基于轉錄組比較的燕麥類似貯藏蛋白在小麥面團強度性狀中的作用

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.002

收稿日期：2023-05-23

基金項目：河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新項目（2023ZC004）；河南省科技攻關項目（232102110254）

作者簡介：晁岳恩（1974-），河南濮陽人，博士，副研究員，主要從事小麥遺傳育種工作。（E-mail）nkychaoyueen@163.com

摘要：" 面團強度是影響小麥加工應用的主要品質(zhì)指標之一。為鑒定與面團強度性狀相關的貯藏蛋白編碼基因，本研究以高相對分子量麥谷蛋白亞基組合完全相同的2個品種（鄭麥366：高面團強度品種；鄭麥366雜交后代品種鄭麥369：低面團強度品種）為研究材料，比較開花后14 d、21 d、28 d的貯藏蛋白編碼基因表達差異，評估基因編碼蛋白的面團強度貢獻值，以及面粉的巰基含量差異等。結果表明，在25個顯著差異表達的貯藏蛋白編碼基因中，無高相對分子量麥谷蛋白亞基、低相對分子量麥谷蛋白亞基基因；其中鄭麥366顯著上調(diào)表達基因14個，包含8個燕麥類似蛋白編碼基因和6個醇溶蛋白編碼基因；顯著下調(diào)表達基因11個，包括10個醇溶蛋白編碼基因和1個燕麥類似蛋白編碼基因。貯藏蛋白面團強度評價模型的評分結果顯示，差異表達基因編碼的燕麥類似貯藏蛋白對面團強度性狀的貢獻值不低于優(yōu)質(zhì)麥谷蛋白亞基，暗示燕麥類似貯藏蛋白可能也是影響面團強度性狀的重要蛋白質(zhì)類型。

關鍵詞：" 小麥；燕麥類似貯藏蛋白；面團強度；自由巰基；轉錄組

中圖分類號：" S512.1;S331""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0777-08

Effect of avenin-like proteins on wheat dough strength traits based on comparative transcriptome

CHAO Yueen，" WANG Shasha，" WANG Qingchang，" HUANG Chao，" LI Wei，" SHI Feng

（Institute of Wheat Research， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China）

Abstract：" Wheat dough strength is one of the important quality indicators that can affect the processing and application of wheat. To identify genes that coding grain storage proteins （GSPs） related to dough strength quality， two wheat cultivars （cultivar Zhengmai 366， with high dough strength; cultivar Zhengmai 369， with low dough strength， which was filial generation of Zhengmai 366） with the same combination of high molecular weight-glutenin subunits （HMW-GSs） were used as the test materials in this study. Expression differences of storage proteins encoding genes were compared 14 d， 21 d and 28 d after flowering. The contribution value of gene encoding proteins to dough strength and sulfhydryl content difference of flour were evaluated. The results showed that， in 25 significantly differentially expressed GSP encoding genes， there weren’t any high or low molecular weight-glutenin subunits， and there were 14 genes of Zhengmai 366 significantly up-regulated （including eight avenin-like encoding genes and six gliadin coding genes）， 11 genes were significantly down-regulated （including ten gliadin coding genes and one avenin-like encoding gene）. The prediction results of evaluation model for dough strength of storage proteins indicated that， the avenin-like proteins encoded by differentially expressed genes may contribute more to dough strength than the elite glutenin subunit. The results suggest that maybe avenin-like proteins are also important protein types that can influence dough strength.

Key words：" wheat;avenin-like proteins;dough strength;free sulfhydryl groups;transcriptome

小麥是三大農(nóng)作物之一，是多種面食產(chǎn)品的原料。小麥面粉的獨特性在于其含有的貯藏蛋白（也稱為面筋蛋白）可以與水相互作用，形成具有黏彈性的高分子網(wǎng)狀膠狀物質(zhì)——面筋，面筋的含量與流變學特性決定著面粉的最終加工用途。

小麥的加工品質(zhì)主要由籽粒中貯藏蛋白的類型與含量決定，通常情況下小麥粉的面團強度性狀與貯藏蛋白含量呈正相關。小麥貯藏蛋白主要包括麥谷蛋白和醇溶蛋白兩類，每一類又可進一步分為若干亞類。根據(jù)相對分子量大小，麥谷蛋白可分為高相對分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）、低相對分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS）2個亞類。HMW-GS可通過自由巰基（未形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基）與其他蛋白質(zhì)的自由巰基形成分子間二硫鍵，是構建面筋骨架的最主要的蛋白質(zhì)類型，HMW-GS的含量與類型是決定面團強度性狀的主要遺傳因素。一些關于轉基因技術或突變體的研究結果也證明了HMW-GS對面團強度性狀有重要影響。不同類型的HMW-GS組合被認為是決定面粉質(zhì)量的主要遺傳因素，其中Dx5+Dy10被認為是較好的亞基組合方式。一種近年來被發(fā)現(xiàn)的、被稱為非典型面筋蛋白（Atypical gluten）類型的燕麥類似蛋白質(zhì)（Avenin-like proteins），也對面團強度性狀具有正向作用。另外，栽培措施、環(huán)境等非遺傳因素也對小麥品質(zhì)有較大影響。

雖然HMW-GS組合被認為是影響面粉質(zhì)量的主要原因，但生產(chǎn)上也存在HMW-GS組合完全一致而面粉質(zhì)量差異很大的品種。此前，我們也曾對HMW-GS組合完全相同但面粉質(zhì)量不同的2個品種間的基因表達差異進行了分析，篩選出一些可能與面團強度性狀相關的貯藏蛋白基因，其面粉質(zhì)量效應正在進一步驗證中。本研究擬對遺傳背景更為相似，但面團強度性狀不同的2個品種（鄭麥366和其雜交后代鄭麥369）間的貯藏蛋白基因表達差異進行對比，嘗試分析在遺傳背景近似、HMW-GS組合相同的情況下，導致面粉質(zhì)量變化的貯藏蛋白編碼基因表達差異。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗品種為鄭麥366和鄭麥369，鄭麥369為鄭麥366的雜交（鄭麥366×良星99）后代品種，2個材料于2019-2020年種植在河南省農(nóng)業(yè)科學院試驗基地（113°42′4″E、35°0′17″N），每品種種植2行，行長2 m，行間距24 cm，品種間距30 cm，各品種田間管理相同。轉錄組測序分析所用樣品分別取自開花后14 d、21 d、28 d的穗中部兩側籽粒，取樣后用液氮速凍帶回實驗室用-80 ℃冰箱保存，在干冰包裝條件下寄送至杭州聯(lián)川生物技術有限公司。收獲成熟籽粒用于面粉品質(zhì)分析和蛋白質(zhì)電泳。

1.2" 面粉品質(zhì)分析

蛋白質(zhì)含量（干基）采用GB/T 5009.5-2016的方法測定；濕面筋含量采用GB/T 5506.2-2008的方法測定；吸水量、面團形成時間、面團穩(wěn)定時間采用GB/T 14614-2019的方法測定，操作流程及儀器型號等參見文獻。

1.3" 貯藏蛋白的提取和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白提取方法參照文獻。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%，電泳蛋白質(zhì)上樣量為10 μl，采用考馬斯亮藍（R-250）染色。

1.4" 轉錄組測序及生物信息學分析

轉錄組分析樣品的RNA提取、測序及生物信息學分析均由杭州聯(lián)川生物技術有限公司完成，設3次生物學重復。基因差異表達倍數(shù)gt;2.0倍或lt;0.5倍，且Plt;0.05定義為差異表達基因。

1.5" 硫元素含量及巰基含量的測定

硫元素含量測定：稱量10 mg面粉，加入200 μl濃硝酸，在95 ℃下消化30 min，然后在115 ℃下消化90 min，冷卻至室溫后用超純水定容至1 ml。采用液相離子色譜測定硫元素含量，陰離子標準液來自Wako Pure Chemicals（Japan），詳細操作參照文獻。

巰基含量測定，自由巰基含量測定：取面粉15 mg加入并懸浮在1.00 ml Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.0）中，在室溫、7 600 g的條件下離心，取4.00 ml上清液加入0.04 ml DTNB （0.3%），室溫下反應15 min，以空白緩沖液作空白對照，在412 nm處測定吸光度值；總巰基含量測定：取面粉懸浮于1.00 ml Tris-甘氨酸緩沖液中，加入0.05 ml巰基乙醇和4.00 ml尿素胍鹽酸鹽溶液充分混合，室溫放置1 h，加入5.00 ml三氯乙酸（1.2%）離心并用三氯乙酸洗滌2次，將沉淀溶解在10.00 ml 8 mol/L尿素中，加入0.04 ml DTNB（0.3%），室溫下反應15 min，在412 nm處測定吸光度值。詳細操作及含量計算方法參考文獻。

1.6" 蛋白質(zhì)的質(zhì)量評價

差異表達基因編碼的蛋白質(zhì)的二硫鍵預測及蛋白質(zhì)的質(zhì)量評分方法參照文獻。

2" 結果與分析

2.1" 面粉質(zhì)量參數(shù)

從2個品種小麥面粉質(zhì)量參數(shù)（表1）可以看出，2個品種小麥面粉之間的濕面筋含量、粗蛋白含量和面團強度代表性參數(shù)（面筋指數(shù)、面團形成時間和穩(wěn)定時間）都有顯著或極顯著差異，除吸水率外鄭麥366其他所有參數(shù)均顯著或極顯著高于鄭麥369，表明鄭麥366面粉中含有較多對面團強度性狀有利的蛋白質(zhì)類型。

2.2" 面筋蛋白電泳

一般認為，HMW-GS組合是決定面粉質(zhì)量的主要遺傳因素，但從電泳結果（圖1）來看，2個品種小麥面粉的HMW-GS組合完全一致，表明HMW-GS組合可能不是導致這2個品種間面粉質(zhì)量差異的主要原因；在LMW-GS的條帶位置和濃度上2個品種間略有差異；對于醇溶蛋白，鄭麥369條帶類型較多且含量較高，這也與傳統(tǒng)上認為的醇溶蛋白與面團強度性狀之間呈負相關的看法一致。另外，對于被稱為非典型面筋蛋白的燕麥類似蛋白，目前尚未探索出可靠有效的包含所有亞類的提取方法，這類蛋白質(zhì)很可能會隨著醇溶蛋白或麥谷蛋白被提取，因此電泳結果中的蛋白質(zhì)豐度差異和相對分子量差異也有可能是燕麥類似蛋白造成的。

2.3" 貯藏蛋白的基因表達差異

從不同時間點的籽粒貯藏蛋白編碼基因表達差異情況（表2）來看，顯著差異表達的貯藏蛋白編碼基因中沒有HMW-GS相關基因，這也與蛋白質(zhì)電泳結果相似，從基因表達方面證明了HMW-GS組合不是2個品種間面團強度差異的主要原因。與電泳結果不符的是LMW-GS相關基因表達也無差異，但在3個時間點上均有燕麥類似蛋白編碼基因的相對表達量存在顯著差異，推測可能某些燕麥類似蛋白與麥谷蛋白的溶解性相似，隨著麥谷蛋白一起被提取。

FPKM：每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的測序片段數(shù)。fc：倍數(shù)變化，表示兩樣品（組）間相對表達量的比值。

2個小麥品種在3個時間點上共有25個（35次）基因顯著差異表達，其中鄭麥366中顯著上調(diào)表達基因14個（22次），顯著下調(diào)表達基因11個（13次）。在顯著上調(diào)表達的貯藏蛋白編碼基因中，包括8個燕麥類似蛋白編碼基因（13次）、6個醇溶蛋白編碼基因（9次）。在顯著下調(diào)表達基因中，包括10個醇溶蛋白編碼基因（12次）和1個燕麥類似蛋白編碼基因（1次）。

在面團穩(wěn)定時間參數(shù)較大的鄭麥366中，燕麥類似蛋白編碼基因數(shù)占顯著上調(diào)表達貯藏蛋白基因總數(shù)的一半以上（57.0%），暗示燕麥類似蛋白可能在調(diào)控面團強度性狀中有重要作用。顯著下調(diào)表達的基因中，醇溶蛋白編碼基因數(shù)占總數(shù)的90.9%，這也與一般認為的醇溶蛋白對于面團強度具有負向效應的觀點一致。

對差異表達基因的染色體分布情況分析可知，A、B和D染色體組上分別有11個、3個和5個基因，另有6個基因定位不明；另從顯著上調(diào)表達基因的染色體組分布看，鄭麥366上調(diào)表達的基因全部位于A、D染色體組，其中A染色體組基因出現(xiàn)10個，占總數(shù)的71.4%，D組染色體有4個基因，B組和未知染色體組上都是0個基因。所以，僅從本研究選用的2個研究材料來看，A組染色體的貯藏蛋白與面團強度性狀的相關性最高，D組次之，B組染色體最低。

2.4" 面粉硫含量及巰基集團含量分析

分子間二硫鍵是貯藏蛋白形成面筋時鍵能最大的化學鍵類型，蛋白質(zhì)分子中的自由巰基是形成分子間二硫鍵的化學基礎，而蛋白質(zhì)中的硫元素又是含硫氨基酸的必需元素，所以面粉中的硫元素及巰基集團含量都有可能影響到面粉質(zhì)量。2個品種面粉的硫和巰基含量分析結果 （表3） 表明，鄭麥366的硫含量和總巰基含量均顯著高于鄭麥369，自由巰基含量與鄭麥369間差異不顯著；二硫鍵含量計算結果表明，鄭麥366中的總二硫鍵含量達到鄭麥369的2倍以上，由于二硫鍵是以2個半胱氨酸的自由巰基相互結合而成的，再綜合考慮2個品種間的總硫含量，可以推測鄭麥366貯藏蛋白中的含硫氨基酸以半胱氨酸形式存在的比例較高。這些結果也證實了巰基基團含量與面團強度之間具有正相關性。

2.5" 差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)量評價

為進一步分析差異表達基因編碼的貯藏蛋白對面團強度性狀的貢獻，我們以HMW-GS的面團強度貢獻值作為參考，假定將面團強度貢獻值為3.6及以上的蛋白質(zhì)作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)（相當于該蛋白質(zhì)至少有4個自由巰基，對于維持面筋的三維結構貢獻比較大），將面團強度貢獻值為1.8及以下的蛋白質(zhì)作為劣質(zhì)蛋白質(zhì)（表明該蛋白質(zhì)至多含有1個自由巰基，對于維持面筋的三維結構貢獻較?。?，其他中間類型的蛋白質(zhì)（面團強度貢獻值為1.8～3.6）定義為普通類型蛋白質(zhì)（表4）。鄭麥366中顯著上調(diào)表達的8個燕麥類似蛋白全部達到優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標準（表5）；對于醇溶蛋白，在開花后21 d、開花后28 d都上調(diào)表達的3個基因、1個僅在開花后28 d上調(diào)表達的基因和全部下調(diào)表達的10個基因中，僅有2個達到優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)（蛋白編碼基因：TraesCS1D02G001100、TraesCS1B02G011300）標準。結合鄭麥366的高面團強度性狀可以推測，燕麥類似蛋白對面團強度性狀可能具有重要作用。

3" 討論

一般認為HMW-GS及其組合情況是影響小麥品質(zhì)的主要因素，但從本研究選用的2個品種來看，燕麥類似蛋白對于面團強度性狀的貢獻并不低于優(yōu)質(zhì)HMW-GS。燕麥類似蛋白是一類富含半胱氨酸的小麥貯藏蛋白，也被稱為非典型面筋蛋白，包括2個大類和多個亞類。作者前期研究也發(fā)現(xiàn)，部分燕麥類似蛋白對面團強度性狀具有正向效應。b類燕麥類似蛋白的轉基因研究結果也證實了該類蛋白質(zhì)能夠提高面團強度性狀，但尚未檢索到a類燕麥類似蛋白的轉基因研究。從本研究結果來看，在鄭麥366中上調(diào)表達的5個a類燕麥類似蛋白均能達到優(yōu)質(zhì)HMW-GS的水平，推測該類蛋白質(zhì)也是與高面團強度性狀相關的蛋白質(zhì)類型，但其面粉質(zhì)量效應尚需進一步驗證。

在25個顯著差異表達基因中共有9個燕麥類似蛋白編碼基因，分別定位于7D（4個）、7A（3個）和4A（2個）染色體，從理論上來說，小麥的A、B、D染色體組都應該存在燕麥類似蛋白編碼基因，但本研究的結果中B組染色體上沒有發(fā)現(xiàn)燕麥類似蛋白的差異表達基因。據(jù)前人研究推測，普通小麥的四倍體祖先中可能出現(xiàn)過4AL/7BS易位或近著絲粒倒位情況，導致位于7BS的燕麥蛋白編碼位點轉移到了4AL上。

醇溶蛋白約占總貯藏蛋白的40%～50%，一般認為它們以非共價鍵形式結合到面筋中，對面團強度性狀的貢獻較小。本研究結果也表明，在低面團強度品種鄭麥369中，顯著上調(diào)表達的貯藏蛋白編碼基因中90.9%屬于醇溶蛋白類型基因，也證明了醇溶蛋白對面團強度性狀具有負向效應的觀點。但也有研究結果表明，某些醇溶蛋白在面筋中也能形成分子間二硫鍵，特別是半胱氨酸殘基數(shù)量為奇數(shù)的醇溶蛋白，至少能形成1個分子間二硫鍵。本研究鑒定到的在鄭麥366中顯著上調(diào)表達的γ-醇溶蛋白（蛋白質(zhì)編碼基因：TraesCS1D02G001100）含有8個半胱氨酸殘基，且二硫鍵預測程序分析結果表明其不含分子內(nèi)二硫鍵，8個自由巰基都可以與其他貯藏蛋白結合成分子間二硫鍵，在面團強度方面的貢獻評分值（7.2分）高于通常認為的優(yōu)質(zhì)高分子麥谷蛋白亞基1Dx5（4.5分）和1Dy10.1（6.3分），推測也是與高面團強度性狀相關的蛋白質(zhì)，但其面粉質(zhì)量效應還需要進一步驗證。

4" 結論

燕麥類似貯藏蛋白可能是決定面團強度性狀的重要貯藏蛋白類型之一，個別類型的醇溶蛋白可能對面團強度性狀也有貢獻；深入研究燕麥類似貯藏蛋白與面粉質(zhì)量的關系，對于完善現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)小麥育種技術具有一定的參考意義。

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（責任編輯：陳海霞）