達(dá)烏里胡枝子根瘤菌的促生作用及高效根瘤菌的鑒定

摘要：本研究選擇達(dá)烏里胡枝子（Lespedeza daurica）根瘤分離且結(jié)瘤效果較好的7株根瘤菌（TG64，TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115），通過測定達(dá)烏里胡枝子生長表型和主要營養(yǎng)成分，結(jié)合結(jié)瘤和光合特性初步分析促生的生理生化機(jī)制，研究不同根瘤菌的促生作用；通過分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定高效根瘤菌。結(jié)果表明：除TG64，其余菌株顯著提高了株高、根長、生物量和蛋白質(zhì)含量，改善了根系構(gòu)建，TG101促生最明顯。所有處理單株結(jié)瘤5～33個，根瘤干重2.55～35.87 mg；TG98，TG100，TG101和TG115顯著提高了葉綠素含量、光合和氮吸收能力，是促生的主要生理生化機(jī)制。經(jīng)鑒定，TG101為格木慢生根瘤菌（Bradyrhizobium erythrophlei）。綜上，根瘤菌通過改善植株氮營養(yǎng)促進(jìn)葉綠素合成、增強(qiáng)光系統(tǒng)活性，提高光合能力，進(jìn)而促進(jìn)干物質(zhì)積累調(diào)控生長。其中TG101為高效根瘤菌，為后續(xù)研發(fā)適用黃土高原的達(dá)烏里胡枝子根瘤菌劑提供了菌種資源和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：達(dá)烏里胡枝子；根瘤菌；篩選；鑒定

中圖分類號：S813.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1819-13

Promoting-growth Effect of Rhizobia from Lespedeza davurica

and Identification of Efficient Rhizobium

ZHONG Hua1，2，3#， YANG Kai-yuan1，2，3#， QIN Yun-meng1， GAO Peng1，2，3，

HUANG Chen1，2，3， JIANG Lin1，2，3， ZHAO Xiang1，2，3*

（1.College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2 Key Laboratory of Model

Innovation in Forage Production Efficiency， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 3 Shanxi

Key Laboratory of Grassland Ecological Protection and Native Grass Germplasm Innovation， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In this study，seven rhizobium strains （TG64，TG97，TG98，TG100，TG101，TG105 and TG115） isolated from nodules of Lespedeza daurica with good nodulation effect were selected. By measuring the growth phenotype and main nutritional components of L. davurica，combined with nodulation and photosynthetic characteristics，the physiological and biochemical mechanisms of growth promotion were preliminarily analyzed，and the growth promotion effects of different rhizobia were explored. Finally，the efficient rhizobium was identified by molecular biology，morphology and physiological and biochemical characteristics. The results showed that except for TG64，the other strains significantly increased the plant height，root length，biomass and protein content，and significantly improved the root construction of the plant. Among them，the promoting-growth effect of TG101 was the best. All strains were nodulated after inoculation，the number of nodules was 5-33 per plant，and the dry weight of nodules was 2.55-35.87 mg per plant. TG98，TG100，TG101 and TG115 significantly increased the chlorophyll content，photosynthetic capacity and nitrogen absorption capacity of the plants，which were the main physiological and biochemical mechanisms for promoting growth. TG101 with the best growth-promoting effect was identified as Bradyrhizobium erythrophlei. In conclusion，the rhizobia promoted the synthesis of chlorophyll，enhanced the activity of photosystem，and improved the photosynthetic capacity by improving the nitrogen nutrition of plants，thus promoting the accumulation of dry matter and regulating its growth. Among them，TG101 with the best growth-promoting effect was an efficient rhizobium，which provided strain resources and theoretical basis for the subsequent development of rhizobium agents suitable for L. davurica in the Loess Plateau，China.

Key words：Lespedeza daurica;Rhizobia;Screening;Identification

氮素（Nitrogen）是限制豆科植物生長發(fā)育的最主要元素之一［1］。盡管大氣中存在大量的氮，但大多以極穩(wěn)定狀態(tài)存在，不能被植物吸收利用［2］。根瘤菌（Rhizobium）能夠與豆科植物共生，形成根瘤（Nodule）固定大氣中的氮供自身及周圍植物利用，是生物固氮（Biological nitrogen fixation）中效率最高的體系［3］。根瘤菌促進(jìn)植物生長發(fā)育主要體現(xiàn)在兩方面，一是豆科植物-根瘤菌共生體（Legume-rhizobium symbioses）不僅能夠固氮，還通過改善植株的光合特性促進(jìn)干物質(zhì)積累，進(jìn)一步提高產(chǎn)量（生物量）；二是可促進(jìn)根系生長，增加根系吸收面積，進(jìn)而提高根毛對營養(yǎng)元素的吸收能力，促進(jìn)植物對周圍環(huán)境養(yǎng)分的吸收和利用，調(diào)控其生長發(fā)育，改善品質(zhì)［6］。豆科植物-根瘤菌共生體在提高土壤肥力，減少氮肥施用，改善生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮積極作用［7］。因此，探究和開發(fā)根瘤菌對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境修復(fù)具有重要意義。

達(dá)烏里胡枝子（Lespedeza davurica）是豆科胡枝子屬的多年生草本狀半灌木，能夠與根瘤菌共生，具有很高的利用價(jià)值。其莖葉鮮嫩，富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)元素，飼用價(jià)值高［8］；葉片富含黃酮類化合物，具有清熱解毒、降血脂等功效，可用于制茶［9］；根系較發(fā)達(dá)，耐旱耐貧瘠，是生態(tài)修復(fù)的先鋒草種［10］。達(dá)烏里胡枝子主要分布在我國北方、華中至云南等地的森林草原或草原地帶，黃土高原是其分布的幾何和多度中心。黃土高原地區(qū)土壤氮素匱乏，尤其是草地土壤全氮含量和氮密度均低于農(nóng)田［13］，不利于達(dá)烏里胡枝子的生長發(fā)育及栽培利用。近年來，為緩解氮素匱乏的問題，人們大量使用氮肥，對土壤、水體和大氣等造成了嚴(yán)重的污染［14］。豆科植物-根瘤菌共生體作為一種綠色無污染的固氮方式，在生態(tài)環(huán)境保護(hù)以及農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展方面逐漸受到重視。

目前，國內(nèi)外有關(guān)胡枝子屬植物根瘤菌的研究主要集中于根瘤菌多樣性、促生效應(yīng)等方面，研究地區(qū)包括韓國［20］、美國［21］以及我國的陜西、內(nèi)蒙古、甘肅等。能夠與胡枝子屬植物共生固氮的根瘤菌有4屬，包括慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和根瘤菌屬（Rhizobium）。接種根瘤菌能夠顯著提高胡枝子的結(jié)瘤率、根瘤數(shù)、根瘤鮮重以及植物生物量等。山西是達(dá)烏里胡枝子的主要分布區(qū)之一，但是目前尚未見包括該地區(qū)在內(nèi)的我國達(dá)烏里胡枝子根瘤菌的系統(tǒng)研究。本研究選取前期從山西省達(dá)烏里胡枝子根瘤分離且具有較好結(jié)瘤效果的7株根瘤菌，通過盆栽試驗(yàn)比較不同菌株對植株的促生效應(yīng)，進(jìn)一步對其生理生化機(jī)制進(jìn)行分析，對高效根瘤菌進(jìn)行鑒定，以期為研發(fā)適用于黃土高原地區(qū)的達(dá)烏里胡枝子根瘤菌劑提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2021年從山西省種植的‘晉農(nóng)1號’達(dá)烏里胡枝子根瘤中分離純化了88株根瘤菌，保存在含有30%甘油的凍存管中，置于—80℃超低溫冰箱。

菌種活化及菌懸液的制備：將保存的菌株從-80℃超低溫冰箱取出后，置于45℃水浴鍋中熱激5 min，使其快速復(fù)蘇。用無菌接種環(huán)將復(fù)蘇菌株劃線接種在YMA培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱（MJ-I型，上海一恒公司）培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種在TY液體培養(yǎng)基，28℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY-180E型，上海知楚公司）培養(yǎng)24 h。取10 mL上述培養(yǎng)液置于離心機(jī)（H2050R型，湖南湘儀公司）4℃、10 000 r·min-1離心10 min，倒去上清液，用無菌水沖洗3次，收集菌體。向獲得的菌體中加入5 mL無菌水，充分混勻，調(diào)節(jié)OD600為0.8，備用。

16S rRNA基因序列相似性：用無菌接種環(huán)挑取根瘤菌單菌落，置于盛有20 μL無菌水的PCR八連排管中，在PCR儀上95℃加熱7 min，4℃、10 000 r·min-1離心10 min取上清液作為模板DNA備用。利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和P6（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，DNA模板（10 ng·μL-1） 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。獲得的16S rRNA基因序列用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar和SeqMan程序進(jìn)行拼接和人工校對，編輯后獲得的序列提交美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并利用EzBioCloud （https：//www.ezbiocloud.net/identify/）進(jìn)行序列比對。

利用Fahreus半固體無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)達(dá)烏里胡枝子幼苗并接種根瘤菌，進(jìn)一步對其結(jié)瘤效果進(jìn)行測定，最終選取了7株結(jié)瘤效果較好的根瘤菌作為供試菌株（表1）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

試劑均為國產(chǎn)分析純。酵母甘露醇瓊脂（Yeast mannitol agar，YMA）培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［25］配制，酵母蛋白胨（Tryptone yeast，TY）液體培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［26］配制。Gibson微量元素液和Fahreus無氮營養(yǎng)液參考文獻(xiàn)［27］配制。

1.3 根瘤菌對盆栽達(dá)烏里胡枝子的促生試驗(yàn)

1.3.1 幼苗植株的培養(yǎng) 挑選一批籽粒飽滿、色澤形態(tài)一致的‘晉農(nóng)1號’達(dá)烏里胡枝子種子（由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），用5% NaCl溶液消毒5 min，最后用無菌水漂洗6～8次。用無菌鑷子將表面消毒完全的達(dá)烏里胡枝子種子播種到盛有無菌蛭石的花盆（內(nèi)徑9 cm，高13 cm）中，每盆播種10粒，然后在溫度為25℃，光照周期為16 h/8 h（光照/黑暗），相對濕度為40%～50%的植物培養(yǎng)間培養(yǎng)，期間每周定期補(bǔ)充無菌水。在培養(yǎng)10 d后間苗，每盆留3株長勢一致的幼苗。

1.3.2 根瘤菌的接種 從幼苗生長第10天，即間苗結(jié)束后開始接種。用移液槍吸取1.1中OD600為0.8的根瘤菌菌懸液1 mL，接種在達(dá)烏里胡枝子幼苗莖基部，以接種無菌水的幼苗為對照，并每隔7 d再次接種，共接種3次，每個處理3次重復(fù)。接種完成后在植物培養(yǎng)間中培養(yǎng)，期間每周將花盆底部浸泡在Fahreus無氮營養(yǎng)液中吸水，保持基質(zhì)濕潤。

1.3.3 根瘤菌促生作用的測定 形態(tài)和生長指標(biāo)測定：在第1次接種90 d后取樣，利用直尺測定植株的垂直株高、根長，利用游標(biāo)卡尺測定莖粗，利用根系掃描儀（LA-S型，杭州萬深公司）統(tǒng)計(jì)根系數(shù)據(jù)，用剪刀將植株地上部與地下部分離后，利用量筒測定植株根體積，利用分析天平分別測定植株和根瘤鮮重。將植株地上部和地下部分別裝入信封中，于105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，稱重測定其地上部、地下部干重（生物量）。

結(jié)瘤特征的測定：利用游標(biāo)卡尺測定根瘤直徑，利用分析天平測定根瘤鮮重。

根瘤投資（Investment to nodulation）的計(jì)算［10］：根瘤生物量占植株總生物量的比例。

全氮含量測定：使用連續(xù)流動分析儀（AA3型，德國SEAL公司）測定植株地上部分的全氮含量。

粗蛋白含量測定：全氮含量乘以系數(shù)6.25即為植株地上部分粗蛋白含量。

可溶性糖含量測定：利用蒽酮法測定植株地上部分可溶性糖含量。

黃酮含量測定：以蘆丁為對照品，利用分光光度法測定植株地上部分黃酮含量。

葉綠素相對含量的測定：利用便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502PLUS型，日本柯尼卡公司）對達(dá)烏里胡枝子同一葉位葉片的葉綠素相對含量（SPAD）進(jìn)行測定，每個處理3次重復(fù)。

葉片氣體交換參數(shù)測定：選取達(dá)烏里胡枝子植株的同一葉位葉片，利用便攜式光合儀測（CI-340型，美國CID公司）定凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（Intercellular CO2 concentration，Ci）、蒸騰速率（Transpiration rate，Tr），每個處理3次重復(fù)。將測量后的葉片取下，測定其葉面積。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定：利用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x（PAM-2500型，德國WALZ公司），測定黑暗環(huán)境下適應(yīng)20 min的達(dá)烏里胡枝子葉片的初始熒光（Fluorescence origin，F(xiàn)o）、最大熒光（Fluorescence maximum，F(xiàn)m）和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm（Maximal quantum yield of PSⅡ），并計(jì)算可變熒光（Variable fluorescence，F(xiàn)v）Fv=Fm-Fo和PSⅡ潛在光化學(xué)效率（Potential photochemical efficiency of PSⅡ）Fv/Fo。

所述測定指標(biāo)均為3次重復(fù)的平均值。

1.4 高效根瘤菌的鑒定

根據(jù)達(dá)烏里胡枝子的主要用途（飼草生產(chǎn)和生態(tài)修復(fù)），以植株的生物量、粗蛋白含量、氮含量、形態(tài)指標(biāo)、葉綠素含量、光合指標(biāo)以及結(jié)瘤指標(biāo)來確定高效根瘤菌。

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將高效根瘤菌TG101接種在YMA培養(yǎng)基上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)，第7 d觀察菌落形態(tài)特征，測定直徑。進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色［28］，電鏡下觀察菌體形態(tài)特征，測量大小，測量重復(fù)50次。

1.4.2 生理生化特性鑒定 對高效根瘤菌TG101進(jìn)行吲哚反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)和甲基紅反應(yīng)的測定［29］。

1.4.3 分子生物學(xué)特性鑒定 使用MEGA 7.0軟件將高效根瘤菌TG101的序列與EZBioCloud數(shù)據(jù)庫中的模式菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（bootstrap）為1 000次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對達(dá)烏里胡枝子的結(jié)瘤數(shù)、根瘤直徑、株高、根長、莖粗、根體積、植株生物量、根瘤生物量、葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素相對含量、葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和最小顯著性差異法（Least-Significant Difference，LSD）多重比較（Plt;0.05）。利用Origin 2021統(tǒng)計(jì)軟件繪制根瘤菌對達(dá)烏里胡枝子促生作用的柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子生長的影響

除接種TG64，其余處理均使達(dá)烏里胡枝子的株高、根長和莖粗顯著提高（Plt;0.05）（圖1E）。與對照相比，株高提高了204.3%～414.5%（圖1A）；根長提高了72.4%～121.4%（圖1B）；莖粗提高了174.2%～300.0%（圖1C）。其中接種TG101的植株株高、根長和莖粗均最高，分別為52.35 cm、29.67 cm和1.78 mm。除接種TG64和TG105，其余處理使根體積顯著提高了433.3%～700.0%（Plt;0.05）。其中接種TG98的植株根體積最大，為1.50 mm3（圖1D）。

除接種TG64，其余處理均使達(dá)烏里胡枝子的根系長度、根系表面積、根系平均直徑、根系連接數(shù)和分叉數(shù)顯著提高（Plt;0.05）。與對照相比，根系長度提高了1.9～9.1倍，根系表面積提高了5.1～20.4倍，根系平均直徑提高了0.3～1.3倍，根系連接數(shù)提高了2.8～13.7倍，根系分叉數(shù)提高了2.8～14.5倍。其中，接種TG101的植株根系長度、根系連接數(shù)和分叉數(shù)最高，分別為1 028.13 cm、4 339.00個和2 656.00個；接種TG98的植株根系表面積和根系平均直徑最大，分別為199.50 cm2和0.71 mm。7株根瘤菌使達(dá)烏里胡枝子的根尖數(shù)顯著提高了1.3～8.5倍（Plt;0.05）。其中接種TG101和TG98的達(dá)烏里胡枝子根尖數(shù)最大，分別為674.00個和654.50個，顯著高于其余處理（Plt;0.05）（表2）。

2.2 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子生物量的影響

除接種TG64，其余處理使達(dá)烏里胡枝子的生物量均顯著提高（Plt;0.05）。與對照相比，地上部鮮重提高了26.5～66.5倍（圖2A）；地下部鮮重提高了4.5～21.7倍（圖2B）；地上部干重提高了21.0～68.47（圖2C）；地下部干重提高了3.2～25.0倍（圖2D）。其中，接種TG101的植株地上部鮮重和地上部干重均為最高，分別為3.05 g和1.26 g；接種TG98的植株地下部鮮重和地下部干重均為最高，分別為1.65 g和0.38 g；并且接種TG98和TG101的植株地下部鮮重顯著高于其余處理（Plt;0.05）。

2.3 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子營養(yǎng)品質(zhì)的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的粗蛋白含量（Plt;0.05），與對照相比提高了170.1%～207.4%（圖3）。其中，接種TG101和TG115的植株粗蛋白含量顯著高于其余處理（Plt;0.05），分別為165.80和160.98 g·kg-1（圖3A）。TG97和TG115顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的可溶性糖含量（Plt;0.05），與對照相比提高了4.2%～12.3%。TG64、TG100、TG101和TG115均顯著降低了植株可溶性糖含量，與對照相比降低了11.1%～27.9%（Plt;0.05）（圖3B）。僅TG98顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的黃酮含量（Plt;0.05），與對照相比提高了6.5%。其余6株根瘤菌均顯著降低了植株黃酮含量，與對照相比降低了9.5%～39.4%（Plt;0.05）（圖3C）。

2.4 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子結(jié)瘤特征的影響

7株根瘤菌的單株平均結(jié)瘤數(shù)量為5～33個·株-1，根瘤平均鮮重為12.93～199.03 mg，根瘤平均干重為2.55～35.87 mg。其中TG101的單株結(jié)瘤數(shù)量、根瘤平均鮮重和平均干重均最大，分別為33個，199.03 mg和35.87 mg。接種7株根瘤菌后，達(dá)烏里胡枝子的根瘤投資為2.03%～7.32%，其中接種TG64和TG97的植株根瘤投資顯著高于其他處理（Plt;0.05），分別為7.32%和4.67%，TG98的根瘤投資最低，為2.03%（表3）。

2.5 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子全氮含量的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的全氮含量（Plt;0.05）。與對照相比提高了170.1%～207.4%。其中，接種TG101和TG115的植株全氮含量顯著高于其余處理（Plt;0.05），分別為26.53 g·kg-1和25.76 g·kg-1 （圖4）。

2.6 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子葉綠素相對含量的影響

7株根瘤菌均顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的葉綠素相對含量（Plt;0.05），其SPAD值與對照相比，提高了81.7%～150.4%。其中，接種TG101的植株SPAD值最高，為53.04，顯著高于其他處理（Plt;0.05），TG100除外（圖5）。

2.7 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子光合特性的影響

接種TG98、TG100、TG101和TG115后，達(dá)烏里胡枝子的凈光合速率分別比對照顯著提高了67.4%、82.9%、127.1%和60.2%（Plt;0.05） （圖6）。其中，接種TG101的植株凈光合速率顯著高于其他處理（Plt;0.05），為14.76 μmol·m-2·s-1 （圖6A）。接種TG100、TG101和TG115后，植株的氣孔導(dǎo)度分別比對照顯著提高了100.2%、51.0%和82.3%（Plt;0.05）。其中，接種TG100的植株氣孔導(dǎo)度最高，為51.01 mmol·m-2·s-1，TG115次之，為46.46 mmol·m-2·s-1，TG101為38.47 mmol·m-2·s-1 （圖6B）。除接種TG105，其余處理使植株的蒸騰速率顯著提高了86.0%～164.8%（Plt;0.05）。其中，接種TG100的植株蒸騰速率最高，為0.60 mmol·m-2·s-1（圖6C）。接種TG97的植株葉片胞間CO2濃度有所降低，但是與對照間均無顯著差異（Plt;0.05）（圖6D）。

2.8 不同根瘤菌菌株對達(dá)烏里胡枝子葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/p>

除TG105，其余處理使達(dá)烏里胡枝子的最大熒光Fm顯著提高了4.4%～10.4%，可變熒光Fv顯著提高了7.0%～12.2%，最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm均顯著提高1.3%（Plt;0.05），其中接種TG97的植株Fm最高，為4.26，接種TG97和TG115的植株Fv最高，均為3.22。接種TG97、TG100和TG101后，植株的PSⅡ潛在光化學(xué)效率Fv/Fo顯著提高了6.7%、6.1%和9.1% （Plt;0.05），其中接種TG101的植株Fv/Fo最高，為3.24（表4）。

2.9 高效根瘤菌TG101的分類地位

TG101的菌落為白色、圓形，邊緣完整，中心無隆起，菌落表面有光澤且不透明，質(zhì)地粘稠，生長2 d的菌落直徑為3.47 mm（圖7A）。其革蘭氏染色為陰性（圖7B），無芽孢，菌體直桿狀，大小為（0.54～0.84） μm×（2.39～4.95） μm（圖7C，表5）。

在TG101的1%胰胨水溶液滴加Kovac試劑后，培養(yǎng)液層界面無紅色環(huán)出現(xiàn)，吲哚反應(yīng)呈陰性。TG101與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生氣泡，過氧化氫酶反應(yīng)呈陽性。在TG101的葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基滴加甲基紅試劑后，培養(yǎng)液呈淡黃色，甲基紅反應(yīng)呈陰性。在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上滴加碘液，菌落周圍無透明圈產(chǎn)生，淀粉水解反應(yīng)呈陰性。在明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)后，TG101無液化現(xiàn)象出現(xiàn)，明膠液化反應(yīng)呈陰性（表6）。

高效根瘤菌TG101的GenBank登錄號為OQ710138，16S rRNA基因序列長度為1 430 bp。通過EZBioCloud數(shù)據(jù)庫比對和系統(tǒng)發(fā)育分析（圖8），TG101與模式菌株格木慢生根瘤菌（B. erythrophlei CCBAU 53325T 登錄號：KF114645）的同源性為99.85%。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性，確定TG101為格木慢生根瘤菌。

3 討論

生長形態(tài)是反映植株生長狀況的最直觀特征，生物量能夠反映其生長狀況［30］。本研究中，接種TG97、TG98、TG100、TG101和TG115后，達(dá)烏里胡枝子的株高、根長、莖粗、根體積和地上、地下生物量均顯著提高。Sun等［31］研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌能夠顯著促進(jìn)刺槐（Robinia pseudoacacia）幼苗生長，其株高、根系直徑和總生物量分別提高了44%，19%和123%。全紫曼等［32］研究表明，接種根瘤菌能夠顯著提高蠶豆（Vicia faba）的株高和生物量。Qu等［33］對鹽脅迫下的大豆接種根瘤菌，發(fā)現(xiàn)其生物量提高了10.95%～30.95%，本研究中接種根瘤菌后，植株地上生物量提高了26.5～66.5倍，遠(yuǎn)高于該文獻(xiàn)的效果。本研究接種根瘤菌后，達(dá)烏里胡枝子的株高、根長、莖粗、根體積和生物量最高分別可提升414.5%，121.4%，300.0%，700.0%和68.47倍，具有良好的應(yīng)用前景。根系是植物吸收水分和營養(yǎng)元素的關(guān)鍵器官，其生長狀況能夠反映植物的生長水平和抗逆性等特征［30］。其中根系長度和根表面積是衡量根系吸收范圍的重要指標(biāo)，根系平均直徑、連接數(shù)、根尖數(shù)、分叉數(shù)等能夠衡量根系的吸收能力［34］。本研究中，接種TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115后，達(dá)烏里胡枝子的根系長度、根系表面積、根系平均直徑、根系連接數(shù)和分叉數(shù)均顯著提高。高文禮等［34］研究表明，接種根瘤菌提高了疏葉駱駝刺（Alhagi sparsifolia）的根系表面積和根系平均直徑，促進(jìn)植株生長。郝鳳等［35］在接種根瘤菌對紫花苜蓿根系形態(tài)特征的研究中也得到了相似的結(jié)論。

生物固氮是豆科植物在整個生長發(fā)育過程中最主要的吸收氮素的途徑，根瘤是進(jìn)行生物固氮的重要結(jié)構(gòu)。根瘤數(shù)量和重量是評價(jià)根瘤菌結(jié)瘤能力的兩個重要指標(biāo)［36］。通過盆栽試驗(yàn)對7株根瘤菌的促生效應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115的結(jié)瘤數(shù)和根瘤干重顯著高于TG64，結(jié)瘤效果更好。根據(jù)前期采用分子生物學(xué)方法初步鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TG97，TG98，TG100，TG101，TG105和TG115均為慢生根瘤菌屬，TG64為新根瘤菌屬，與伍惠等［37］的研究結(jié)論相似，慢生根瘤菌屬通常具有更好的結(jié)瘤固氮能力。根瘤投資能夠反映豆科植物的生物固氮能力［38］。結(jié)瘤固氮是一個高耗能過程，一般而言，豆科植物更傾向于以較低的根瘤投資獲取更多的氮營養(yǎng)［39］。本研究中，TG64和TG97的根瘤投資顯著高于其他接種處理，而結(jié)瘤數(shù)、根瘤干重等卻相對較低，其原因可能是TG64和TG97的固氮能力較差，植物需要投入更多的物質(zhì)能量形成根瘤，來獲取足夠的氮以維持自身生命活動。后續(xù)將進(jìn)一步對上述7株根瘤菌的固氮酶活性進(jìn)行測定，定量分析其固氮能力。

氮素是構(gòu)成植物葉綠素、蛋白質(zhì)、核酸以及激素等成分的重要元素之一，在豆科植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［40］。豆科植物-根瘤菌共生體是豆科植物改善自身氮營養(yǎng)的主要途徑，本研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌后達(dá)烏里胡枝子的全氮含量顯著提高，并且其營養(yǎng)品質(zhì)也顯著改善，尤其是蛋白質(zhì)含量顯著提高，與關(guān)于接種根瘤菌對紫花苜蓿氮營養(yǎng)的研究相似。接種根瘤菌并未對達(dá)烏里胡枝子的黃酮產(chǎn)生明顯影響，因此上述菌株更適用于高蛋白飼草的生產(chǎn)。達(dá)烏里胡枝子作為優(yōu)良的豆科牧草，具有良好的生態(tài)修復(fù)功能。根據(jù)其用途（飼草生產(chǎn)、生態(tài)修復(fù)），本研究確定以地上生物量、形態(tài)指標(biāo)、粗蛋白含量、氮含量、葉綠素含量、光合指標(biāo)以及結(jié)瘤指標(biāo)來確定高效根瘤菌。TG101與其他菌株相比，在上述指標(biāo)中的促進(jìn)效果更優(yōu)，因此將TG101確定為高效根瘤菌。在氮限制條件下，植株的葉綠素合成受阻，光系統(tǒng)活性受到抑制，并且氣孔導(dǎo)度會明顯降低，進(jìn)而影響自身水分利用與氣體交換［44］，抑制光合作用，對生長造成不利影響。葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的最重要色素分子，在光能的吸收和轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用［45］，其含量直接影響植物的光合能力。本研究中，7株根瘤菌均顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的葉綠素相對含量。孫慶圣等［46］研究減施氮肥和接種根瘤菌對大豆光合特性的影響發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌能夠顯著促進(jìn)葉綠素的合成，進(jìn)而提高大豆的凈光合速率，促進(jìn)植株生長。菜豆［47］和大豆［48］接種根瘤菌的研究也得到了類似的結(jié)果，表明根瘤菌能夠通過固氮作用提高植株的氮營養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)了葉綠素的合成。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)在測定植物光合作用的光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、消耗和分配等具有重要作用，能夠從側(cè)面反應(yīng)植物的光合功能［49］。其中，初始熒光Fo代表PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量；最大熒光Fm代表PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時的熒光產(chǎn)量，反映了通過PSⅡ的電子傳遞情況；可變熒光Fv反映了QA的還原情況；最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm反映了PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)化效率；Fv/Fo反映了PSⅡ的潛在光化學(xué)效率［50］。已有學(xué)者對達(dá)烏里胡枝子以及尖葉胡枝子等的光響應(yīng)曲線特征進(jìn)行了研究，均在上午9：30—11：30測定較好。本研究通過在上午9：30—11：30測定達(dá)烏里胡枝子的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌顯著提高了其Fm、Fv和Fv/Fm，并且TG97、TG100和TG101還顯著提高了其Fv/Fo，與李馨園等［53］對大豆接種根瘤菌的研究結(jié)果一致，說明接種根瘤菌顯著改善了達(dá)烏里胡枝子的光系統(tǒng)活性，進(jìn)而增強(qiáng)其光合作用。植物能夠通過光合作用固定光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物質(zhì)供自身利用，光合作用是植物生長發(fā)育的保證［54］。凈光合速率是反映植物光合潛力的重要指標(biāo)，也是決定植物生產(chǎn)力的根本因素［55］。本研究中，接種TG100、TG101和TG115顯著提高了達(dá)烏里胡枝子的凈光合速率。Raja等［41］發(fā)現(xiàn)田間接種根瘤菌能夠顯著提高紫花苜蓿的葉綠素含量、光系統(tǒng)活性等。孟捷等［56］研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌能夠顯著提高紫花苜蓿的凈光合速率，與本研究一致。

4 結(jié)論

7株根瘤菌與達(dá)烏里胡枝子的共生匹配性和結(jié)瘤效果較好，對盆栽植株有不同程度的促生作用。根瘤菌通過與達(dá)烏里胡枝子共生，形成根瘤發(fā)揮固氮作用改善植株的氮素營養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)葉綠素的合成、改善光系統(tǒng)活性等方式增強(qiáng)其光合能力（凈光合速率），從而促進(jìn)植株固定光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物質(zhì)，調(diào)控其生長。其中，TG101對達(dá)烏里胡枝子的生物量、粗蛋白含量、氮含量、形態(tài)指標(biāo)、葉綠素相對含量、光合指標(biāo)以及結(jié)瘤指標(biāo)等的促進(jìn)效果最優(yōu)，確定為高效根瘤菌，經(jīng)分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定為格木慢生根瘤菌，可作為后續(xù)研發(fā)適用于黃土高原地區(qū)的達(dá)烏里胡枝子根瘤菌劑的菌種資源。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）