一種羊肚菌病原真菌的分離鑒定及防治措施

摘 要：為探明在河南省鄭州市地區(qū)危害羊肚菌較為嚴(yán)重的病害及病原菌種類，采集發(fā)病的羊肚菌子囊果，對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察及ITS序列比對分析。結(jié)果顯示：菌絲在PDA平板上的生長速度極慢，培養(yǎng)14 d后，菌落為直徑約為5 cm的近似圓形，菌絲濃密潔白、呈絨毛狀，可見類似年輪的多層次圓圈，在40倍電子顯微鏡下能觀察到菌絲光滑無色，分生孢子由菌絲膨大、隔膜處凹陷形成。同時，病原菌ITS序列與已公開的［Diplo?spora］ longispora strain SY1和［Diplo?spora］ longispora strain SY1Y2菌株的一致性達(dá)到100%，從而確定該病原菌為長卵單隔孢霉（Diplo?spora longispora），這與霉菌性枯萎病病原菌一致。為避免因該病害的暴發(fā)而造成經(jīng)濟(jì)損失，提出“以防為主，綜合防控”的防治原則，對發(fā)生過霉菌性枯萎病的栽培場地，應(yīng)采取加強土壤處理、合理輪作、科學(xué)播種、強化菌絲生長期與出菇期管理、合理使用殺菌劑等防治措施，從而促進(jìn)羊肚菌產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。

關(guān)鍵詞：羊肚菌；霉菌性枯萎病；長卵單隔孢霉；分子學(xué)鑒定

中圖分類號：S436.461 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1674-7909（2024）2-71-5

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.02.015

0 引言

羊肚菌是一種珍稀的食藥兼用真菌，其味道鮮美，含有大量的鮮味氨基酸——谷氨酸和天氨酸（二者占羊肚菌氨基酸總量的27%左右）。同時，羊肚菌的營養(yǎng)價值高，其優(yōu)質(zhì)蛋白含量在20%以上，亞油酸含量最高可達(dá)72.8%，氨基酸含量更是遠(yuǎn)高于常規(guī)食用菌［1-3］，被稱為“素中之葷”，深受廣大消費者喜愛。相關(guān)研究表明，羊肚菌具有益腸胃、補腦提神、化痰利氣、抗菌、抗氧化、抗衰老、降低膽固醇等功效，還可促進(jìn)小鼠心肌損傷的恢復(fù)、預(yù)防神經(jīng)退行性疾?。?-6］，具有極高的藥用價值。

我國從2011年開始規(guī)模化生產(chǎn)羊肚菌。羊肚菌因具有栽培周期短、不影響其他作物種植、生產(chǎn)管理簡便、投資回報率高等優(yōu)點，從而受到各地政府相關(guān)部門、企業(yè)和農(nóng)戶的青睞，其種植面積迅速擴大，從一開始的云南省、四川省等地，發(fā)展到除海南省以外的全國各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）。2012年，全國羊肚菌種植面積為200 hm2，每667 m2的產(chǎn)量為50 kg；2023年，全國羊肚菌種植面為2.267萬 hm2，每667 m2的平均產(chǎn)量為400 kg［7-9］。在羊肚菌種植面積迅速擴大的同時，將近70%的種植戶處于虧損狀態(tài)，造成這一問題的主要原因有菌種選擇不當(dāng)、栽培管理不規(guī)范、對極端性天氣的防控不足及病蟲害防治不科學(xué)等。不同于普通的食用菌，羊肚菌開放式的大田栽培模式及蜂窩狀的子實體表面，使得栽培環(huán)境中的微生物或害蟲極易附著在羊肚菌表面，從而使其容易被雜菌污染，再加上出菇期高溫高濕的生長環(huán)境也會導(dǎo)致病蟲害迅速蔓延。此外，在種植過羊肚菌或發(fā)生過病害的栽培場地中，如果不及時做好病蟲害防控工作，則極易出現(xiàn)病蟲害大面積暴發(fā)的情況，進(jìn)而造成羊肚菌產(chǎn)量及品質(zhì)下降，甚至出現(xiàn)絕收的情況，嚴(yán)重制約羊肚菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，對羊肚菌病蟲害防治的研究亟待進(jìn)一步加強。作為科研工作者，要使菇農(nóng)知道如何提前做好土壤處理工作，從而預(yù)防病蟲害發(fā)生，同時使菇農(nóng)掌握病蟲害處理方法，避免造成經(jīng)濟(jì)損失。

在羊肚菌栽培過程中，常見的病害包括軟腐病、紅體病2種細(xì)菌性病害和鐮刀菌、霉菌性枯萎病和蛛網(wǎng)病3種真菌性病害，常見的害蟲有跳蟲、蚊蠅和蛾類幼蟲、蝸牛、蛞蝓、鼠婦等［10］。由于真菌性病害具有隱蔽性強、發(fā)病速度快等特點，導(dǎo)致在羊肚菌栽培過程中真菌性病害的危害較大，防治難度也最大。

目前，對羊肚菌細(xì)菌性病害的病原菌研究還未見報道，對羊肚菌真菌性病害及病原菌種類的研究報道已陸續(xù)公開。He等［11］在羊肚菌子實體上首次觀察到霉菌性枯萎病，并于2018年通過形態(tài)學(xué)及分子鑒定確定了霉菌性枯萎病的病原菌為長孢卵單隔孢霉（Diplo?spora longispora）；劉偉［10］在2019 年發(fā)現(xiàn)了一種新的病害，并將其命名為“蛛網(wǎng)病”，還提出防治方法，但未確定該病原菌種類；2020 年，余苗等［12］發(fā)現(xiàn)了一種新的羊肚菌真菌性病害——白腐病，并確定病原菌為曲霉（Aspergillus）；2020年，Zhang等［13］發(fā)現(xiàn)匐枝根霉（Rhizopus" stolonifer）也會對羊肚菌的生長發(fā)育造成危害。2018—2020年，筆者通過連續(xù)調(diào)查試驗基地羊肚菌病害的發(fā)生情況，在種植的第3年，發(fā)現(xiàn)大量被白色病原菌菌絲包裹的羊肚菌幼小子實體，甚至是剛開始分化的原基都被該種菌絲覆蓋，并在出菇期迅速蔓延，嚴(yán)重影響了原基的分化及幼菇的發(fā)育，直接造成大面積減產(chǎn)，甚至絕收。為探明該病原菌的種類，多點采集發(fā)病的羊肚菌子囊果，并進(jìn)行病原菌分離和鑒定，以期為病害防治提供理論支撐，同時提出更科學(xué)合理的防治措施。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：發(fā)病的羊肚菌子囊果（采集地點為鄭州市農(nóng)業(yè)科技研究院須水試驗基地）；供試培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基；主要試劑及設(shè)備：真菌基因組DNA 提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）、DL2000 DNA Maker和引物（均購自上海生工生物有限公司）、離心機、水浴鍋、電泳儀、凝膠成像儀、PCR儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 病害特征調(diào)查及病原菌的分離

連續(xù)3年（2018—2020年）對須水試驗基地的羊肚菌大棚進(jìn)行病害調(diào)查，并記錄發(fā)病情況。在發(fā)生羊肚菌病害的大棚內(nèi)進(jìn)行多點采集，并將采集到的染病子實體放入無菌自封袋內(nèi)，做好標(biāo)記，盡快帶回實驗室。在實驗室超凈工作臺上，用無菌水沖洗病斑表面，之后用消過毒的接種鉤挑取病斑處的菌絲，并接種到PDA培養(yǎng)基上。在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，選取菌落邊緣處的菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，多次純化培養(yǎng)后得到病原菌，并放在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將活化后的病原菌用8 mm的打孔器轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，放入22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并測量菌落直徑。待其產(chǎn)生分生孢子后挑取菌絲，并將其置于顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

1.2.3 病原菌分子學(xué)鑒定

收集活化后的病原菌菌絲，并置于無菌的研缽內(nèi)用液氮進(jìn)行研磨，然后用真菌基因組DNA提取試劑盒（按照說明書中規(guī)定步驟）來提取菌絲體總DNA。隨后合成引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）、ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇），并對病原菌進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS） rDNA PCR擴增， PCR反應(yīng)體系25 μL如下：E Taq mix（2X Taq PCR StarMix with）12.5 μL、上游引物（ITS1）1 μL、下游引物（ITS4）1 μL、總DNA模板1 μL、Q水9.5 μL。PCR擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30個循環(huán)后在72 ℃保持 5 min，擴增完后4 ℃保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR回收產(chǎn)物送到上海生物工程基因有限公司進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對，從而確定病原菌種類。

2 結(jié)果分析

2.1 病害調(diào)查及病原菌分離

染病的羊肚菌子囊果表現(xiàn)癥狀如圖1所示。病害調(diào)查顯示，在試驗基地大棚內(nèi)，第1年出菇期未見該真菌性病害發(fā)生，第2年出菇期偶見綠霉及少量病害發(fā)生。在連續(xù)種植的第3年，不同品種中該病的發(fā)病率為60%～90%，羊肚菌大棚內(nèi)出現(xiàn)大量幼小原基及子囊果被白色菌絲包裹的情況，菌絲呈絨毛狀［見圖1（a）］，后期會出現(xiàn)白色粉末［見圖1（b）］。隨著時間的推移，侵染部位出現(xiàn)凹陷、皺縮的情況［見圖1（c）］，前期多發(fā)在菌蓋處，也會發(fā)生在菌柄處。催菇后25 ℃以上的高溫高濕環(huán)境中，該病害會快速蔓延到周圍土壤中，造成成片的原基發(fā)病，并停止生長。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

采集10株染病的羊肚菌子囊果進(jìn)行分離，共得到5株病原菌（Z1～Z5）。在PDA平板上培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，5株病原菌的菌落形態(tài)一致，菌絲生長速度很慢，培養(yǎng)3 d后的菌落直徑在1.5 cm左右，培養(yǎng)14 d后的菌落為直徑約5 cm的近圓形，菌絲濃密潔白、呈絨毛狀，可見類似年輪的多層次圓圈［見圖2（a）］。在40倍顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)，顯示菌絲光滑無色，分生孢子由菌絲膨大、隔膜處凹陷形成［見圖2（b）］，形態(tài)特征與He等［11］的描述一致，初步鑒定該病原菌為長孢卵單隔孢霉。

2.3 病原菌分子學(xué)鑒定

選取Z1和Z2兩個菌株的基因組DNA，通過PCR擴增ITS序列，電泳條帶結(jié)果見圖3。由圖3可知，單一條帶長度為500～750 bp。同時，測序結(jié)果顯示，序列長度分別為550 bp、545 bp，將序列提交到NCBI中進(jìn)行在線比對，確定Z1和Z2兩個菌株的序列為［雙孢屬］ 長孢屬菌株［Diplo?spora］ longispora strain核糖體RNA基因的部分序列，分子鑒定結(jié)果為長孢卵單隔孢霉（見表1和表2），Z1與［Diplo?spora］ longispora strain SY1菌株的一致性達(dá)到100%、Z2與［Diplo?spora］ longispora strain Y2菌株的相似性高達(dá)100%。將Z1和Z2的測序結(jié)果在DNA MAN上進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示，二者序列的相似性為97.82%，這2種株菌很有可能是同一株菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可確定Z1、Z2菌株均為長卵單隔孢霉。

3 結(jié)論、討論及防治措施

3.1 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要靠形態(tài)學(xué)觀察，易造成具體病原菌分類不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致不同種類病害混淆，增加防治難度。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及，特別是一些保守基因序列的公布，對病原真菌的鑒定更加方便、準(zhǔn)確。白霉病和霉菌性枯萎病的發(fā)病癥狀極其相似，僅靠形態(tài)學(xué)觀察很難將二者區(qū)分開來，且霉菌性枯萎病的病原菌長卵單隔孢霉曾被誤認(rèn)為長毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus）［14］，但二者最大的差異在于長卵單隔孢霉的分生孢子有橫隔，而長毛擬青霉沒有橫隔。因此，在對病原真菌進(jìn)行分類鑒定時，要結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和保守基因序列進(jìn)行分析，從而實現(xiàn)更科學(xué)準(zhǔn)確的分類。

筆者通過對染病子實體上分離的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征分析及分子鑒定，從而確定該病原菌為長孢卵單隔孢霉，這與He等［11］首次發(fā)現(xiàn)的霉菌性枯萎病病原菌一致，但也有學(xué)者將霉菌性枯萎病稱為菌蓋干腐病。霉菌性枯萎病是一種嚴(yán)重的真菌性病害，以侵染菌蓋為主，也會侵染菌柄，受侵染的部位會出現(xiàn)破損、空洞現(xiàn)象，造成子囊果畸形。該病原菌在環(huán)境溫度高于22 ℃時極易發(fā)生，加之環(huán)境濕度大，會在1～2 d內(nèi)迅速包裹整個子實體，后期會出現(xiàn)粉末感，甚至蔓延至周邊的原基［1］。目前，在四川省、湖北省、河南省、陜西省、貴州省等地都發(fā)現(xiàn)該種病害。當(dāng)前大面積推廣的六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌品種易感染的霉菌性枯萎?。?0］是羊肚菌栽培過程中危害最嚴(yán)重的三大真菌性病害之一，防治難度大，給菇農(nóng)造成極大損失，還未見有效的藥劑防治方法，以預(yù)防為主。

3.2 防治措施

目前，對霉菌性枯萎病的病原菌種類及培養(yǎng)特性的研究被陸續(xù)報道出來，但對霉菌性枯萎病病原菌的防治措施及有效藥劑篩選的研究相對較少，再加上羊肚菌和長卵單隔孢霉同為真菌，因而對霉菌性枯萎病的防治較為困難。王幫香［15］探究了大蒜、朝天椒、花椒、生姜、魚腥草等抑菌蔬菜和中草藥植物提取物對羊肚菌真菌性病害的抑制效果，但并未提到霉菌性枯萎病，可進(jìn)一步研究。付博等［16］和黃慧等［17］先分離霉菌性枯萎病的病原菌，通過形態(tài)學(xué)特征、致病性特征和ITS序列比對，再次確認(rèn)病原菌分類為長孢卵單隔孢霉，同時對長卵單隔孢霉的培養(yǎng)特性進(jìn)行探究，確定最適培養(yǎng)基、碳源、氮源、pH值及生長溫度。黃慧等［17］提出當(dāng)pH 值超過8時，會抑制羊肚菌菌絲的生長，且其認(rèn)為目前普遍使用的生石灰覆蓋消毒并不能有效控制霉菌性枯萎病在土壤中的蔓延，還會降低羊肚菌產(chǎn)量，并根據(jù)長卵單隔孢霉對高溫的敏感，提出采收后采取火焰高溫燃燒方式對發(fā)病后的栽培地土壤進(jìn)行全面消毒，從而殺死其中潛在的病原菌。楊春等［18］通過菌絲平板培養(yǎng)和大田噴施試驗，發(fā)現(xiàn)一種口腔護(hù)理中的抑菌成分——三氯生（TCS），可有效抑制未滅菌環(huán)境中雜菌的生長，長卵單隔孢霉的分生孢子會隨著TCS濃度的增加而發(fā)生破裂死亡。在對染病子實體噴施TCS（40 mg/L）后，可避免長卵單隔孢霉向周邊土壤的擴散，在發(fā)病早期，可用40 mg/L的TCS懸浮液直接噴施到感染霉菌性枯萎病的子囊果上面，能阻止病原菌的蔓延。方磊等［19］探究了10種常見殺菌劑與生石灰復(fù)配后的制劑對長卵單隔孢霉的抑制效果，發(fā)現(xiàn)用0.25 g/L百菌清與1.2 g/L生石灰制成的復(fù)配制劑對病原菌的抑制率達(dá)到72.73%，同時對羊肚菌菌絲無顯著抑制，可用于對該病害的防治。但上述研究中的殺菌劑還未在生產(chǎn)中進(jìn)行推廣應(yīng)用，其應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗證。

目前，對羊肚菌霉菌性枯萎病的防治依然應(yīng)堅持“以防為主，綜合防控”的原則，對發(fā)生過霉菌性枯萎病的栽培場地，可采取以下措施進(jìn)行綜合防控。①4—5月采菇結(jié)束后，徹底清除場地內(nèi)的營養(yǎng)袋、殘留菇根等，保持場地清潔。②進(jìn)行輪作，深翻土地，種植綠色植物，至第二年6月結(jié)束，再次清理各種植物殘留物，深翻土地30 cm以上，噴施殺菌劑（多菌靈、美帕曲星、氯溴異氰尿酸等），對土壤進(jìn)行殺菌。7—8月進(jìn)行土地休養(yǎng)，多次深耕土壤，進(jìn)行高溫暴曬消毒。③播種前10 d，再次對土壤進(jìn)行處理，施加草木灰（500 kg/667 m2）、有機肥（500 kg/667 m2）、微量元素肥（4 kg/667 m2），并施加枯草芽孢桿菌（30 kg/667 m2）對土壤補充營養(yǎng)，同時施加辛硫磷進(jìn)行殺蟲處理，做好病害預(yù)防工作。④播種時應(yīng)選擇菌絲活力佳、無污染的栽培種，覆土?xí)r應(yīng)注意將廂面的菌種完全覆蓋，擺放營養(yǎng)袋時應(yīng)避免袋料撒在廂面上，防止裸露在表面的麥粒、稻殼等腐殖質(zhì)滋生雜菌。⑤在菌絲生長階段，一旦發(fā)現(xiàn)廂面上出現(xiàn)雜菌，要及時將其清除。出菇期要及時摘除感染霉菌性枯萎病的子實體，同時可噴施40 mg/L 的TCS懸浮液，避免病害進(jìn)一步發(fā)展蔓延。

下一步，將借鑒其他食用菌和其他病原真菌的防治思路，從植物源農(nóng)藥、抑菌植物的套種和輪作、食用菌相關(guān)的殺菌劑和消毒劑、益生菌菌劑入手，探究其對長卵單隔孢霉的抑制作用，從而篩選出對病原真菌有效且不會抑制羊肚菌生長的藥劑，避免農(nóng)戶在栽培中因霉菌性枯萎病的暴發(fā)而造成經(jīng)濟(jì)損失，從而促進(jìn)羊肚菌產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。

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