基因編輯在植物育種領域中的應用進展研究

摘" 要：基因編輯作為一種起源于20世紀80年代的新興學科，近年來發(fā)展迅速，在各個領域呈迅猛增長態(tài)勢。為探究基因編輯在植物育種中的最新進展，以及基因編輯在植物育種中的重要作用，該文分別論述基因編輯在提高植物的抗病性、改良種子品質(zhì)、提高植物營養(yǎng)、改善植物風味和增加植物適應能力等多種方面的應用，結合國內(nèi)外最新文獻，介紹基因編輯在植物育種領域的最新進展。

關鍵詞：基因編輯；植物育種；目的基因；基因修飾；種子改良

中圖分類號：S336" " " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2024）05-0065-05

Abstract： As As an emerging discipline originating in the 1980s， gene editing has developed rapidly in recent years， showing a rapid growth trend in various fields. In order to explore the latest progress of gene editing in plant breeding and the important role of gene editing in plant breeding， this paper discusses the application of gene editing in improving plant disease resistance， improving seed quality and plant nutrition. Improve plant flavor， increase plant adaptability and other applications， combined with the latest literature at home and abroad， introduce the latest progress of gene editing in the field of plant breeding.

Keywords： gene editing; plant breeding; target gene; gene modification; seed improvement

基因編輯（Gene Editing）技術是在基因的特定位點上進行精準定位，同時以特定的技術來對某些基因進行改造，促進農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展[1]?；蚓庉嫞笇λ璧哪繕嘶蜻M行人為改造，通過一些技術手段，使得堿基缺失、替換和改造，以改變目的基因的表達量或功能。基因編輯技術自誕生以來，發(fā)展迅猛，逐漸應用于多個領域，使生物學迎來了革命性的突破。基因編輯首先識別目標基因，通過不斷改造基因組的DNA來實現(xiàn)對患病基因的修復和剔除[2]。作物選育，又稱品種改良，以高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效為選育的主要目標。但選育目標還一定要根據(jù)當?shù)仄贩N的生長狀況、品種基礎、自然環(huán)境、耕作制度、種植程度和市場經(jīng)營要求等綜合因素，并隨著產(chǎn)品的演變而不斷進行調(diào)整。這是一項十分復雜的工作，需要多年經(jīng)驗的積累，其必須以本區(qū)域最主要的栽培作物為標準，并經(jīng)過不斷改良育種方式，從而將育種目標系統(tǒng)化。在過去數(shù)十年里，基因編輯技術在植物學中發(fā)展迅猛，尤其是對成簇的間隔短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白（CAS）及其變異體的編輯[3]，對于國民經(jīng)濟具有十分重要的意義[4-5]，這已經(jīng)成為植物研究中的一項強大的技術并且可能成為植物育種游戲規(guī)則的改變者。隨著CRISPR/CAS技術的逐漸成熟，許多CRISPR技術已經(jīng)應用于植物育種領域并且取得突破性進展。

但是在植物育種中，通常因為產(chǎn)量、性狀等一系列的原因使得育種的效率非常慢，且農(nóng)藥的過度使用對人體和環(huán)境造成很大的危害。通過基因編輯技術提高作物產(chǎn)出率以及蛋白質(zhì)量[6]，對于植物食用率和消化率有著很大提升。通過在單個品種中堆疊基因，使用敲入技術改變多個精英性狀，這對作物性狀改良具有很大的價值[4]。以往植物組織中硫苷含量少，通過此技術使得植物營養(yǎng)組織中含有較多的硫苷，在植物發(fā)育初期的種子階段硫苷含量大大降低，同時也可以減少鳥類的侵襲[7]。顯然，與傳統(tǒng)方法相比，利用原生質(zhì)體系統(tǒng)進行基因敲入具有更高的效率和準確性。

1" 通過基因編輯在植物育種中提高植物的抗病性

在植物的染色體上插入、替換某些基因組來改變植物的某些特性一直以來都是難以克服的科研難題，而CRISPR/Cas9技術則將這樣的一個難題變?yōu)榱丝赡?，其通過在植物種子中嵌入抗病性基因，可以增強植株的抗病性。

1.1" 植物抗病基因插入

利用CRISPR/Cas9技術斷裂DNA雙鍵，其結果就是可以使得目的基因片段與供體DNA片段兩端序列相同。于是，同源修復性方式在編輯受體的開啟下進行。供體DNA的片段將會“黏貼”到之前斷裂的雙鍵位置上。這是一種神奇的方式，能極大地提高基因利用率，能夠“吸引”多種優(yōu)良基因，因此，傳統(tǒng)育種中出現(xiàn)的問題就能迎刃而解。此方法便捷高效，未來發(fā)展空間極大[8]。即使CRISPR/Cas9技術已經(jīng)在水稻、玉米[9]農(nóng)作物中應用許久，但還暴露出許多問題，其中之一就是編輯效率過低，主要原因就在于植物體內(nèi)存在抗性基因。現(xiàn)代的專家們通過科學研究得出了2個可以提高目的基因確切插入植物總體基因組的方式。方式一是先利用了小麥中的矮縮病毒W(wǎng)DV作為媒介，通過不斷地馴化，使得病毒的拷貝數(shù)始終處于提升的狀態(tài)，因此插入準確度提高。研究顯示，利用這種方式插入水稻[10]中的效率可以達到20%，大大超過了在以往植物基因組中的插入率。方式二是以CRISPR/Cas9技術和一對gRNA為工具，將目的基因直接在同一載體上提取，運用此方法使得包括水稻在內(nèi)的多種植物的靶向基因插入和替換變成了可能，隨著科學技術的發(fā)展，運用將逐漸增多。以CRISPR/Cas9為基礎并不斷延伸的方法，為育種方面基因的精確插入提供了一個新的可能和方向。

1.2" 精確編輯植物基因提高抗病性

農(nóng)業(yè)中為了改變基因的功能，可以精確地編輯一個或者數(shù)個基因，使得整體的功能改變，從而增強作物抗性的同時并且能夠不斷提高作物的某些優(yōu)良的基因和性狀。研究表明，高效的定向轉(zhuǎn)換基因組序列技術CRISPR/Cas9在改良作物方面的優(yōu)勢不可比擬，對于單堿基編輯技術（Base Editor）來說，應用CRISPR/Cas9這項技術可以克服長久以來的問題。這項技術是基于一個突變的Cas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶組合成一個新的蛋白，隨后在指引對象gRNA的引導下進入靶位點。脫氨酶在此過程中起到了至關重要的作用，因為其對堿基轉(zhuǎn)換來說至關重要，只有脫氨酶表現(xiàn)正常，堿基替代才會精確。需要注意的是，即使是在同一個編輯方式下，因為靶位點的不同，編輯效率千差萬別，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因還需進一步地探究。此外，Cas9介導的堿基無論是編輯性以及替換效率都遠高于同源定向修復效率，因此具有很大的應用前景和研究價值。通過精確編輯，把抗病基因插入到植物種子中，培育出來的植物具有顯著的抗病效應，對于不同的疾病，可以插入不同的抗病基因并且精確編輯，使得作物抗病性增加，提高作物的經(jīng)濟價值。

2" 通過基因編輯改良種子品質(zhì)

現(xiàn)代育種中，野生植物品質(zhì)通常會遇到很多問題，產(chǎn)量高的同時但抗病性差，比如野生水稻?；嫉牡疚敛11]，野生型抗病性高但是產(chǎn)量低，或者性狀不統(tǒng)一，很難綜合這兩者的優(yōu)點。利用基因編輯技術把植物的優(yōu)良性狀進行綜合，修改種子基因，以此改良植物的品質(zhì)是現(xiàn)代基因編輯育種中常用的手段之一，可以解決育種過程中植物的不育或者繁殖不佳的難題。

2.1" 改良產(chǎn)量相關基因

定制的RNA引導的Cas9也被廣泛應用于修改決定作物產(chǎn)量的性狀?，F(xiàn)代品種在許多作物中表現(xiàn)為半矮化變種，不容易倒伏，氮肥施用能力增強，收獲指數(shù)提高，即收獲的種子或谷物在地上總生物量中所占的比例不斷增加。進一步微調(diào)這一性狀以適應不同的環(huán)境和區(qū)域需求，產(chǎn)生更多的優(yōu)良遺傳性狀仍然是人們高度關注的問題?，F(xiàn)代的植物育種中追求的仍然是高產(chǎn)量，高穩(wěn)定性遺傳性狀，如矮稈和半矮稈植株是通過敲除油菜籽中的BolC.GA4a基因產(chǎn)生的ER1、ER2、SEC3a[12]和Dep1。半矮稈油菜也是通過選擇攜帶BaA6.RGA基因缺失的突變體來創(chuàng)造的，從而保留了其翻譯閱讀框架，進而提高油菜籽的出油量和油菜的產(chǎn)量。這一原理提供了實現(xiàn)功能修飾的機會，而不是完全喪失目標基因的功能。開花期和果實成熟期從營養(yǎng)到生殖階段的發(fā)育轉(zhuǎn)換的時間規(guī)律是產(chǎn)量的另一個重要決定因素，因此為不同的農(nóng)業(yè)制度和地區(qū)條件量身定做品種時必須考慮到這一點。水稻和番茄的加速成熟是通過敲除OsHd2、HD4、HD5和SLSP5G基因。相比之下，GmFT2基因敲除導致大豆開花時間延遲[13]。Li等[14]證明了長的非編碼RNA1459的突變導致番茄果實成熟延遲。

2.2" 修改種子基因

種子的數(shù)量和重量是產(chǎn)量的直接決定因素?，F(xiàn)代科學的目標是改善種子的這兩個性狀。研究發(fā)現(xiàn)了OsGn1a、DEP1、GS3和IPA1基因的突變，通過CRISPR/Cas9來改造谷物或種子性狀[15]，或者通過敲除種子中的GW2、GW5和TGW6來增加粒重，同樣的原理可以應用于其他植物中。在油菜當中通過敲除CLV3基因的2個同源等位基因，油菜的子房室和種子數(shù)都得到了增加[16]，科研人員在番茄方面采取了更復雜的方法，證明通過產(chǎn)生一系列具有不同片段缺失的CLV3啟動子變體，可以獲得子房室數(shù)量和果實大小的整個范圍的變異性。Cas9介導的AGL6基因被敲除導致番茄無核果實的形成。通過敲除油菜的Alcatraz基因，減少了種子碎粒，提高作物的品質(zhì)。

3" 通過基因編輯植物種子提高植物營養(yǎng)

3.1" 敲除某些基因提高營養(yǎng)含量

定點基因敲除也被證明有助于改善飼料和食物的營養(yǎng)，使其營養(yǎng)價值更加均衡，更有利于人類和家畜的吸收。研究表明，哺乳動物體內(nèi)沒有消化植酸的酶，植酸堆積在體內(nèi)會影響蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的吸收，而玉米當中的IPK基因決定著植酸的產(chǎn)量，利用CRISPR/Cas9技術敲掉玉米當中IPK基因，會使得植酸的含量急劇下降。靶向敲除水稻的SBEI和SBEIIb基因?qū)е轮ф湹矸酆看蠓档停欣诠任镏械闹辨湹矸鄄糠衷黾?，淀粉?yōu)先在結腸而不是在小腸中消化，由此產(chǎn)生的所謂“抗性”，這可能有助于減少II型糖尿病的發(fā)生。Sánchez-León等[17]采取了一種相對具有挑戰(zhàn)性的方法，他同時敲除了小麥多達35個的α-醇溶蛋白基因，導致谷物的低面筋含量和免疫反應性大大降低。在新興的油料種子植物中，F(xiàn)AD2基因被敲除，從而使單不飽和脂肪酸的比例增加到50%以上。這種方法是Cas9技術至關重要的另一個例子。在另外的研究中，通過敲除FAE1基因可以減少超長脂肪酸的含量[18]。通過對參與類胡蘿卜素生物合成途徑的幾個基因進行多重定點突變，在番茄果實中富集了營養(yǎng)價值很高的復合番茄紅素，使得番茄的營養(yǎng)價值翻倍。

3.2" 定點基因修飾提高植物營養(yǎng)

有針對性的基因組修飾也不斷在植物育種方面被應用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，如果要實現(xiàn)雜交育種，必要的一個條件是在雄性可育和雄性不育之間能夠隨機互換。例如，玉米（MS26、MS45）和水稻（CsA、TMS5、PKS2）與花粉功能有關的不同基因已被修飾，形成雄性不育。在此背景下，通過修飾秈稻SC-I基因3個串聯(lián)重復拷貝中的1個或2個，揭示了秈粳雜交稻雄性不育的一種新的基因劑量依賴性機制，這可能促進了雜交稻米雜種優(yōu)勢的使用。隨著人類生活水平以及生存環(huán)境的日益改善也促使人類對食物有了更高的要求，同時他們對食物本身的營養(yǎng)與風味標準有了很大的提高。支鏈淀粉含量高的水稻更易消化且風味優(yōu)良，因此其購買量逐年增加。Zeng等[18]通過編輯一個內(nèi)含子Wxa5'UTR，使得水稻中的直鏈淀粉含量大大降低，增加了水稻的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值。經(jīng)實驗證實，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻不同基因進行編輯，使得水稻性狀向營養(yǎng)價值高且易于人體吸收的方向突變，可以提供優(yōu)質(zhì)的水稻資源，增加水稻的經(jīng)濟價值，同時為水稻的優(yōu)質(zhì)育種提供了理論基礎。

4" 通過基因編輯植物種子提高植物風味

在傳統(tǒng)育種過程中經(jīng)常會遇到這樣的問題，即培育的經(jīng)濟作物的風味很差，即使具有很高的營養(yǎng)價值，但由于風味很差，也很少有人問津，導致作物的經(jīng)濟價值很低，解決這個問題迫在眉睫。通過基因編輯技術可以改良植物的風味，提高作物的經(jīng)濟價值。

4.1" 編輯穩(wěn)定風味的性狀

利用CRISPR編輯技術，首先可以通過自交和雜交的遺傳分離獲得不含轉(zhuǎn)基因的衍生品。此方法利用一個熒光盒，作為CRISPR/Cas9結構存在的標記。通過此標記篩選風味基因，把口感好的基因保留，口感差的基因敲除，使得作物產(chǎn)生風味優(yōu)良的性狀。另一種方法是使用自殺基因CMS2和BARNASE殺死植物產(chǎn)生不良風味的花粉和胚胎[19]。上述方法的目的就是獲得植物的某些特定風味的優(yōu)良基因，然后導入到植物體中，這樣就可以得到穩(wěn)定遺傳的性狀。

4.2" 通過基因編輯在植物種子中引入優(yōu)良風味基因

在食品工業(yè)中，可以生產(chǎn)各種香料，在食品生產(chǎn)過程中將香料放入，可以提高食品風味?；谕瑯拥牡览?，可以通過基因編輯的方法把其他作物中的優(yōu)良風味基因引入植物種子中，通過植物育種培育出作物，產(chǎn)生的作物就擁有了優(yōu)良風味，這種方法在小麥中首次被報道。首先用基因編輯技術體外改良風味基因，然后用基因槍法將CRISPR/Cas9攜帶風味基因的質(zhì)粒導入小麥幼胚，在沒有選擇壓力的情況下獲得再生植株，獲得的植株經(jīng)過培育之后進行基因檢測，確保風味基因?qū)氩⑶夷軌蚍€(wěn)定遺傳。

5" 通過基因編輯植物種子增加植物的適應能力

5.1" 單個多次基因編輯提高種子適應力

隨著世界人口的增加，環(huán)境污染的加劇，傳統(tǒng)糧食的發(fā)展面臨巨大難題，利用基因編輯技術增加作物的適應能力關乎農(nóng)業(yè)的發(fā)展與人類的未來。首先通過基因編輯，在植物中加入耐旱基因，耐旱基因表達之后，再進行耐旱基因的嵌入，這樣每次插入單個基因，可以使得植物性狀更容易觀察，使得植物可以在鹽堿地里生存，增加植物在極端環(huán)境里的生存率，從而提高植物產(chǎn)量。

5.2" 單次多組基因編輯提高種子適應力

運用CRISPR/Cas9多重基因組編輯技術方法，對控制水稻籽粒形狀的調(diào)控因子基因 GS3和GL3.1進行突變。研究發(fā)現(xiàn)，GS3突變體籽粒細小，而GS3GL3.1雙突變體籽粒圓潤飽滿[20]。如果把控制水稻干重的一個主要基因TGW6敲除，則收獲種子的干重有增加跡象。測量后發(fā)現(xiàn)，敲除TGW6基因的水稻種子的干重增加5%。越來越多的研究表明，純合突變會使水稻單株產(chǎn)量增加[21]，為解決水稻純合突變不足的問題，利用CRISPR/Cas9 技術控制水稻基因OsGn1a，增加純合突變的概率。在多個突變類型中，基因TGTG的插入導致了水稻的株系、株高、穗長、穗粒數(shù)與野生類比都有不同程度的提高，與此同時，水稻的抗倒伏以及抗病性與野生型相比也有相應程度的增加[21]，而且植物適應環(huán)境的能力進一步增強。OsPAO5基因會抑制水稻籽粒的大小和產(chǎn)量，Cui等[22]利用 CRISPR/Cas9 技術將其敲除，敲除后的水稻大小和產(chǎn)量與野生型相比有了顯著的提高，同時突變后水稻的抗逆性、胚軸伸長率都有了一定程度的上升。整體來看，敲掉了OsPAO5基因的水稻有著巨大的發(fā)展前景。

6" 總結與展望

基因編輯能夠定位基因的不同位點，利用工具對基因進行插入、敲除以及修飾。改變基因片段，從而對不同的基因進行控制。在邁入新世紀以后基因編輯技術迅速發(fā)展，呈現(xiàn)井噴之勢，現(xiàn)代育種技術與基因編輯技術互相結合突破了以往傳統(tǒng)育種的種種局限性，使得植物可以按照人為希望的性狀進行改變，提高植物的抗病性，改良種子的品質(zhì)，提高植物的營養(yǎng)以及風味，增加植物的適應能力，從而使作物經(jīng)濟價值提高。

在科學技術不斷發(fā)展的今天，傳統(tǒng)育種顯得越來越“力不從心”，主要是因為傳統(tǒng)育種進程緩慢，不可控因素極高，基因編輯技術在這個時候就體現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢，作為一種新興的技術，其在時間和成本面前與傳統(tǒng)育種相比有著很大的改良，過去那種依靠耗費大量人力物力進行育種的場景不復存在，取而代之的是通過基因編輯技術不斷地對基因進行編輯以及定向改造。對于優(yōu)勢基因，科學家通過基因編輯使其過表達，對于劣勢基因或者有害基因，通過沉默敲除使其不再表達，在一系列的操作下，種子就會朝著科研人員希望的方向發(fā)展，這為未來的育種工作描繪了一幅美麗的藍圖。

但基因編輯技術僅僅起源幾十年，雖然發(fā)展很快，但也面臨著很多問題。一個就是成本問題，基因編輯的成本相較于普通育種來說成本還是很高，同時，基因編輯在植物育種上存在一些性狀不穩(wěn)定的問題，這都是未來急需解決的問題，需要不斷進行探索，以期用更加簡單的基因編輯方法在植物育種中創(chuàng)造更大的經(jīng)濟價值。

參考文獻：

[1] 王一博，赫兆輝.基因編輯技術在植物育種工作中的應用[J].生物技術，2020，38（11）：108，110.

[2] 朱雪峰，田文剛，熊顯鵬，等.棉花GhPAO3基因的CRISPR/Cas9表達載體的構建[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2019，56（2）：226－232.

[3] YUAN-YUAN T， HAO D， XIA W， et al. Gene editing： an instrument for practical application of gene biology to plant breeding.[J].Journal of Zhejiang University. Science. B，2020，21（6）：460-473.

[4] 陳秋惠，楊玉雙，覃碧，等.橡膠草育種研究進展[J/OL].分子植物育種，1-15[2024-01-30].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.10 68.S.20231215.0914.002.html.

[5] KIM S， KIM D， CHO SW. Highly efficient RNA- guided" genome editing in human cells via delivery of purified Cas9" ribonucleoproteins[J]. Genome Res， 2014，24（6）：1012-1019.

[6] LI A X， JIA S G， YOBI A. Editing of an alpha-kafirin" gene" family increases， digestibility and protein quality in sorghum[J]. Plant Physiol， 2018，177（4）：1425-1438.

[7] QIN H， ZHANG W S， WANG M， et al. Characterizing glucosinolates of four Brassica species and interspecific transferring of specific glucosinolates[J].Journal of Plant Genetic Resources， 2020，21（1）：94-104.

[8] 劉耀光，李構思，張雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因組編輯技術研究進展[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報.2019，40（5）：38-49.

[9] 胡信暢，余璇，石涵，等.甘藍型油菜BnaGTR基因CRISPR/Cas9敲除載體的構建及基因編輯分析[J].分子植物育種，2022，20（20）：6732-6741.

[10] WANG M G， LU Y M， BOTELLA J R. Gene targeting by holomogy-directed repari in rice using a geminivirus based CRISPR/Cas9 system[J].Mol Plant， 2017（7）：1007-1010.

[11] QU Y， WANG J， ZHU X. The P5 － type ATPase Spf1 is required for development and virulence of the rice blast fungus Pyricularia oryzae[J].Current Genetics，2020，66（2）：385－395.

[12] JIN M， JUN C， MIN W， et al.Disruption of OsSEC3A increases the content of salicylic acid and induces plant defense responses in rice[J].Journal of Experimental Botany，2018，69（5）：1051-1064.

[13] CAI Y P， CHEN L， LIU X J， et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean[J].Plant biotechnology journal，2018，16（1）：176-185.

[14] LI R， FU D Q， ZHU B Z， et al. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of lncRNA1459 alters tomato fruit ripening[J].The Plant journal：for cell and molecular biology，2018，94（3）：513-524.

[15] LI H， LI X F， XU Y. High－efficiency reduction of rice amylose content via CRISPR/Cas9 － mediated base editing[J].Rice Science，2020，27（6）：445-448.

[16] YANG Y， ZHU K， LI H， et al. Precise editing of CLAVATA genes in brassica napus L. regulates multilocular silique development[J]. Plant biotechnology journal， 2018（16）：1322-1335.

[17] S？魣NCHEZ-LE？譫N S， GIL H J， OZUNA C V， et al. Low gluten， nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9[J].PlantBiotechnol，2018（16）：902-910.

[18] ZENG D， LIU T， MA X，et al. Quantitative regulation of waxy expression by CRISPR/Cas9-based promoter and 5'UTR-intron editing improves grain quality in rice[J].Plant biotechnology journal， 2020，18（12）：2385-2387.

[19] HE Y， ZHU M， WANG L， et al. Programmed self-elimination of the CRISPR/Cas9 construct greatly accelerates the isolation of edited and transgene-free rice plants[J].Molecular Plant，2018，11（9）：1210-1213.

[20] CHEN Y Y， ZHU A K， XUE P. Effects of GS3 and GL3.1 for grain size editing by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Rice Science，2020，27（5）：405-413.

[21] SHEN L， HUA Y， FU Y. Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice[J]. Science China. Life Sciences， 2017，60（5）：506-515.

[22] CUI Y T， HU X M， LIANG G H. Production of novel beneficial alleles of a rice yield-related QTL by CRISPR/Cas9[J]. Plant Biotechnology Journal， 2020，18（10）：1987-1989.

基金項目：甘肅省教育廳重點研發(fā)計劃-社會發(fā)展類項目（20YF3FA038）

第一作者簡介：周千（1996-），男，碩士研究生。研究方向為生物防治以及植物病害。

*通信作者：田永強（1972-），男，博士，教授。研究方向為生物防治。