垂穗披堿草根際促生菌的分離鑒定及促生作用研究

摘要：優(yōu)良的根際生長(zhǎng)促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)微生物菌肥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究以廣布于青藏高原的垂穗披堿草（Campeiostachys nutans Griseb.）為材料，采用平板劃線法分離其PGPR，探究菌株的促生特性，通過16S 測(cè)序確定菌株的分類地位，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證PGPR的促生效果。結(jié)果表明，從垂穗披堿草根際土篩選出14株促生特性優(yōu)良的PGPR，其中，有11株兼具產(chǎn)IAA，ACC脫氨酶以及鐵載體的能力。經(jīng)16S rDNA鑒定，以假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，6株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），2株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），2株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），其他四株分別屬于類節(jié)桿菌屬（Paenarthrobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和考克氏菌屬（Kocuria）。盆栽試驗(yàn)表明，接種14株菌株對(duì)多年生黑麥草具有良好的促生效果，并能夠提高其光合效率。研究結(jié)果豐富了植物根際促生菌菌種資源庫(kù)，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)“綠色增產(chǎn)”提供優(yōu)質(zhì)菌肥種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：青藏高原；垂穗披堿草；根際促生菌；分離篩選；促生作用

中圖分類號(hào)：Q939.96"" "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1693-09

Screening and Promoting Effects of Plant Growth-Promoting Bacteria from

Rhizosphere of Campeiostachys nutans Griseb.

REN Zhi-hui1， YU Qiao1， GAO Shi-kong2， WANG Jia-ju1， NIU De-peng2， LIU Mei-li2，

HU Tian-ming1*， FU Juan-juan1*

（1.Department of Grassland Science， College of Grassland Agriculture， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100，

China;2. Shenmu Animal Husbandry Development Center， Yulin， Shaanxi Province 719300， China）

Abstract：The excellent plant growth-promoting rhizobacteria （Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR） serve as a crucial material foundation for the production of high-quality microbial fertilizers. In this study，the streak plate method was employed to isolate PGPR from Campeiostachys nutans Griseb.，which widely distributed in the Qinghai-Tibet Plateau. We investigated the growth promoting characteristics of the isolated strains. Furthermore，the classification status of the strains was determined by 16S sequencing，and the growth promoting effect of PGPR was verified by pot experiment. The results revealed that 14 strains of PGPR with outstanding growth promotion abilities were screened from the rhizosphere soil of C. nutans，in which 11 strains among them exhibited capabilities to produce indole-3-acetic acid （IAA），ACC deaminase，and iron carriers. Based on 16S rDNA identification，Pseudomonas emerged as the dominant strain with six representatives belonging to this genus，two strains belonging to Bacillus and another two strains belonging to Staphylococcus. The remaining four strains were classified as Arthrobacter，Microbacterium，Acinetobacter，and Kocuria genera respectively. A pot experiment demonstrated that inoculation with these 14 strains had a significant positive impact on the growth of Lolium perenne. Moreover，all strains enhanced the photosynthetic efficiency of L. perenne，compared to non-inoculation. The present study enriched the germplasm bank of rhizosphere growth-promoting bacteria，and also provided valuable resources for high-quality bacterial fertilizer germplasm，thus contributing to agricultural sustainable development.

Key words：Qinghai-Tibet Plateau;Campeiostachys nutans Griseb.;Plant growth-promoting rhizobacteria;Isolation and screening;Plant growth-promoting effects

在過去幾十年里，我國(guó)過量的施用化肥導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降和農(nóng)田環(huán)境污染問題，影響了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，嚴(yán)重威脅著食品安全和公眾健康［1］。在我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)、農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展戰(zhàn)略、鄉(xiāng)村振興和“一控兩減三基本”戰(zhàn)略背景下，減少農(nóng)藥和化肥使用量勢(shì)在必行。微生物肥料是支撐農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的綠色投入品，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力［2］。張福鎖院士提出通過根際生命共同體實(shí)現(xiàn)第三階段減肥增產(chǎn)目標(biāo)［3］。因此，挖掘植物根際生長(zhǎng)促生菌資源，對(duì)于實(shí)現(xiàn)我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色增產(chǎn)具有重要意義。

植物根際促生菌（PGPR）作為一種定殖在植物根系周圍的有益細(xì)菌，能夠發(fā)揮直接或間接的機(jī)制，如分泌植物激素、固氮、溶磷和產(chǎn)生抗生素等來促進(jìn)植物生長(zhǎng)［4-5］。目前已經(jīng)報(bào)道的PGPR包括芽孢桿菌、假單胞菌、窄養(yǎng)單胞菌、沙雷氏菌、偶氮螺旋菌和關(guān)節(jié)桿菌等［6-8］。許多研究表明，接種植物生長(zhǎng)促生菌能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，同時(shí)能夠提高植物的抗逆性［2］。這些研究表明微生物肥料作為傳統(tǒng)肥料的替代品能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)［9］。在我國(guó)，PGPR的研究和應(yīng)用已取得了一定的成果。但仍需進(jìn)一步挖掘優(yōu)異的PGPR菌株資源，并深入開展其作用機(jī)制研究，明確PGPR對(duì)不同植物的促生作用，從而實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的微生物菌肥生產(chǎn)和利用。

本研究以廣布于青藏高原的垂穗披堿草為研究對(duì)象，分離其根際生長(zhǎng)促生菌并明確其促生特性，通過盆栽試驗(yàn)探討根際生長(zhǎng)促生菌對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)和光合生理的影響，以期為應(yīng)用本研究分離的植物生長(zhǎng)促生菌開展微生物菌肥的研制和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

垂穗披堿草采集于青海省海北藏族自治州海晏縣西海鎮(zhèn)國(guó)家牧草種質(zhì)資源圃（36°59′N，100°53′E，海拔3 156 m）。2021年7月選擇長(zhǎng)勢(shì)健康的垂穗披堿草，采集具有完整牧草根系的樣方（長(zhǎng)×寬×高為10 cm×10 cm×15 cm），采集 5個(gè)樣方。將帶有根系的植株裝入滅菌的塑封袋中，置于冰盒中保存，在實(shí)驗(yàn)室用干凈的毛刷將緊挨著根系的土壤采集到滅菌的離心管里，存儲(chǔ)于-80℃冰箱，用于PGPR的分離與篩選。

1.2 植物根際促生菌的分離和篩選

取根際土壤樣品 2 g加入 100 mL無菌水中，梯度稀釋至 10-6，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，各取 0. 1 mL稀釋液（10-1～10-6）涂布LB固體培養(yǎng)基，放置于恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：溫度28℃，相對(duì)濕度80%，光期/暗期16/8 h），培養(yǎng)24～72 h后根據(jù)菌落形態(tài)挑取菌株進(jìn)行鑒定。在LB固體培養(yǎng)基上，將選擇的菌株經(jīng)3次平板劃線法進(jìn)行純化，將純化好的菌株加入50%的甘油置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株促生特性分析

參考Gordon等［10］的方法，采用Salkowski′s比色液顯色反應(yīng)測(cè)定菌株分泌吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）的能力；菌株產(chǎn)ACC脫氨酶和鐵載體能力的測(cè)定參考湯子祥［11］優(yōu)化的方法，使用SM，SMA和SMN培養(yǎng)基，根據(jù)酶標(biāo)儀下600 nm波長(zhǎng)下的吸光值判斷菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的能力；使用CAS檢測(cè)液，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光值（A）和參比值（Ar），以A/Ar的大小表示菌株產(chǎn)鐵載體能力的強(qiáng)弱（A/Ar值為0.5～0.75時(shí)用“++”表示，0.75～1.0時(shí)用“+”表示，gt;1.0時(shí)用“-”表示）。

1.4 菌株16S rDNA基因序列分析

以菌液為模板，利用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得待檢測(cè)菌株的16S rDNA基因序列。PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 3 min，變性95℃ 15 s，退火53℃ 15 s，延伸72℃ 50 s，徹底延伸72℃ 5 min，4℃保持，其中擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系為30 μL，其中2×Rapid Taq Master Mix 15 μL，上下游引物各1.2 μL，DNA 1.2 μL，ddH2O 11.4 μL。PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)目的片段大小，PCR產(chǎn)物純化后，送擎科生物有限公司測(cè)序。將獲得的 16S rDNA序列與NCBI的Genbank基因庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。分別下載相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列，采用MEGA11軟件以鄰接法聚類分析，構(gòu)建所測(cè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為3000。

1.5 菌株促生效果驗(yàn)證

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)所用土壤樣品采集于溫室外部試驗(yàn)田。使用7 cm×7 cm的黑色塑料花盆，將大小均勻、飽滿的多年生黑麥草種子均勻點(diǎn)播于花盆中，每個(gè)花盆25粒種子。為使土壤更接近田間持水量，在種子萌發(fā)后，每3天用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液灌溉一次［12］。播種20天后進(jìn)行接菌處理，將OD600=1.0的菌懸液接種于每株幼苗根部周圍，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，連續(xù)接種10天后，停止接種。對(duì)照組澆等量無菌水。

1.5.2 指標(biāo)測(cè)定 停止接種10天后，使用卷尺測(cè)量地上部分的自然高度作為株高；測(cè)量單株幼苗最寬處記為葉片寬度；將多年生黑麥草沿著土壤表面剪下并稱重作為地上生物量；采用手持式葉綠素分析儀（SPAD-502）測(cè)定葉片的SPAD值；Li6400 光合儀（LI-6400 XT，LI-COR，NE，USA）于晴天上午（9：00—11：30）進(jìn)行光合參數(shù)的測(cè)定，測(cè)定時(shí)采用開放氣路，將葉室CO2濃度設(shè)置為 400 μmol·m-2·s-1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 27軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，并以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。在P lt; 0.05的顯著性水平下，采用Duncan多重比較檢驗(yàn)。使用Origin 2022，Microsoft Excel 2021以及MEGA11軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及促生特性分析

通過平板試驗(yàn)和促生特性試驗(yàn)初步篩選發(fā)現(xiàn)，有14株菌均能產(chǎn)生IAA，ACC脫氨酶，其中有11株菌同時(shí)能產(chǎn)生鐵載體，菌株編號(hào)為HB9，HB24，HB33，HB51，HB57，HB61，HB105，HB106，HB118，HB123，HB130（圖1）。

采用Salkowski′s顯色反應(yīng)測(cè)定14株垂穗披堿草根際細(xì)菌是否能夠產(chǎn)生IAA。以未接種培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，測(cè)定菌株OD630的吸光值，結(jié)果表明各細(xì)菌IAA分泌量范圍為6.69～10.40 μg·mL-1（圖1A）。

采用以 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）為唯一氮源的培養(yǎng)基（SMA）培養(yǎng)供試菌株，采用酶標(biāo)儀測(cè)定 600 nm波長(zhǎng)處的吸光值，來判斷菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶的能力，結(jié)果表明各細(xì)菌的OD600處的吸光值范圍為0.095～0.727（圖1B）。

采用CAS檢測(cè)液測(cè)定菌株的產(chǎn)鐵載體能力，通過測(cè)定OD630的吸光度值，發(fā)現(xiàn)菌株HB9，HB24，HB33，HB51，HB57，HB61，HB105，HB106，HB118，HB123和HB130具有產(chǎn)生鐵載體的能力，其鐵載體含量（A/Ar）范圍為0.81～0.99，產(chǎn)鐵載體能力為+（圖1C）。

2.2 菌株16S rDNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

將供試菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank中其他菌株的 16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，14株菌株的16SrDNA基因序列與對(duì)比序列的相似度均高于99%（表1）。它們分別來自7個(gè)屬的10個(gè)種，其中有6株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）；2株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）；2株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）；另外4株分別屬于類節(jié)桿菌屬（Paenarthrobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和考克氏菌屬（Kocuria）。假單胞菌屬中，菌株HB24和HB57初步鑒定為Pseudomonas brassicacearum，菌株HB33和HB511初步鑒定為Pseudomonas salomonii，菌株HB61和HB130初步鑒定為Pseudomonas sp.；芽孢桿菌屬中，菌株HB122初步鑒定為Bacillus subtilis，菌株HB123初步鑒定為Bacillus cereus；葡萄球菌屬中，菌株HB105和HB129初步鑒定為Staphylococcus pasteuri；節(jié)桿菌屬中，菌株HB9初步鑒定為Paenarthrobacter nitroguajacolicus；微桿菌屬中，菌株HB106初步鑒定為Microbacterium natoriense；不動(dòng)桿菌屬中，菌株HB111初步鑒定為Acinetobacter calcoaceticus；考克氏菌屬中，菌株HB118初步鑒定為Kocuria palustris（圖2）。

2.3 14株P(guān)GPRs的促生效果分析

通過盆栽試驗(yàn)，開展14株根際生長(zhǎng)促生菌對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的促生作用。研究發(fā)現(xiàn)各菌株均能夠促進(jìn)多年生黑麥草幼苗的生長(zhǎng)（圖3）。其中，菌株61和106對(duì)株高的促生作用最佳，分別較CK增加40.24%和38.82%（Plt;0.05）（圖3A）；菌株9和123顯著提高了葉片寬度，較CK增加50.3%和50.1%（Plt;0.05）（圖3B）；接種供試的14株菌均能顯著提高多年生黑麥草幼苗的地上生物量，較CK增加80%～110%（Plt;0.05）（圖3C）。

2.4 14株P(guān)GPRs對(duì)多年生黑麥草光合指標(biāo)的影響

與未接菌對(duì)照相比，供試14株根際生長(zhǎng)促生菌能夠提高多年生黑麥草幼苗的光合效率（圖4）。菌株123能夠顯著提高多年生黑麥草幼苗的葉綠素含量，較CK增加55.88%（Plt;0.05）（圖4A）。與CK相比，接種14株P(guān)GPR后，多年生黑麥草的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均有不同程度的上升，胞間二氧化碳濃度均下降，其中，凈光合速率在不同菌株處理后增加1.92%～14.94%（Plt;0.05）（圖4B）；氣孔導(dǎo)度在不同菌株處理后增加13.91%～53.18%（Plt;0.05）（圖4D）；蒸騰速率在不同菌株處理后增加2.33%～36.96%（Plt;0.05）（圖4E）；胞間二氧化碳濃度在不同菌株處理后降低6.94%～43.74%（Plt;0.05）（圖4C）。

3 討論

過量施用化肥對(duì)農(nóng)田土壤及生態(tài)環(huán)境帶來了顯著負(fù)面影響，因此PGPR菌肥應(yīng)運(yùn)而生［13］。作為一種綠色、高效的生物肥料，PGPR菌肥具有促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)、增加土壤養(yǎng)分的作用，進(jìn)而降低作物對(duì)化肥的依賴，有利于改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境［14-15］。在我國(guó)，PGPR的研究和應(yīng)用已取得了一定的成果。但仍需進(jìn)一步深入研究不同PGPR菌株對(duì)不同植物的促進(jìn)作用，以滿足多樣化植物的需求。

本研究篩選出14株能同時(shí)產(chǎn)生IAA和ACC脫氨酶的菌株，其中，有11株能同時(shí)產(chǎn)生IAA，ACC脫氨酶以及鐵載體。IAA在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少，由根際微生物分泌的IAA可促進(jìn)植物地上部分的生長(zhǎng)［16］。本研究篩選出的14株P(guān)GPR均能夠分泌IAA，且均能促進(jìn)黑麥草的生長(zhǎng)，這與Noori等［17-18］的研究結(jié)果一致。自Honma等［19］首次從土壤中分離出產(chǎn)ACC脫氨酶菌株并證實(shí)其促生特性以來，各國(guó)學(xué)者相繼從多種生境中篩選到產(chǎn)ACC脫氨酶的菌株［20］，本研究中14株P(guān)GPR均能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶并且對(duì)黑麥草具有促生效果。與之相似，李明源等［21］從鹽爪爪根際篩選的26株產(chǎn)ACC脫氨酶菌株能夠明顯促進(jìn)擬南芥幼苗生長(zhǎng)。有產(chǎn)鐵載體能力的PGPR可直接供給植物鐵營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)［22-23］。本研究中有11株P(guān)GPR能夠產(chǎn)生鐵載體且對(duì)多年生黑麥草具有促生效果，這與關(guān)雪梅等［24］的研究結(jié)果一致。

大量研究表明，假單胞菌屬是土壤中最豐富的菌群之一，在維持土壤肥力和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面起著重要作用［25-26］。Purtschert-Montenegro等［27］的研究表明，假單胞菌能利用多種碳源和氮源底物，適應(yīng)不同的環(huán)境，而且其耐受性強(qiáng)、促生防病效果明顯，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本研究中的14株P(guān)GPR經(jīng)16S r DNA基因序列比對(duì)后，結(jié)果顯示假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢(shì)菌，表明垂穗披堿草根際假單胞菌同樣存在巨大應(yīng)用潛力。

根際促生菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量的作用［28］。汪敦飛等［29］的研究表明，銅綠假單胞菌通過增強(qiáng)水稻光合效率、提高抗氧化酶活性和類黃酮類抗氧化物質(zhì)含量從而提高水稻的鎘脅迫抗性。在本研究中，14株P(guān)GPR均表現(xiàn)出對(duì)黑麥草株高、葉片寬度、地上生物量、葉綠素含量的顯著提高作用以及對(duì)光合指標(biāo)的促進(jìn)作用。這與前人的研究結(jié)果一致［30-32］。以上研究表明接種根際生長(zhǎng)促生菌能夠部分代替?zhèn)鹘y(tǒng)化肥，有助于實(shí)現(xiàn)作物綠色增產(chǎn)。

PGPR的根際定殖受到多種生物環(huán)境因素和非生物因素的共同影響［33-35］，包括宿主植物種類、根系分泌物、以及土壤溫度、含氧量等，這些因素可能綜合影響了菌株的促生效果，因此，后續(xù)我們還會(huì)在此研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究多種環(huán)境因素下，這14株P(guān)GPR的促生效果。

4 結(jié)論

本研究從青藏高原垂穗披堿草根際土中篩選鑒定的14株P(guān)GPR以假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，14株P(guān)GPR均能夠通過產(chǎn)IAA，ACC脫氨酶、鐵載體促進(jìn)黑麥草幼苗的生長(zhǎng)，提高其光合效率。本研究為微生物菌劑的研制提供了優(yōu)異的菌種資源。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）