彗星電泳檢測(cè)草胺磷對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷

張來(lái)軍，陳永敢，王鳳琴

（1. 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院/海南省兩棲爬行動(dòng)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022；2. 隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000）

【研究意義】草胺磷（glufosinate ammonium，GA）屬膦酸類除草劑，是谷氨酰胺合成抑制劑，具有殺草譜廣、低毒、活性高、部分傳導(dǎo)性和環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，常用于果園、葡萄園、非耕地防除雙子葉及禾本科雜草。在大田里，草胺磷降解迅速，半衰期為2.30～2.93 d，衍生物為3-甲基膦-丙酸（MPP）和2-甲基膦-乙酸（MPA）［1］，這一過(guò)程與溫度密切相關(guān)。草胺磷的轉(zhuǎn)基因作物有馬鈴薯［2］、水稻［3］、棉花［4］、小麥［5］、煙草［6］等，使草胺磷擁有巨大的潛在商業(yè)市場(chǎng)。但除草劑的廣泛使用對(duì)土壤及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)影響深遠(yuǎn)，科學(xué)合理使用草胺磷，需要從整個(gè)環(huán)境全面考慮，評(píng)估其在生態(tài)環(huán)境中的安全性。

【前人研究進(jìn)展】據(jù)研究報(bào)道，施用草胺磷的麥田土壤微生物中，細(xì)菌和放線菌數(shù)量隨著草胺磷濃度的增加呈先增加后減少趨勢(shì)［7］。在高溫高濕的熱帶，草胺磷對(duì)土壤細(xì)菌和放線菌種群的生長(zhǎng)表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)、高濃度抑制；對(duì)土壤真菌種群的生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用［8］。葡萄園用草胺磷除草劑比機(jī)械除草平均減少了53%的葡萄根菌根化，但是土壤中蚯蚓或凋落物分解不受除草劑影響［9］。小鼠在出生前后暴露于低劑量草胺磷可誘發(fā)自閉癥樣表型［10］，小鼠圍產(chǎn)期暴露于草胺磷會(huì)通過(guò)破壞細(xì)胞骨架而影響神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)母細(xì)胞遷移［11］。王彥華等［12］研究了22種常用除草劑對(duì)蚯蚓的急性毒性，其中草胺磷染毒24 h的LC50值大于1 258 μg/cm2，將其歸入微毒級(jí)。關(guān)于草胺磷對(duì)環(huán)境中動(dòng)物的影響研究報(bào)道并不多。

【本研究切入點(diǎn)】蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最重要的一類無(wú)脊椎動(dòng)物，是土壤生態(tài)毒理學(xué)最常用的實(shí)驗(yàn)材料，用于重金屬污染［14］、油類污染［15］及農(nóng)藥污染［16］等生態(tài)毒理學(xué)相關(guān)研究，以及污泥處理、土壤重金屬積累［17］等生物修復(fù)探索。然而草胺磷在亞急性毒性下對(duì)蚯蚓的細(xì)胞毒性研究還未見(jiàn)報(bào)道。單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis, SCGE）又名彗星電泳，可用于檢測(cè)各種理化因子作用于細(xì)胞后引起的DNA鏈斷裂，并在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上評(píng)估損傷程度［13］，是一種快速、靈敏、可靠的定量DNA損傷及修復(fù)的方法，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、毒理學(xué)和環(huán)境生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用彗星電泳技術(shù)，研究不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓24 h和96 h后，蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度，揭示草胺磷對(duì)土壤動(dòng)物蚯蚓的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia fetida）購(gòu)自河北石家莊晉州市蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)。在室內(nèi)預(yù)養(yǎng)約2～4周，挑選體重為400～500 mg、大小較一致的健康蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

供試草胺磷乳液（濃度200 g/L），由山東潤(rùn)揚(yáng)化學(xué)有限公司生產(chǎn)；正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA，西班牙）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMA）、Triton X-100、肌氨酸鈉、DMSO，上述試劑均為Amresco分裝產(chǎn)品；自制蚯蚓體腔細(xì)胞提取液（EM，含5%乙醇、95%生理鹽水、2.5 mg/mL Na2EDTA、10 mg/mL 愈瘡木酚甘油醚，pH7.3）、裂解液（ 含2.5 mol/L NaCl、0.1 mol/L EDTA、0.01 mol/LTris、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100、10%DMSO，pH 10）、電泳緩沖液（ 含0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA，pH＞13）。試驗(yàn)儀器有倒置熒光顯微鏡（DMI 3000，德國(guó)Leica 公司）、電泳儀（Tanon EPS 300，上海天能科技有限公司）、電泳槽（DYCP-33A，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)后，設(shè)置脅迫24 h和96 h的草胺磷濃度梯度分別為0、37.5、75、150、300 mg/L 和 0、18.75、37.5、75 mg/L，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)。

將蚯蚓在25℃、濕度65%、暗環(huán)境下清腸24 h。用去離子水將供試農(nóng)藥按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度稀釋，同時(shí)用去離子水作為空白對(duì)照。分別將不同濃度的草胺磷加入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中。將清腸后的蚯蚓洗凈，用濾紙吸干水分。在每一個(gè)濃度梯度中放入5條蚯蚓，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，用封口膜封口，留1 cm長(zhǎng)的縫隙做通氣孔。將培養(yǎng)皿置于室溫25℃、濕度65%的環(huán)境中黑暗培養(yǎng)。脅迫時(shí)間為96 h的蚯蚓需要每天重新更換相同濃度的草胺磷溶液，以消除蚯蚓自身代謝產(chǎn)物的影響。分別于脅迫24 h和96 h后，提取蚯蚓體腔細(xì)胞，用于彗星電泳。

1.2.2 蚯蚓體腔細(xì)胞的提取 根據(jù)Eyambe等［18］的方法稍改動(dòng)后提取蚯蚓體腔細(xì)胞。脅迫結(jié)束后，將不同濃度草胺磷處理的蚯蚓隨機(jī)選取2條，剪取其身體中后部約2 cm長(zhǎng)的軀干，移入2 mL離心管中，加入400 μL 4℃的體腔細(xì)胞提取液；1 min后，再加入1.5 mL 4℃磷酸鹽緩沖液（PBS），棄沙蠶，得到體腔細(xì)胞。于800～1 000 r/min下離心3 min，棄上清，兩管合為一管，重新加入1 mL PBS。顯微鏡下觀察細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞密度，準(zhǔn)備電泳。

1.2.3 彗星電泳 按Zhang等［19］改良方法進(jìn)行彗星電泳。將細(xì)胞懸液和1%低熔點(diǎn)膠按1∶1體積混合均勻，鋪在預(yù)處理后的載玻片上，4℃放置5 min，使瓊脂糖凝固。將鋪好膠的載玻片放入新鮮配制的裂解液中裂解90 min。蒸餾水沖洗后，將載玻片放入電泳緩沖液中，變性解旋20 min，電泳20 min（26 V，300 mA）。用400 mmol/L Tris緩沖液（pH 7.5）中和3次，每次中和5 min，從裂解到中和的所有過(guò)程需在4℃下進(jìn)行。將載玻片置于20 μg/mL EB中染色20 min后，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

從每個(gè)濃度草胺磷處理隨機(jī)取大約50個(gè)細(xì)胞，用CASP軟件進(jìn)行分析，可得到多項(xiàng)反應(yīng)DNA損傷程度的參數(shù)。本試驗(yàn)選用頭部DNA含量（HDNA%）、尾部DNA含量（TDNA%）、尾長(zhǎng)（TailLength，TL）、尾矩（TailMoment，TM）和Olive尾矩（Olive TailMoment，OTM）5個(gè)最常用的參數(shù)作為DNA損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用Spss13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比較，對(duì)各濃度處理與對(duì)照之間進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性以3個(gè)水平表示，分別為P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 草胺磷脅迫24 h對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的影響

由表1可知，與空白對(duì)照比較，37.5、75、150、300 mg/L草胺磷脅迫處理24 h蚯蚓的TDNA%、HDNA%、TL、TM和OTM值都有顯著差異（P＜0.05），其中TDNA%、TL、TM、OTM隨草胺磷濃度升高而提高，HDNA%隨草胺磷濃度升高而降低，且草胺磷濃度越高，差異越顯著。兩個(gè)低濃度（37.5、75 mg/L）處理間各參數(shù)值變化未達(dá)到顯著水平，但與高濃度（150、300 mg/L）處理相比，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。草胺磷質(zhì)量濃度最高達(dá)300 mg/L時(shí)，與空白對(duì)照比較，TDNA%提高了2.8倍（P＜0.001）、TL提高了2.2倍（P＜0.01）、TM提高了5倍（P＜0.001）、OTM提高了3.6倍（P＜0.001）、HDNA%則降低了1.48倍（P＜0.001）。因此，在24 h的短期脅迫下，草胺磷使蚯蚓體腔細(xì)胞DNA產(chǎn)生了明顯的損傷，草胺磷濃度越高，損傷越嚴(yán)重；草胺磷濃度與蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度彼此間呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1 不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓24 h后彗星電泳各項(xiàng)參數(shù)比較Table 1 Comet assay results of earthworms under different concentrations of glufosinate stress for 24 h

2.2 草胺磷脅迫96 h對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的影響

降低草胺磷脅迫濃度，延長(zhǎng)脅迫時(shí)間至96 h后，提取蚯蚓體腔細(xì)胞進(jìn)行彗星電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表2可知，與空白對(duì)照比較，18.75、37.5、75 mg/L草胺磷脅迫處理96 h蚯蚓的TDNA%、TL、TM和OTM值隨草胺磷濃度升高而提高（P＜0.05），HDNA%值隨草胺磷濃度升高而降低（P＜0.05）；草胺磷濃度越高，差異越顯著。最低草胺磷濃度（18.75 mg/L）脅迫下，TDNA%、TL、TM和OTM分別為空白對(duì)照的1.48、1.17、1.66、1.4倍，HDNA%降低1.22倍（P＜0.05）。因此，草胺磷脅迫96 h對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA產(chǎn)生了明顯損傷，濃度越高，損傷越嚴(yán)重；草胺磷濃度與蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 不同濃度草胺磷脅迫蚯蚓96 h后彗星電泳各項(xiàng)參數(shù)比較Table 2 Comet assay results of earthworms under different concentrations of glufosinate stress for 96 h

37.5、75 mg/L草胺磷脅迫蚯蚓24 h時(shí)，兩組彗星電泳參數(shù)值變化并不顯著；延長(zhǎng)脅迫時(shí)間至96 h后，兩個(gè)處理間各項(xiàng)參數(shù)值差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），反映了草胺磷濃度越高，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)蚯蚓的傷害越嚴(yán)重。

3 討論

2016年草胺磷成為全球第二大除草劑，銷(xiāo)售額達(dá)到6.6億美元；同時(shí)歐盟對(duì)活性物質(zhì)草胺磷再評(píng)審也將不再批準(zhǔn)，主要原因是不能排除草胺磷對(duì)哺乳動(dòng)物潛在的危害風(fēng)險(xiǎn)，也不能排除對(duì)非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物的影響［20］。除草劑濫用或長(zhǎng)期以抗除草劑作物為主的廣譜除草劑農(nóng)業(yè)管理，不僅減少植物的多樣性和豐富性，影響了節(jié)肢動(dòng)物和其他農(nóng)田動(dòng)物［20］，甚至使一些持效期長(zhǎng)、殘留久的除草劑在土壤中富積量越來(lái)越高，對(duì)后茬作物造成毀滅性的損失［21-22］。草甘膦在過(guò)去20年曾廣泛使用，抗除草劑作物連續(xù)多年持續(xù)輪作，使得全世界出現(xiàn)了至少34種抗草甘膦雜草［20］。工業(yè)上仍然在開(kāi)發(fā)帶有抗除草劑基因的轉(zhuǎn)基因作物。研究發(fā)現(xiàn)，一味增加農(nóng)藥使用強(qiáng)度并不能有效抑制農(nóng)作物病蟲(chóng)害的發(fā)生，反而是作物多樣性的增加可減少農(nóng)作物病蟲(chóng)害的發(fā)生面積，因?yàn)樽魑锒鄻有员Ｕ狭松鷳B(tài)系統(tǒng)的自動(dòng)調(diào)節(jié)能力［23］。因此，除草劑的使用推廣需要對(duì)整個(gè)環(huán)境作全面考慮，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度評(píng)估其在生態(tài)環(huán)境中的安全性。

本試驗(yàn)在室溫、避光、溫濕度恒定的條件下采用彗星電泳技術(shù)反映草胺磷對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草胺磷引起蚯蚓體腔細(xì)胞的損傷，在一定范圍內(nèi)，草胺磷濃度越高，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，損傷越嚴(yán)重。蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷與草胺磷濃度間呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果對(duì)草胺磷的安全使用和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有一定的指導(dǎo)意義。但由于草胺磷在大田或果園實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，溫度、濕度和光照以及土壤微生物等的作用，與在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的應(yīng)用效果差距很大，因此草胺磷對(duì)所施用的環(huán)境中蚯蚓及其他動(dòng)物的實(shí)際毒性影響還需要進(jìn)行廣泛的研究和探索。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，草胺磷對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞產(chǎn)生損傷，草胺磷濃度越高，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，損傷越嚴(yán)重。此外，彗星電泳對(duì)反映草胺磷濃度與蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷程度兩者關(guān)系靈敏快捷，是揭示彼此之間相互關(guān)系的有效實(shí)驗(yàn)手段。