單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示化療增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞亞精胺代謝激活腫瘤免疫

劉子菲，黃鵬翰，江詠雪，曾文鋒

乳腺癌發(fā)病率日益增加，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2020 年癌癥報(bào)告顯示，乳腺癌超越了肺癌成為世界上最普遍的惡性腫瘤，并位于癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的前5 位［1］。乳腺癌是全球包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。在中國(guó)，乳腺癌發(fā)病率約占中國(guó)女性惡性腫瘤總發(fā)病率的15%，而且發(fā)病率和死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)［2，3］。2020 年世界衛(wèi)生組織公布的我國(guó)癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是我國(guó)第四大女性癌癥死亡原因，僅次于肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌［3］。而且乳腺癌年輕化的問(wèn)題在我國(guó)尤為突出，在小于45 歲的中國(guó)女性人群中乳腺癌已經(jīng)成為首要的癌癥死亡原因［2］。目前乳腺癌的治療主要依靠外科手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療。其中新輔助化療是乳腺癌患者的重要根治性手段之一，研究其抑制腫瘤進(jìn)展的作用和機(jī)制有助于我們加深腫瘤化療的理解和臨床上合理地選擇化療藥物。近年來(lái)的研究表明，化療除了對(duì)腫瘤本身的殺傷作用外，還可能還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境代謝改變［4-6］及激活抗腫瘤免疫［7］。

研究表明，惡性腫瘤中多胺生物合成酶的表達(dá)增加，并且在癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)精胺和亞精胺蓄積?；熌艽龠M(jìn)癌細(xì)胞多胺代謝通路激活，但該癌細(xì)胞代謝通路對(duì)微環(huán)境的影響還未被闡明。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，精胺和亞精胺的富集與惡性腫瘤免疫抑制相關(guān)［8-10］，但隨著研究的深入，近年來(lái)有研究者發(fā)現(xiàn)多胺代謝的亢進(jìn)是引起自身免疫性疾病的原因之一，例如銀屑?。?1］。此外，補(bǔ)充亞精胺可以導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞線粒體活性增強(qiáng)［12］并增強(qiáng)抗腫瘤免疫，而且亞精胺可以作為疫苗的佐劑刺激免疫反應(yīng)［13］。除了適應(yīng)性免疫外，亞精胺對(duì)固有免疫細(xì)胞例如自然殺傷細(xì)胞的作用也被逐漸揭示［14］。亞精胺代謝促進(jìn)腫瘤免疫存在爭(zhēng)議，乳腺癌亞精胺代謝與腫瘤免疫之間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制尚不明確?；熥鳛槟[瘤多胺代謝通路的激活手段之一，其是否有參與調(diào)控乳腺癌亞精胺代謝從而影響腫瘤免疫也有待進(jìn)一步探討。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集

于GEO 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索新輔助化療乳腺癌單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)數(shù)據(jù)信息。經(jīng)檢索，符合的數(shù)據(jù)集為GSE189302［15］，該數(shù)據(jù)來(lái)源于自發(fā)成瘤鼠腫瘤單細(xì)胞測(cè)序。為擴(kuò)大分析范圍，我們收入了人乳腺癌單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE176078［16］進(jìn)行數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

1.2 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析

利用R 包Seurat［17，18］進(jìn)行單細(xì)胞數(shù)據(jù)預(yù)處理，兩個(gè)數(shù)據(jù)集的細(xì)胞注釋內(nèi)容都依據(jù)原文或在線數(shù)據(jù)提供的注釋文獻(xiàn)，并從測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出上皮細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步聚類(lèi)。利用R 包Harmony［17］對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去批次處理。

1.3 單細(xì)胞數(shù)據(jù)基因表達(dá)可視化

利用R 包Nebulosa［19］以及Seurat 中的VlnPlot、FeaturePlot 函數(shù)對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)中亞精胺代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行可視化處理。

1.4 單細(xì)胞樣本分組與差異基因分析

在單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，利用R 包Seurat 中的AddMouduleScore 函數(shù)將GOBP_SPERMIDINE_METABOLIC_PROCESS（https：//www.gseamsigdb.org/gsea/msigdb/human/geneset/GOBP_SPER -MIDINE_METABOLIC_PROCESS.html）數(shù)據(jù)集中的基因合并添加到GSE176078 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中，根據(jù)該數(shù)據(jù)的加權(quán)平均數(shù)將患者分為癌細(xì)胞亞精胺代謝高（high：CID45171；CID4530N；CID4535；CID4523；CID4066；CID3921；CID3948；CID44991；CID3941；CID4513）與亞精胺代謝低（low：CID4471；CID4290A；CID3963；CID4067；CID4465；CID44971；CID4515；CID4461；CID4495；CID4463）兩組。利用R 包Seurat 中的FindMarkers 函數(shù)分析癌細(xì)胞亞精胺代謝高低樣本中各類(lèi)淋巴細(xì)胞的差異表達(dá)基因。利用R包ggplot2（H.Wickham.ggplot2：Elegant Graphics for Data Analysis.Springer-Verlag New York，2016。）可視化差異表達(dá)基因并繪制火山圖。并運(yùn)用ggrepel 包顯示出P<0.05 且log2FC>0.5 的差異表達(dá)基因的基因名稱。

1.5 功能富集分析

利用R 包ClusterProfiler［20］以獲得差異基因在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）情況，α 設(shè)為0.05，P 值校正方法選擇Benjamini &Hochberg 法，即對(duì)每個(gè)P-value 做校正，轉(zhuǎn)換為qvalue。q=P*n/rank，其中rank 是指P-value 從小到大排序后的次序，獲得基因本體論（GO）分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R4.1.0軟件和Rggpubr包進(jìn)行分析。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 化療導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞亞群分布改變

為了探究化療是否能夠影響乳腺癌細(xì)胞的亞精胺代謝，對(duì)GSE189302 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。GSE189302 將MMTV-Wnt1 腫瘤細(xì)胞注射到野生型C57BL6/J 小鼠的乳房脂肪墊使其成瘤，待腫瘤體積達(dá)到~200 mm3，化療組每日腹腔注射多柔比星4 mg/kg 共5 天，對(duì)照組不做處理，末次給藥48 小時(shí)后分別獲取腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［15］。該數(shù)據(jù)集包括1 例化療組（GSM5698657）及1 例對(duì)照組（樣本GSM5698658）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，將兩者合并進(jìn)行UMAP 聚類(lèi)分析，得到包括癌細(xì)胞及免疫細(xì)胞的共10個(gè)細(xì)胞群，其中3群細(xì)胞根據(jù)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因注釋為癌細(xì)胞（圖1A）。提取癌細(xì)胞進(jìn)行再聚類(lèi)，獲得9 個(gè)細(xì)胞亞群（圖1B）。如圖1C、D 所示，化療組與對(duì)照組的癌細(xì)胞分布存在明顯差異，化療后癌細(xì)胞0、1、7 群減少，2-6 群增加，其中第2、5 群細(xì)胞呈現(xiàn)“從無(wú)到有”的顯著改變。

圖1 GSE189302 化療前后乳腺癌細(xì)胞聚類(lèi)分析 A：腫瘤組織所有細(xì)胞UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；B：癌細(xì)胞的UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；C：化療組及對(duì)照組癌細(xì)胞的UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；D：兩組癌細(xì)胞的亞群堆疊圖

2.2 化療誘導(dǎo)乳腺癌亞精胺代謝旺盛細(xì)胞亞群形成

為了進(jìn)一步探究化療前后癌細(xì)胞的改變，對(duì)化療組和對(duì)照組的基因表達(dá)做差異分析，從而獲得兩組差異基因，以差異倍數(shù)>0.5，校正P值<0.05作為篩選閾值。詳見(jiàn)圖2A 火山圖，其中化療組上調(diào)基因有342 個(gè)，下調(diào)基因有406 個(gè)。分析差異基因發(fā)現(xiàn)，亞精胺代謝重要限速酶鳥(niǎo)氨酸脫羧酶1（OCD1）［21］表達(dá)水平上調(diào)，繪制基因表達(dá)水平小提琴圖如圖2B 所示；亞精胺代謝的另一重要分子精胺氧化酶（SMOX）雖然未達(dá)到篩選閾值，但其基因表達(dá)水平在兩組之間仍存在顯著差異（圖2C），這些差異提示化療后癌細(xì)胞亞精胺代謝水平升高。為了探究此改變是否與前述癌細(xì)胞亞群分布變化有關(guān)，在癌細(xì)胞聚類(lèi)散點(diǎn)圖中分別顯示OCD1 及SMOX 基因表達(dá)水平，以及根據(jù)亞精胺代謝數(shù)據(jù)集對(duì)各樣本的癌細(xì)胞進(jìn)行綜合評(píng)分（圖2D~G），對(duì)照?qǐng)D1 中細(xì)胞亞群的位置，可以看到第5 群癌細(xì)胞具有OCD1、SMOX 高表達(dá)，并且亞精胺代謝水平顯著升高。以上數(shù)據(jù)表明多柔比星化療誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中亞精胺代謝旺盛亞群形成。

2.3 乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞亞精胺代謝水平存在差異

為了探究人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞亞精胺代謝情況，對(duì)GSE176078 數(shù)據(jù)集進(jìn)行相關(guān)分析。該數(shù)據(jù)集包含26 例未經(jīng)化療的原發(fā)性乳腺癌組織的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，包括11 例ER 陽(yáng)性、5 例HER2 陽(yáng)性以及10例三陰型乳腺癌，并提供細(xì)胞注釋信息［16］。我們將其中6 例未注釋癌細(xì)胞群的樣本予以剔除，其余20 例樣本的癌細(xì)胞UMAP 聚類(lèi)結(jié)果如圖3A、B所示。根據(jù)亞精胺代謝數(shù)據(jù)集對(duì)各樣本的癌細(xì)胞進(jìn)行綜合評(píng)分，箱式圖3D 顯示各樣本癌細(xì)胞亞精胺代謝水平存在差異。進(jìn)而以評(píng)分中位值作為cut-off 值，將樣本分為亞精胺代謝high、亞精胺代謝low 兩組（圖3C、E）。20 例樣本的臨床特征及分組信息如表1、表2 所示。

表2 GSE176078 亞精胺代謝high、low 兩組的臨床特征

圖3 GSE176078 乳腺癌細(xì)胞亞精胺代謝水平 A：各樣本癌細(xì)胞的UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；B：各分子亞型癌細(xì)胞的UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；C：亞精胺代謝high、low 兩組癌細(xì)胞的UMAP 聚類(lèi)散點(diǎn)圖；D：各樣本亞精胺代謝水平；E：兩組的亞精胺代謝水平

2.4 乳腺癌亞精胺代謝與腫瘤浸潤(rùn)T 細(xì)胞的關(guān)系

近期有研究報(bào)道，亞精胺能夠通過(guò)增加脂肪氧化磷酸化增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的線粒體活性和細(xì)胞毒性功能［12］。我們猜測(cè)癌細(xì)胞代謝產(chǎn)生的亞精胺能夠作用于腫瘤浸潤(rùn)T 細(xì)胞，影響抗腫瘤免疫。為了驗(yàn)證假說(shuō)，根據(jù)GSE176078 所提供的細(xì)胞注釋信息，分析亞精胺代謝high、low 兩組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況（表3）。如圖4A、B，亞精胺代謝high的腫瘤具有相近T 細(xì)胞浸潤(rùn)比例，并且T 細(xì)胞各亞群的比例差異不大。GSE176078數(shù)據(jù)集的原作者根據(jù)基因表達(dá)特點(diǎn)對(duì)CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了再聚類(lèi)，并將其注釋為具有不同功能特點(diǎn)的4 個(gè)CD4亞群和5個(gè)CD8亞群［16］。比較發(fā)現(xiàn)亞精胺代謝high、low 兩組之間亞群分布存在差異（圖4C、D）。尤其值得注意的是，在亞精胺代謝high 的腫瘤中，高表達(dá)T 細(xì)胞激活及效應(yīng)相關(guān)基因ZFP36［22］的CD8+亞群（c4）明顯增多，以抑制性免疫檢查點(diǎn)LAG3為特點(diǎn)的CD8+亞群（c8）、以衰老標(biāo)志物GZMK［23］為特點(diǎn)的CD8+亞群（c5）明顯減少（圖4C），提示乳腺癌細(xì)胞亞精胺代謝水平對(duì)CD8+T 細(xì)胞的基因表達(dá)和功能存在影響。

表3 GSE176078 亞精胺代謝high、low 兩組的免疫浸潤(rùn)情況

圖4 GSE176078 亞精胺代謝high、low 兩組的免疫浸潤(rùn)情況 A：兩組腫瘤組織細(xì)胞分類(lèi)堆疊圖；B：T 細(xì)胞亞群堆疊圖；C：CD8+T 細(xì)胞亞群堆疊圖；D：CD4+T 細(xì)胞亞群堆疊圖

2.5 乳腺癌亞精胺代謝對(duì)CD8+T 細(xì)胞功能的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)CD8+T 細(xì)胞做進(jìn)一步分析。首先對(duì)亞精胺代謝high、low 兩組CD8+T 細(xì)胞的基因表達(dá)做差異分析，從而獲得兩組差異基因，以差異倍數(shù)>0.5，校正P值<0.05作為篩選閾值。如圖5A 火山圖所示，亞精胺代謝high 組有58 個(gè)基因上調(diào)，59 個(gè)基因下調(diào)，我們將上調(diào)基因予以標(biāo)注，其中包括與T 細(xì)胞激活或效應(yīng)功能相關(guān)的基因CD69、DUSP1、FOS、CXCR4［22］，基因表達(dá)水平如圖5C-F 所示。LAG3、PDCD1 是重要的免疫檢查點(diǎn)，能夠抑制免疫微環(huán)境［12，24］，其在亞精胺代謝high 的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T 細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低（圖5G、H）。上述基因表達(dá)差異提示癌細(xì)胞的亞精胺代謝水平與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T 細(xì)胞的激活和功能呈正相關(guān)。利用基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)富集亞精胺代謝high 組上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)與抗原處理與呈遞（antigen process and presentation）、抗原受體介導(dǎo)的信號(hào)通路（antigen receptor-mediated signaling pathway）、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell recepter signaling pathway）、IFN-γ 介導(dǎo)的信號(hào)通路（interferon-gamma-mediated signaling pathway）等適應(yīng)性免疫功能相關(guān)通路有關(guān)，進(jìn)一步證明癌細(xì)胞的亞精胺代謝增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T 細(xì)胞功能的作用。

圖5 GSE176078 亞精胺代謝high、low 兩組CD8+T 細(xì)胞的基因表達(dá)情況 A：差異基因火山圖；B：基因本體（GO）富集分析；C~H：相關(guān)基因表達(dá)水平差異

3 討 論

乳腺癌已經(jīng)成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。新輔助化療為乳腺癌患者的治療帶來(lái)了更多的選擇和提高了患者預(yù)后。該術(shù)前化療手段的臨床獲益也引發(fā)了研究人員思考除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，化療是否能重塑腫瘤微環(huán)境以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。一直以來(lái)多胺，包括腐胺、精胺、亞精胺都被認(rèn)為與免疫抑制形成相關(guān)［21］。但近幾年，多胺對(duì)免疫更復(fù)雜的作用逐漸被揭示。例如對(duì)于抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用的CD8+T 細(xì)胞，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Tasuku Honjo 團(tuán)隊(duì)［12］發(fā)現(xiàn)在衰老的小鼠體內(nèi)補(bǔ)充亞精胺增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的代謝能力產(chǎn)生更多ATP，外源補(bǔ)充亞精胺能實(shí)現(xiàn)抑制免疫細(xì)胞衰老并促進(jìn)抗腫瘤免疫。然而Hibino 等［9］人的研究顯示，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性亞精胺能夠通過(guò)抑制TCR 聚集從而阻止其下游信號(hào)傳導(dǎo)，多胺合成抑制劑能夠增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的功能。上述多胺對(duì)CD8+T 細(xì)胞功能影響的矛盾揭示了多胺代謝通過(guò)多種機(jī)制從不同方向上影響抗腫瘤免疫的復(fù)雜性，無(wú)論是外源補(bǔ)充多胺或是體內(nèi)多胺代謝對(duì)于抗腫瘤免疫的調(diào)控都需要更多探索。而我們的研究揭示了，亞精胺代謝的激活與乳腺癌腫瘤免疫激活存在正相關(guān)，豐富了我們對(duì)多胺代謝與腫瘤免疫的理解。

既往分析腫瘤代謝與免疫微環(huán)境的串?dāng)_，因技術(shù)的局限只能從整個(gè)腫物中提取核酸或代謝物進(jìn)行檢測(cè)，隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的普及，我們可以分析癌細(xì)胞代謝通路變化對(duì)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)化療可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的多胺代謝，并且與腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞激活相關(guān)。我們猜想化療誘導(dǎo)腫瘤死亡的過(guò)程中，可能引起了癌細(xì)胞多胺代謝增強(qiáng)并釋放到環(huán)境引起淋巴細(xì)胞激活。本研究為開(kāi)展后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)提供生物信息學(xué)依據(jù)。受限于標(biāo)本數(shù)量和腫瘤類(lèi)型，我們的發(fā)現(xiàn)尚未做到多癌種分析。后續(xù)的研究我們將收集更多的人乳腺癌及其他癌種化療前后的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步開(kāi)展功能實(shí)驗(yàn)?？傊?，本研究證明了化療能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞亞精胺代謝增強(qiáng)，同時(shí)癌細(xì)胞亞精胺代謝強(qiáng)與效應(yīng)性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌新輔助治療引起的癌細(xì)胞免疫原性死亡原理提供了理論支持。