卵形鯧鲹JAK3蛋白的原核表達(dá)與純化

楊 萌，高爽爽，謝業(yè)揚(yáng)，段家文，陸專靈，韋友傳

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

【研究意義】Janus激酶（Janus kinase，JAK）為一類與膜受體相關(guān)、存在于胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶，是JAK-STAT（Signal transducers and activators of transcription，STAT）信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分。當(dāng)細(xì)胞因子（如IL-2、IL-4和IL-7等）結(jié)合相應(yīng)受體后，JAK負(fù)責(zé)將細(xì)胞因子受體、自身和STAT磷酸化，磷酸化的STAT轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化、發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫反應(yīng)等多種生命活動(dòng)過程［1-3］。在哺乳動(dòng)物中，JAK家族有4個(gè)蛋白成員，分別為JAK1、JAK2、JAK3和TYK2（Tyrosine kinase 2）。其中，JAK3分布于哺乳動(dòng)物的骨髓和淋巴系統(tǒng)，可以磷酸化STAT1、STAT3和STAT5，將細(xì)胞因子信號(hào)傳遞并激活下游通路［1,4］。卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）是華南沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和產(chǎn)量上升，養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，給卵形鯧鲹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來，以疫苗接種作為主要方式的免疫防治被認(rèn)為是防制魚類病害的安全有效途徑。因此有必要開展卵形鯧鲹的基礎(chǔ)免疫學(xué)研究。本研究以免疫通路中重要效應(yīng)分子JAK3為研究對(duì)象，開展卵形鯧鲹JAK3（TroJAK3）蛋白表達(dá)與純化，為了解TroJAK3蛋白結(jié)構(gòu)、相互作用及抗體制備提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】哺乳動(dòng)物JAK3可以介導(dǎo)IL-2、IL-7和IL-15信號(hào)傳導(dǎo)，參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化、調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝?。?-9］；JAK3可以減少巨噬細(xì)胞入侵的數(shù)量，從而減弱腎間質(zhì)纖維化，與腎小管上皮細(xì)胞的分化有關(guān)［10］。此外，JAK3基因突變是人類常染色體隱性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征的病因，與患者的復(fù)發(fā)白血病也有緊密聯(lián)系［11-12］。目前，魚類JAK3的研究非常有限，僅在鯉魚（Cyprinus carpio）［13］、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［14］、復(fù)鰕虎魚（Synechogobius hasta）［1］、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［15］和 鱖 魚（Siniperca chuatsi）［16］等少數(shù)魚類中有JAK3基因序列及其mRNA表達(dá)分析的相關(guān)報(bào)道，而有關(guān)魚類JAK3蛋白功能未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)魚類JAK3蛋白的相互作用、蛋白表達(dá)及抗體制備等蛋白水平研究匱乏，市面上缺乏魚類JAK3蛋白的商品化抗體，而海水養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)魚類卵形鯧鲹的JAK3基因序列和蛋白的研究未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-TroJAK3，表達(dá)與純化獲得重組蛋白，為研究TroJAK3蛋白的功能和抗體制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

含有TroJAK3基因的pMD18-T-TroJAK3質(zhì)粒、pET-32a載體、E.ColiTOP10和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。T4 DNA連接酶、DNATaq酶、限制性內(nèi)切酶（HindⅢ和XhoⅠ）和預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、脫脂奶粉和West Pico ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠制備試劑、Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗His單克隆抗體和辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自ImmunoWay（美國(guó)）生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1TroJAK3基因擴(kuò)增與原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)TroJAK3基因序列（GenBank：M N 7 8 2 0 0 2）設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)引物J A K 3 F:CCAAGCTTACATGGATCTCAGTGAGGAG（HindⅢ）和JAK3 R：CCCTCGAGTGCCTTTAGGGTTCTCTCT（XhoⅠ），以pMD18-T-TroJAK3質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 210 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段純化，用HindⅢ、XhoⅠ對(duì)pET-32a和目的片段進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.ColiTOP10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單個(gè)菌落進(jìn)行檢測(cè)，引物選用通用引物（T7：TAATACGACTCACTATAGGG和T7 teminal：GCTAGTTATTGCTCAGCGG），PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃210 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。挑選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提重組質(zhì)粒，命名為pET-32a-TroJAK3，應(yīng)用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。鑒定成功后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 TroJAK3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析 重組質(zhì)粒（pET-32a-TroJAK3）轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆接種至含氨芐（100 μg/mL）抗性的5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的菌液按照1∶100接種于含氨芐的20 mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6時(shí)（約3 h），取出1 mL作對(duì)照樣品，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h。取誘導(dǎo)后菌液1 mL，9 000 g離心3 min去上清，收集菌體作為樣品。其余菌液9 000 g離心3 min去上清，收集菌體后加入PBS重懸，冰上進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)情況。

1.2.3 誘導(dǎo)TroJAK3重組蛋白純化 將pET-32a-TroJAK3轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日按照1∶100接種于含氨芐的300 mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6時(shí)（約3 h），加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，4℃ 9 000 g離心3 min收集菌體。按照0.1 g/mL的比例加入pH為8.0細(xì)菌裂解液（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L PMSF、1 mg/mL溶菌酶和5 mmol/L EDTA），懸浮菌體，冰浴30 min使其充分混勻后，在冰上進(jìn)行超聲破碎使細(xì)菌裂解。4℃ 9 000 g離心10 min后棄去上清，應(yīng)用洗滌液A（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、2%Tween-20和 2 mol/L 尿素）洗滌去除少量脂類、核酸和其他雜蛋白等，渦旋震蕩，4℃ 9 000 g離心10 min，棄去上清；應(yīng)用洗滌液B（50 mmol/L Tris HCl和 500 mmol/L NaCl）洗滌，去除樣品中的EDTA，4℃ 9 000 g離心10 min，棄去上清；加入結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇和8mol/L尿素）應(yīng)用磁力攪拌器4℃溶解包涵體8 h。將上述樣品4℃ 9 000 g離心10 min，將上清流經(jīng)Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂柱，收集流出液體，并用2 mL結(jié)合緩沖液沖洗。用50、100、150、200 mmol/L咪唑洗脫液各4 mL依次洗脫，分別收集流出液體，通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)分析。

1.2.4 TroJAK3重組蛋白Western blot鑒定 將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)至NC膜，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗His標(biāo)簽的單克隆抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜。次日，將樣品TBST室溫下洗膜3次（10 min/次），加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶5000）室溫孵育1 h后，再次用TBST洗膜3次（10 min/次），應(yīng)用ECL超敏發(fā)光液顯影并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以PCR擴(kuò)增TroJAK3，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得3 300 bp的目的條帶，條帶與預(yù)期條帶相符。目的條帶與空載體雙酶切（HindⅢ和XhoⅠ）后，得到3 300 bp和5 800 bp條帶（圖1），經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取。測(cè)序結(jié)果顯示插入的TroJAK3基因表達(dá)框無移碼或突變，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction Identification of prokaryotic expression plasmid

2.2 融合蛋白表達(dá)與可溶性分析

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒（pET-32a-TroJAK3）轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆37℃振蕩培養(yǎng)，加入IPTG使目的蛋白表達(dá)。經(jīng)SDSPAGE后，未加入IPTG蛋白有少量表達(dá)，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白高表達(dá)，與未誘導(dǎo)的重組蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)在140 ku處有明顯的條帶，與預(yù)期目的蛋白的條帶相符。誘導(dǎo)后經(jīng)超聲破碎，將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，目的蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)（圖2）。

圖2 TroJAK3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析Fig. 2 Induction expression and dissolubility of TroJAK3 recombinant protein

2.3 目的蛋白純化

目的蛋白在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)后，利用Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂進(jìn)行過柱，并用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，將收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，用150 mmol/L咪唑洗脫緩沖液能去掉大量雜蛋白（圖3）。

圖3 TroJAK3重組蛋白的純化Fig. 3 Purification of TroJAK3 recombinant protein

2.4 Western blot鑒定重組蛋白

純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至NC膜，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，140 ku處有明顯的條帶，與重組蛋白的大小一致，證明重組蛋白成功表達(dá)。

圖4 TroJAK3重組蛋白Western blot鑒定Fig. 4 Western blot identification of TroJAK3 recombinant protein

3 討論

JAK3是JAK家族重要成員，可將細(xì)胞因子信號(hào)從外部環(huán)境轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，且在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［1］。免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子表面受體因缺乏酪氨酸蛋白激酶活性而聚集，導(dǎo)致細(xì)胞不被識(shí)別，對(duì)細(xì)胞發(fā)育及功能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。魚類JAK3的研究主要集中在基因序列和正常組織的表達(dá)分析。研究表明，鯉魚［13］、黃顙魚［14］、復(fù)鰕虎魚［1］和鱖魚［16］的JAK3基因cDNA全長(zhǎng)分別為3 739、3 817、3 524、4 634 bp，推定編碼的氨基酸數(shù)目分別為1 126、1 095、1 103、1 112。正常組織分布分析顯示，鯉魚、黃顙魚、復(fù)鰕虎魚和鱖魚JAK3 mRNA分別在頭腎、中腎、脾臟和腮中表達(dá)量最高，但并不一致。這種差異可能與品種、年齡、生理及遺傳因素有關(guān)。魚類JAK3分子表達(dá)已有所報(bào)道，但有關(guān)魚類JAK3蛋白功能與抗體制備的研究鮮有報(bào)導(dǎo)，因此對(duì)TroJAK3蛋白進(jìn)行純化，可為了解TroJAK3蛋白功能及抗體制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.1 原核表達(dá)載體的選擇

重組蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，原因是其背景清晰、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜和操作方便。表達(dá)菌株通常采用BL21，可以減少目的蛋白在胞內(nèi)環(huán)境表達(dá)的限制，從而使目的蛋白大量表達(dá)［19-20］。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的3種載體為pGE、pQE和pET系列表達(dá)載體，其中最高效的表達(dá)載體為pET系列［21-22］。研究表明，pET系列載體可以在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)，并具有產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物易純化等較多優(yōu)點(diǎn)［21,23-24］。本研究選擇pET-32a表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒pET-32a-JAK3轉(zhuǎn)化至BL21菌株，使目的重組蛋白高效表達(dá)，也說明了pET-32a為效率較高的表達(dá)載體。

3.2 目的蛋白的存在形式

重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功后對(duì)樣品進(jìn)行超聲等處理，高速離心后收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。與上清樣品比較，沉淀樣品在140 ku有明顯條帶，表明重組蛋白表達(dá)形式為包涵體。包涵體是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)沉積，重組蛋白大量產(chǎn)生時(shí)會(huì)形成包涵體，其可以通過簡(jiǎn)單的物理方式和增溶的方式將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘男问椒蛛x出來［25］。研究顯示，包涵體蛋白表達(dá)具有高表達(dá)量和高純度等優(yōu)點(diǎn)，在商業(yè)化生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用［26-28］。本研究TroJAK3重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，并獲得了較純的重組蛋白。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建pET-32a-TroJAK3原核表達(dá)載體，應(yīng)用終濃度為1 mmol/L IPTG 于37℃誘導(dǎo)4 h，TroJAK3重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，分子量約為140 ku。通過擴(kuò)大培養(yǎng)重組菌、菌體破碎、洗滌包涵體、溶解包涵體、流經(jīng)Ni-IDA樹脂柱、梯度濃度咪唑洗脫等步驟，最終純化得到較高純度的TroJAK3重組蛋白。