克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組分析及SSR位點開發(fā)

摘要：作為眾多農(nóng)作物和野生植物的重要傳粉者，熊蜂在維持農(nóng)業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮十分重要的作用。本研究以克什米爾熊蜂（Bombus kashmirensis）為研究對象，使用Illumina Novaseq平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，并基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行微衛(wèi)星位點的開發(fā)。結(jié)果顯示，克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組測序共獲得95 639條測序良好的unigene，GO注釋和KEGG通路富集主要集中在分子功能、細胞進程和碳水化合物代謝上?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得27 414個微衛(wèi)星位點，位點發(fā)生頻率17.81%。簡單重復序列主要重復類型為單堿基，其中A/T為優(yōu)勢基元，占總微衛(wèi)星數(shù)量的55.89%，且微衛(wèi)星主要重復次數(shù)范圍在11～15次（48.61%）。用10頭不同克什米爾熊蜂樣品對30個微衛(wèi)星位點進行驗證，有17對引物可穩(wěn)定擴增。本研究為克什米爾熊蜂的適應與進化等種群遺傳學研究提供了重要參考。

關鍵詞：克什米爾熊蜂；轉(zhuǎn)錄組測序；微衛(wèi)星分析

中圖分類號：Q969.557.7""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1742-10

Transcriptome Analysis and SSR Locus Development in Bombus kashmirensis

SUN Guo， YAN Jing-yan， LIANG Cheng-bo， MA Xiao-xuan， LIU Dao-xin*

（School of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：As the essential pollinators of many crops and wild plants，bumblebees play an important role in maintaining the balance of agriculture and ecosystems. In this study，the Bombus kashmirensis was used for transcriptome sequencing by using Illumina Novaseq platform and microsatellite locus were development based on the transcriptome data. The results indicated that a total of 95 639 well-sequenced unigenes were obtained from the transcriptome sequencing of Bombus kashmirensis，with GO annotations and KEGG pathway enrichment focusing on molecular functions，cellular processes and carbohydrate metabolism. A total of 27 414 microsatellite loci were obtained based on transcriptome data，with a locus frequency of 17.81%. The major repeat type of microsatellites was Mono-nucleotide repeats，of which A/T was the dominant motif，accounting for 55.89% of the total microsatellites number，and the major microsatellites base repeats were in the range of 11～15 repeats （48.61%）. Thirty microsatellite loci were validated using samples from 10 different Bombus kashmirensis，of which 17 primer pairs were stably amplified. This study provides an important reference for population genetics studies such as adaptation and evolution of Bombus kashmirensis.

Key words：Bombus kashmirensis;Transcriptome sequencing;Microsatellite analysis

熊蜂（bombus spp.）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）昆蟲綱（Insecta）膜翅目（Hymenoptera）蜜蜂科（Apidae）熊蜂屬（Bombus），是一類社會性傳粉昆蟲［1］。相比于蜜蜂，熊蜂體型較大，渾身長滿絨毛，耐寒性強，能夠分布在寒冷的區(qū)域為一些瀕危植物進行傳粉［2］。此外，由于具有耐濕性強、耐低光照以及聲震傳粉等特性，熊蜂成為了溫室作物的理想授粉昆蟲，尤其適宜為設施作物及深花冠植物授粉，能夠顯著提高農(nóng)林果蔬產(chǎn)量及品質(zhì)［3-4］。研究顯示，熊蜂授粉可使大棚試驗農(nóng)作物坐果率提高30%以上，單株產(chǎn)量提高17%以上［5］。目前全球已知熊蜂種類260余種，我國有120多種，約占全球熊蜂資源的50%［6-7］。然而，氣候變暖和頻繁的極端天氣導致全球熊蜂資源正在減少，包括我國熊蜂資源豐富的一些地區(qū)的熊蜂數(shù)量也在減少［8-9］。有研究表明，氣候變暖引起的植物單一化已使某些熊蜂的飲食寬度發(fā)生改變，導致它們與植物互作關系中傳粉功能的失配，已威脅到生態(tài)系統(tǒng)的平衡［10］。另外，農(nóng)藥的廣泛使用更是直接威脅到各類傳粉昆蟲的生存，不僅引起熊蜂訪花行為的異常，而且極大地造成其傳粉能力的下降［11］。

為了維持熊蜂種群數(shù)量及多樣性，除了要采取各種措施保護熊蜂賴以生存的自然環(huán)境外，更多科學家使用分子手段為熊蜂的保護提供支持［12］。例如，Wang等［13］和Williams等［14］利用多種分子標記重建全球15個亞屬120多種熊蜂的系統(tǒng)發(fā)育關系，為熊蜂的分類提供了參考依據(jù)；Lin等［15］和Sadd等［16］通過分析重要熊蜂物種的基因組序列，探討熊蜂基因組進化速率與海拔的關系以及熊蜂基因組進化過程中一些關鍵基因潛在的調(diào)控過程，為熊蜂的適應與進化奠定了遺傳學基礎。簡單重復序列（Single sequence reperts，SSR）又稱微衛(wèi)星序列（microsatellite），是研究動植物基因遺傳多樣性的一種重要分子標記［17］。作為一種多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、共顯性表達且易檢測的分子遺傳標記［18］，微衛(wèi)星被廣泛應用于遺傳多樣性分析［19］、基因定位［20］和親緣關系鑒定［21］等眾多領域。目前熊蜂有關微衛(wèi)星的研究主要集中在群體遺傳方面，如Takeuchi等［22］利用微衛(wèi)星標記研究北海道小峰熊蜂（Bombus hypocrita sapporoensis）的遺傳結(jié)構(gòu)；Cejas等［23］利用微衛(wèi)星標記結(jié)合線粒體基因標記研究伊比利亞半島地熊蜂（Bombus terrestris）的時空格局等；而不同熊蜂轉(zhuǎn)錄組分析以及基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR位點的報道很少。

本研究對克什米爾熊蜂（Bombus kashmirensis）進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分析了其基因表達特征，并基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了SSR位點的分布特征，同時設計引物對部分SSR位點進行了有效性驗證。研究結(jié)果可以為克什米爾熊蜂的適應與進化等種群遺傳學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本試驗中克什米爾熊蜂樣品于2021年8—9月采集于三江源地區(qū)（31°39′～36°12′ N，89°45′～102°23′ E），將熊蜂樣品置于液氮速凍后，保存在-80℃條件下，以便于后續(xù)RNA提取。另取10頭工蜂用于微衛(wèi)星引物的驗證，使用Ezup 柱式動物基因組 DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，經(jīng)過微量核酸分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果滿足進一步實驗要求，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 克什米爾熊蜂總RNA的提取、建庫及數(shù)據(jù)評估

轉(zhuǎn)錄組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。取克什米爾熊蜂的頭、胸部肌肉且用MJZol total RNA extraction kit試劑盒（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）提取總RNA，使用Nanodrop 2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法［24］進行文庫構(gòu)建；使用Illumina平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序，并對獲得的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制；獲得 RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后，使用Trinity軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從頭組裝，并對初始組裝序列進行優(yōu)化過濾（TransRate軟件和CD-HIT軟件）并再次評估（BUSCO軟件）。

1.3 克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組unigenes的功能注釋

將轉(zhuǎn)錄組測序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與NR（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/public/），Swiss-Prot（ftp：//ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz），Pfam（http：//pfam.xfam.org/），eggNOG（http：//eggnogdb.embl.de/#/app/home），GO（http：//www.geneontology.org/），KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）等六大數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得在各數(shù)據(jù)庫的注釋信息。

1.4 SSR的篩選及引物的設計

利用 MISA 軟件（http：//pgrc.ipk-gatresleben.de/misa/）搜尋克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組組裝后 unigene 數(shù)據(jù)中潛在的SSR位點。軟件中參數(shù)設置為單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基的最短重復次數(shù)分別為10，6，5，5，5，5。將結(jié)果文件導入Primer3軟件，設計SSR位點的相關引物。

1.5 SSR引物的驗證

為了較全面的驗證引物的有效性，從批量設計的引物中隨機選出30對引物（表1）。（挑選原則為兩堿基重復的16個，三堿基重復的7個，四堿基重復的7個；位點片段長度在150 bp以下的位點10個、150～200 bp的位點10個、200～300 bp的位點10個；重復次數(shù)15～20次的5個、21～25次的5個、26～30次的5個、31～35次的5個、36次以上的5個；完美型微衛(wèi)星）交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系為 25 μL：克什米爾熊蜂DNA模板 0.5 μL，上下游引物（0.2～1.0 μmol·L-1）各加 0.5 μL，2×Taq Master Mix* 12.5 μL，ddH2O 11 μL。反應程序：94℃預變性 1 min 30 s；94℃變性 20 s，59～60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，總共 35 個循環(huán)；72℃延伸 5 min，4℃保溫。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（110V，35 min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組測序、組裝及注釋

通過對克什米爾熊蜂樣品轉(zhuǎn)錄組測序，獲得119.45 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到6.04 Gb以上，Q30堿基質(zhì)量比值在92.98%以上，GC含量在37.36%～47.39%之間，說明測序質(zhì)量較好。經(jīng)de novo組裝后，通用單拷貝同源基因基準值（Benchmarking universal single-copy orthologs，BUSCO）中有94.5%的測試基因被覆蓋，其中有78.9%的基因經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)是單拷貝，有15.6%的基因經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)包含多拷貝（測試基因覆蓋數(shù)=比對后的單拷貝數(shù)+比對后的多拷貝數(shù)）［BUSCO值：C：94.5%（S：78.9%：D：15.6%），C=S+D］，共獲得unigene 95 639條，平均長度為981.88 bp，N50長度為1 741 bp，unigene長度在200～500 bp之間，占總unigene的50%，隨著序列長度的增加，unigene總體呈逐步遞減趨勢（表2）。將克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組測序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本分別與NR，Swiss-Prot，Pfam，eggNOG，GO 和 KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，結(jié)果表明，在148 656條Transcript中，共有64.62%的Transcript被注釋到相應的數(shù)據(jù)庫，組裝評估后58.41%的基因被注釋到公共數(shù)據(jù)庫；同時有58.64%表達unigene 被注釋到公共數(shù)據(jù)庫中（表3）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被存入NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫中，克什米爾熊蜂的登錄號為SRR19913284 至SRR19913300。

2.2 unigenes的GO功能注釋

GO數(shù)據(jù)庫的28 443個unigenes的功能注釋結(jié)果表明，克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組功能分為分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）和生物學進程（biological process）三大類和54個功能小類。注釋到的生物學進程有22個功能小類，注釋到的細胞組分有15個功能小類，注釋到的分子功能有17個功能小類。在生物學進程中注釋到的細胞進程（cellular process）功能的基因最多（13 091，36.46%），在細胞組分中注釋到的細胞部分（cell part）功能的基因最多（13 758，30.62%），在分子功能中注釋到的結(jié)合（binding）功能的基因最多（16 316，44.13%）（圖1）。

2.3 unigenes的KEGG通路富集

KEGG數(shù)據(jù)庫的31 212條unigenes 代謝通路富集分析表明，克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組代謝通路分別富集到環(huán)境信息處理（Envieonmental information processing）、新陳代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、細胞進程（Cellular processes）和有機系統(tǒng)（Organismal system）五大類別、33個小類別中。其中富集到新陳代謝的基因數(shù)最多（9 552），富集到環(huán)境信息處理中的基因最少（3 428）。在新陳代謝途徑中富集到氨基酸代謝（Amino acid metabolism）的基因最多（2 921，30.58%），在有機系統(tǒng)途徑中富集到內(nèi)分泌系統(tǒng)（Endocrine system）的基因最多（1 709，20.87%），在細胞進程途徑中富集到運輸與分解代謝（Transport and catabolism）的基因最多（2 223，44.65%），在遺傳信息處理途徑中富集到信號轉(zhuǎn)導（Signal transduction）的基因最多（3 107，90.64%）（圖2）。富集到的所有基因分布在342條代謝通路中，其中富集最多的10條代謝通路分別是核糖體（Ribosome）、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化（Pentose and glucuronate interconversions）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、產(chǎn)熱（Thermogenesis）、胞吞作用（Endocytosis）、剪接體（Spliceosome）、輔助因子的生物合成（Biosynthesis of cofactors）、泛素介導的蛋白水解（Ubiquitin mediated proteolysis）、AMPK 信號通路（AMPK signaling pathway）（表4）。

2.4 克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組中SSR分布特征

搜尋克什米爾熊蜂95 639條unigenes中的SSR位點，結(jié)果表明：共找到SSR點27 414個，分布在17 029個unigenes中，SSR位點發(fā)生的頻率為17.81%（SSR位點發(fā)生頻率=含有SSR位點的unigenes/全部序列數(shù)量），含有1個以上SSR位點的unigenes序列有4 109條，單堿基至六堿基的SSR位點依次減少，占比分別為56.26%，23.31%，17.08%，2.17%，0.61%，0.57%（表5）。

單堿基至六堿基的堿基重復類型分布結(jié)果表明：單堿基、二堿基和三堿基重復基元總共16種。單堿基中共有2種重復基元，（A/T）n重復11～15次的最多（6 836）；二堿基中共有4種重復基元，（AT/AT）n重復6～10次的最多（2 477）；單堿基（A/T）n，（C/G）n與二堿基（AC/GT）n，（AG/CT）n，（AT/AT）n，（CG/CG）n重復均在5次以上。三堿基中共有10種重復基元，（AAG/CTT）n重復1～5次的最多（498）（圖3A）。四堿基重復基元共有29種，（ACAT/ATGT）n重復6～10次的最多（60）（圖3B）。五堿基重復基元共有51種，（AAAAG/CTTTT）n重復6～10次的最多（13）（圖3C），六堿基重復基元共有83種，（AAGATG/ATCTTC）n和（ACACGC/CGTGTG）n重復1～5次的最多，均為5次（圖3D）。三堿基至六堿基基元類型的重復次數(shù)在1～5，6～10，11～15和大于15次區(qū)間內(nèi)都有分布。

基元重復次數(shù)在11～15次的最多，為13 327（48.61%）（百分數(shù)=該重復基元次數(shù)的SSR位點數(shù)/SSR位點總數(shù)），基元重復次數(shù)在1～5次的最少，為2 777（10.13%）。單堿基的優(yōu)勢重復基元為A/T，共出現(xiàn)15 321次（55.89%）（百分數(shù)=該堿基所有重復次數(shù)的SSR位點數(shù)/SSR位點總數(shù)）；二堿基的優(yōu)勢重復基元為AT/AT，共出現(xiàn)2 820次（10.29%）；三堿基的優(yōu)勢重復基元為AAG/CTT，共出現(xiàn)1 033次（3.77%）；四堿基的優(yōu)勢重復基元為AAAG/CTTT，共出現(xiàn)106次（0.61%）；五堿基的重復基元為AAAAG/CTTTT，共出現(xiàn)24次（0.14%），六堿基由于各重復基元次數(shù)均未超過10次，優(yōu)勢重復基元不明顯。

2.5 SSR分子標記開發(fā)

按照1.5中的挑選原則，從篩選出的微衛(wèi)星引物中挑選30對引物進行驗證，每對引物分別用10個不同地點的克什米爾熊蜂樣品進行PCR擴增。結(jié)果顯示：有17對引物可以在10個不同樣品中穩(wěn)定擴增（表1前17對SSR引物），SSR引物的有效擴增率為56.67%，部分驗證結(jié)果如圖4所示。同時部分引物呈現(xiàn)一定的多態(tài)性，初步表明上述SSR引物可靠性較好。（由于是用10個不同采樣地的克什米爾熊蜂篩選SSR引物，部分引物出現(xiàn)1至2條非特異性或未擴增出來的條帶時可將其視為偶然情況，仍可用于后續(xù)分析。）

3 討論

3.1 克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組特點

轉(zhuǎn)錄組測序技術通過對不同對象、不同發(fā)育時期的不同組織中的轉(zhuǎn)錄組進行分析，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡，篩選出關鍵基因，用于相關的研究［25］。目前，克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組信息處于研究空白。使用不同樣本材料測序，再將測序結(jié)果進行組裝，可以保證數(shù)據(jù)盡量覆蓋度廣、信息全面、準確度高［26］。本研究基于此方法對克什米爾熊蜂進行轉(zhuǎn)錄組測序，95 639條unigene被注釋到公共數(shù)據(jù)庫，占unigene 總數(shù)的58.41%。所有試驗樣本Q30堿基質(zhì)量比值均高于92.98%，N50長度為1 741 bp；組裝后BUSCO值C：94.5%［S：78.9%；D：15.6%］，說明轉(zhuǎn)錄組組裝較完整；unigene平均長度為981.88 bp，長于中華蜜蜂（Apis cerana）（平均unigene 898 bp）［27］和澤蘭實蠅（Procecidochares utilis）（平均unigene 457 bp）［28］，但是短于椰心葉甲嚙小蜂（Tetrastichus brontispae）（平均unigene 1 737.95 bp）［29］。有研究表明，序列長度是影響注釋的重要因素［30］，本次測序獲得的N50、序列長度和堿基質(zhì)量比值等均顯示克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組的拼接注釋效果良好。

本研究中，克什米爾熊蜂的GO功能注釋主要集中在結(jié)合、催化活性、細胞部分、細胞進程和代謝進程等功能中，與夜蛾黑卵蜂［31］、綠眼賽繭蜂［32］和椰心葉甲嚙小蜂［29］等膜翅目昆蟲轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果相似。夜蛾黑卵蜂unigenes的GO功能注釋主要參與結(jié)合（4 925條unigenes）、催化活性（3 542）、細胞進程（5 124）、細胞解剖實體（4 314）和代謝進程（4 479）等功能［31］；綠眼賽繭蜂unigenes的GO功能注釋主要參與細胞進程（5 230）、細胞部分（4 591）、代謝過程（4 068）、結(jié)合（6 652）和催化活性（5 302）等功能［32］；椰心葉甲嚙小蜂unigenes的GO功能注釋主要參與細胞過程（1 527）、結(jié)合（1 733）和膜（1 324）等功能［29］，這表明克什米爾熊蜂與這幾種蜂類的基因功能類似?？耸裁谞栃芊涞腒EGG通路富集主要在信號轉(zhuǎn)導、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、翻譯、運輸與分解代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)等過程中，富集到的主要通路有核糖體、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化和產(chǎn)熱等。其中富集最多的是與核糖體有關的基因，表明這些基因與克什米爾熊蜂蛋白的合成有關。

3.2 克什米爾熊蜂SSR位點發(fā)生頻率及分布

本研究中，從克什米爾熊蜂的轉(zhuǎn)錄組中共識別SSR位點27 414個，以單堿基、二堿基和三堿基核苷酸重復為主。SSR位點的發(fā)生頻率為17.81%，略高于意大利蜜蜂（Apis mellifera）（17.73%）［33］，略低于中蜂（Apis cerana）（17.82%）［27］，遠高于黑翅土白蟻 （Odontotermes formosaanus） （9.98%）［34］和煙粉虱 （Bemisia tabaci） （5.07%）［35］等昆蟲，表明其轉(zhuǎn)錄組中SSR相對比較豐富。不同昆蟲SSR位點出現(xiàn)頻率的差異與物種基因組特點有關，也與搜尋SSR位點時MISA軟件的參數(shù)設置有關［36］。如搜尋意大利蜜蜂［33］和中蜂［27］的SSR時，參數(shù)設置為二堿基至六堿基的最小重復為6，5，5，5，5，本次搜尋SSR位點與它們的參數(shù)一致，說明研究結(jié)果可靠。

克什米爾熊蜂SSR單核苷酸重復中共有（A/T）n和（C/G）n兩種，A/T為優(yōu)勢基元，這與梨小食心蟲［37］和窄足真蚋［38］中優(yōu)勢堿基情況相同。且有研究表明，單堿基A/T既是單核苷酸重復中的優(yōu)勢堿基，也是所有重復類型的優(yōu)勢堿基［39］。克什米爾熊蜂SSR二堿基重復共有（AC/GT）n，（AG/CT）n，（AT/AT）n，（CG/CG）n四種，AT/AT為優(yōu)勢基元，與中華蜜蜂（Apis cerana cerana）［27］和意大利蜜蜂［33］相同，與青海草原毛蟲（Gynaephora qinghaiensis）（AC/GT）［40］不同?？耸裁谞栃芊淙龎A基重復的優(yōu)勢基元為AAG/CTT，相比于單堿基和二堿基的重復基元出現(xiàn)的次數(shù)，三堿基重復基元出現(xiàn)的次數(shù)更少，隨著重復基元堿基數(shù)的增加，重復基元的類型越來越多，但是重復基元出現(xiàn)的次數(shù)越來越少。另外有研究表明，當SSR重復次數(shù)高于12次時，多態(tài)性位點的比例較大［41］?？耸裁谞栃芊滢D(zhuǎn)錄組SSR單堿基至六堿基的重復次數(shù)大多集中在11～15次（48.61%），說明其轉(zhuǎn)錄組SSR具有較高的多態(tài)性位點潛能。

4 結(jié)論

克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組的測序質(zhì)量良好，組裝注釋完整，其中GO功能注釋和KEGG通路富集主要集中于分子功能、細胞進程和碳水化合物代謝等一些途徑中?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR位點出現(xiàn)頻率高、基元特征明顯。本研究通過對克什米爾熊蜂轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析和微衛(wèi)星位點的篩選，豐富了克什米爾熊蜂的分子生物學研究，并設計開發(fā)出了17對能夠穩(wěn)定擴增的SSR引物，為進一步開展克什米爾熊蜂的遺傳學研究奠定了基礎。

參考文獻

［1］ 梁程博，王久利，孫國，等. 三江源地區(qū)熊蜂物種多樣性研究［J］. 草地學報，2022，30（8）：2126-2134

［2］ 周峰，姚麗媛，石涵，等. 傳粉熊蜂訪花行為的研究進展［J］. 昆蟲學報，2023，66（3）：419-438

［3］ 黃家興，安建東. 中國熊蜂多樣性、人工利用與保護策略［J］. 生物多樣性，2018，26（5）：486-497

［4］ 黃家興，安建東，吳杰，等. 熊蜂為溫室茄屬作物授粉的優(yōu)越性［J］. 中國農(nóng)學通報，2007（3）：5-9

［5］ 黃訓兵，李輝，陳浩，等. 熊蜂授粉對北方冬季溫室不同品種番茄品質(zhì)的影響［J］. 北方園藝，2022（4）：56-61

［6］ CAMERON S A，SADD B M. Global trends in bumble bee health［J］. Annual Review of Entomology，2020，65：209-232

［7］ SUN C，HUANG J，WANG Y，et al. Genus-wide characterization of bumblebee genomes provides insights into their evolution and variation in ecological and behavioral traits［J］. Molecular Biology and Evolution，2021，38（2）：486-501

［8］ KWONG W K，ENGEL P，KOCH H，et al. Genomics and host specialization of honey bee and bumble bee gut symbionts［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2014，111（31）：11509-11514

［9］ SOROYE P，NEWBOLD T，KERR J. Climate change contributes to widespread declines among bumblebees across continents［J］. Science，2020，367（6478）：685-688

［10］MILLER-STRUTTMANN N E，GEIB J C，F(xiàn)RANKLIN J D，et al. Functional mismatch in a bumble bee pollination mutualism under climate change［J］. Science，2015，349（6255）：1541-1544

［11］SPRAYBERRY J D，RITTER K A，RIFFELL J A. The effect of olfactory exposure to non-insecticidal agrochemicals on bumblebee foraging behavior［J］. Plos One，2013，8（10）：e76273

［12］孫國，梁程博，趙芳，等. 15種熊蜂全基因組SSR分布規(guī)律研究［J］. 南方農(nóng)業(yè)學報，2023，54（11）：3378-3387

［13］WANG L，LIU S，TANG Y，et al. Using the combined gene approach and multiple analytical methods to improve the phylogeny and classification of Bombus （Hymenoptera，Apidae） in China［J］. Zookeys，2020，1007：1

［14］WILLIAMS P H，BROWN M J，CAROLAN J C，et al. Unveiling cryptic species of the bumblebee subgenus Bombus s. str. worldwide with COI barcodes （Hymenoptera：Apidae）［J］. Systematics and Biodiversity，2012，10（1）：21-56

［15］LIN G，HUANG Z，WANG L，et al. Evolutionary rates of bumblebee genomes are faster at lower elevations［J］. Molecular Biology and Evolution，2019，36（6）：1215-1219

［16］SADD B M，BARRIBEAU S M，BLOCH G，et al. The genomes of two key bumblebee species with primitive eusocial organization［J］. Genome biology，2015，16（1）：1-32

［17］毛軒睿，劉玉萍，蘇旭，等. 沙鞭轉(zhuǎn)錄組簡單重復序列（SSR）位點特征分析［J］. 草地學報，2022，30（8）：1990-2001

［18］甘麗萍，田輝，唐恒，等. 6種鱗翅目昆蟲全基因組SSR分布規(guī)律［J］. 基因組學與應用生物學，2021，40（3）：1022-1030

［19］王日芳，李健，李吉濤，等. 脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）近交系3個家系33個微衛(wèi)星座位的遺傳分析［J］. 漁業(yè)科學進展，2017，38（4）：78-86

［20］ZHOU L，LIU T，CHENG Y，et al. Molecular mapping of a stripe rust resistance gene in Chinese wheat landrace “Hejiangyizai” using SSR，RGAP，TRAP，and SRAP markers［J］. Crop Protection，2017，94：178-184

［21］李東宇，孔杰，孟憲紅，等. 凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及其在家系親權鑒定中的應用［J］. 漁業(yè)科學進展，2016，37（3）：58-67

［22］TAKEUCHI T，TAKAHASHI M，NISHIMOTO M，et al. Genetic structure of the bumblebee Bombus hypocrita sapporoensis，a potential domestic pollinator for crops in Japan［J］. Journal of Apicultural Research，2018，57（2）：203-212

［23］CEJAS D，DE LA RU′A P，ORNOSA C，et al. Spatial and temporal patterns of genetic diversity in Bombus terrestris populations of the Iberian Peninsula and their conservation implications［J］. Scientific Reports，2021，11（1）：22471

［24］JIANG L，SCHLESINGER F，DAVIS C A，et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments［J］. Genome research，2011，21（9）：1543-1551

［25］郁偉杰，苗一凡，穆海婷，等. 轉(zhuǎn)錄組學解析紫花苜蓿雄性不育系花粉敗育機制［J］. 草地學報，2023，31（6）：1702-1713

［26］WANG Y，ZENG X，IYER N J，et al. Exploring the switchgrass transcriptome using second-generation sequencing technology［J］. Plos One，2012，7（3）：e34225

［27］熊翠玲，張璐，付中民，等. 基于RNA-seq數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)中華蜜蜂幼蟲的SSR分子標記［J］. 環(huán)境昆蟲學報，2017，39（1）：68-74

［28］高平，李麗芳，蘭明先，等. 澤蘭實蠅雌雄成蟲轉(zhuǎn)錄組及差異分析［J］. 應用昆蟲學報，2021，58（2）：289-299

［29］劉華偉，李朝緒，李芬，等. 椰心葉甲嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組分析及基因功能注釋［J］. 中國生物防治學報，2021，37（3）：412-419

［30］ZHANG L，YANG X，QI X，et al. Characterizing the transcriptome and microsatellite markers for almond （Amygdalus communis L.） using the Illumina sequencing platform［J］. Hereditas，2018，155：1-9

［31］周婉，徐琢，楊文俊，等. 夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組及化學感受相關基因的分析［J］. 植物保護，2022，48（6）：264-277

［32］王予彤，徐林波，段立清，等. 綠眼賽繭蜂轉(zhuǎn)錄組分析及嗅覺相關蛋白基因的鑒定［J］. 應用昆蟲學報，2021，58（4）：846-855

［33］郭睿，陳華枝，莊天藝，等. 利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)意大利蜜蜂的SSR分子標記［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2018，45（3）：404-408

［34］HUANG Q，SUN P，ZHOU X，et al. Characterization of head transcriptome and analysis of gene expression involved in caste differentiation and aggression in Odontotermes formosanus （Shiraki）［J］. Plos One，2012，7（11）：e50383

［35］XIE W，MENG Q，WU Q，et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci transcriptome reveals a highly diverse bacterial community and a robust system for insecticide resistance［J］. Plos One，2012，7（4）：e35181

［36］BISWAS M K，CHAI L，MAYER C，et al. Exploiting BAC-end sequences for the mining，characterization and utility of new short sequences repeat （SSR） markers in Citrus［J］. Molecular Biology Reports，2012，39：5373-5386

［37］冷春蒙，李引，胡迪，等. 梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組及SSR分子標記分析［J］. 昆蟲學報，2018，61（11）：1272-1283

［38］郭歡，王剛，張樹田，等. 基于RNA-seq數(shù)據(jù)的窄足真蚋SSR分子標記開發(fā)［J］. 昆蟲學報，2018，61（7）：815-824

［39］王暉，王敬，高妍夏，等. 基于家蠶轉(zhuǎn)錄組測序的SSR序列分析［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學，2022，54（1）：14-20

［40］南彥斌，許嘉誠，何啟玥，等. 青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組分析及SSR位點開發(fā)［J］. 草地學報，2023，31（9）：2653-2662

［41］THAO D，YAMASHITA M，WATANABE A，et al. Development of tetranucleotide microsatellite markers in Pinus kesiya Royle ex Gordon［J］. Conservation Genetics Resources，2013，5：405-407

（責任編輯 閔芝智）