube8黄色片| 日本一区二区免费在线视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产91精品成人一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人三级做爰电影| 在线观看一区二区三区激情| 老司机午夜福利在线观看视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产麻豆69| 国产真人三级小视频在线观看| 校园春色视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 两个人看的免费小视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 看免费av毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产淫语在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 一a级毛片在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲男人天堂网一区| 正在播放国产对白刺激| 捣出白浆h1v1| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本黄色日本黄色录像| 高清欧美精品videossex| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成年人午夜在线观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99久久人妻综合| 国产精品久久电影中文字幕 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 999久久久国产精品视频| 久久草成人影院| 99热只有精品国产| 香蕉久久夜色| 午夜福利在线观看吧| 12—13女人毛片做爰片一|