陸生藍藻地木耳中海藻糖提取工藝研究

摘" 要：該研究從三氯乙酸濃度、三氯乙酸用量、提取溫度及時間4個方面初步探討從地木耳中提取海藻糖的工藝，該研究通過單因素和正交試驗，優(yōu)化從地木耳中提取海藻糖的工藝條件，通過考察三氯乙酸濃度、用量、提取溫度和時間對提取率的影響，確定最佳工藝條件。最佳工藝條件為0.3 M三氯乙酸濃度，用量5 mL，提取溫度80 ℃，時間50 min。

關(guān)鍵詞：地木耳；海藻糖；三氯乙酸；正交試驗；提取工藝

中圖分類號：Q946" " " " 文獻標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2024）05-0033-05

Abstract： In this study， the technology of extracting trehalose from Auricularia auricula was discussed from four aspects： the concentration of trichloroacetic acid， the amount of trichloroacetic acid， extraction temperature and time. The technological conditions of trehalose extraction from Auricularia auricula were optimized by single factor and orthogonal experiments. The optimum conditions were determined by investigating the effects of trichloroacetic acid concentration， dosage， extraction temperature and time on the extraction rate. The optimum conditions are as follows concentration of 0.3 M trichloroacetic acid， dosage of 5 mL， extraction temperature of 80 ℃ and time of 50 min.

Keywords： Auricularia auricula; trehalose; trichloroacetic acid; orthogonal test; extraction technology

自然界中存在著一種特殊的分子，被稱為海藻糖。海藻糖是一種非還原性雙糖，由2個葡萄糖分子通過α-1，1-鍵連接而成，在低等動植物、藻類、真菌及細菌中廣泛分布。海藻糖作為一種特殊的非還原性雙糖，能夠在各種惡劣環(huán)境下保護細胞內(nèi)的生物大分子，因此在食品保鮮、藥物制劑保護等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景和重要意義。2004年，研究人員通過薄層層析法首先在地木耳中檢測到了海藻糖的存在，這為海藻糖的來源提供了新的視角。除地木耳外，紅藻等其他材料中也檢測到了海藻糖的存在，這為從多種來源開發(fā)海藻糖提供了可能?；诖?，開發(fā)利用地木耳中海藻糖的資源具有重要的科研和實際意義。

關(guān)于海藻糖的提取工藝研究，研究人員針對其技術(shù)的多樣性和復(fù)雜性，主要集中在綠球藻、葡萄酒泥酵母、面包酵母和啤酒酵母細胞等不同生物材料的提取方法研究。研究顯示，通過熱水浸提法、醇提法等多種工藝可以有效提取海藻糖，且通過優(yōu)化提取條件可以提高海藻糖的得率和純度。此外，研究人員還探討了海藻糖在食品保鮮、提高酵母耐受性等方面的應(yīng)用，突顯了其在食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要價值。研究人員還進行了對海藻糖提取液的進一步處理和純化方法研究，如使用超濾、納濾等膜分離技術(shù)，以及探索了海藻糖的新應(yīng)用，如在液體發(fā)酵中的使用。這些研究不僅為海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，也為其未來的應(yīng)用開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

本研究通過單因素試驗初步考察各影響因素對提取率的影響，再運用正交試驗對主要因素進行優(yōu)化，確定了綜合考慮提取效率及操作的最佳提取工藝方案。本研究為充分開發(fā)利用地木耳中海藻糖資源提供了科學(xué)參考。

1" 材料與儀器

1.1" 實驗材料

地木耳：市售。

1.2" 實驗試劑

本實驗所用三氯乙酸由天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供，蒽酮產(chǎn)品產(chǎn)自北京化工廠，而海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品則由Sigma公司提供。

1.3" 實驗儀器

本實驗中使用的儀器包括：天津市華偉科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的分光光度計7230G，長沙湘儀離心機儀器有限公司制造的離心機L-550，梅特勒-托利多常州衡器有限公司的電子精密天平JB5374-91，以及天津市中環(huán)實驗電爐有限公司提供的恒溫水浴鍋TDA-8002和電熱鼓風(fēng)干燥箱DH-101。

2" 實驗方法

2.1" 海藻糖含量的測定

本工藝采用蒽酮-硫酸法進行試驗。在本研究中，首先對已知量的碳水化合物樣品進行定量取樣。將該樣品準(zhǔn)確地移入試管或適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)容器內(nèi)。隨后，依據(jù)樣品的質(zhì)量，向其中滴加預(yù)定濃度的蒽酮溶液。接著，以控制的速率緩慢加入濃縮硫酸，同時確保反應(yīng)體系均勻混合，以促進反應(yīng)完全進行。將反應(yīng)體系置于恒溫水浴中，在90 °C的條件下進行加熱，以完成化學(xué)反應(yīng)并生成充分的紫色產(chǎn)物。加熱過程完成后，允許反應(yīng)混合物在室溫下冷卻至平衡狀態(tài)。隨后，采用分光光度計，在540 nm的特定波長處測定紫色產(chǎn)物的吸光度值。為了建立碳水化合物含量的定量分析方法，利用不同濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其在540 nm處的吸光度，并據(jù)此繪制出標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線。

2.2" 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用精密電子天平準(zhǔn)確稱取0.25 g海藻糖，并在500 mL容量瓶中稀釋至刻度，充分搖勻以確保溶液均一。此溶液作為海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)母液。依據(jù)表1的指示，準(zhǔn)確抽取不同體積的海藻糖母液置入帶有5.0 mL0.5 mol/mL三氯乙酸的50 mL容量瓶中，并補充至標(biāo)線以配制不同濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將1 mL的樣品及空白對照（后者包括5.0 mL 0.5 mol/mL三氯乙酸溶解于50 mL蒸餾水中）分別轉(zhuǎn)移至預(yù)先烘干并清潔的試管中。隨后加入5 mL已配制的硫酸-蒽酮溶液，充分振蕩以混勻。將試管置于沸水浴中精確反應(yīng)10 min，之后立即冷卻至室溫。最終，利用分光光度計在特定波長下測定吸光度，并以此作為縱軸數(shù)據(jù)，繪制海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線將用于計算待測樣品中碳水化合物的濃度，根據(jù)其吸光度值。通過海藻糖標(biāo)樣繪制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得出線性回歸方程。

2.3" 單因素試驗

2.3.1" 材料的預(yù)處理

取10 g地木耳單層平鋪于托盤中，置于90 ℃的干燥箱中處理20～24 h，使地木耳中的水分完全蒸發(fā)，呈現(xiàn)干枯易碎的狀態(tài)，然后在研缽中將烘干的地木耳研磨成粉待用。

2.3.2" 三氯乙酸（TCA）提取海藻糖

向燒杯中準(zhǔn)確稱取0.1 g地木耳粉末，加入5.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液。震蕩混勻后，燒杯置于50 ℃水浴中加熱，每隔5 min振蕩一次，持續(xù)20 min。隨后在3 500～4 000 r/min下離心5 min，輕心倒出上清液至預(yù)先準(zhǔn)備好的、含有冰水的50 mL容量瓶中。使用冰水對燒杯內(nèi)殘留的地木耳粉末再次洗滌并離心2次，合并所有上清液至50 mL容量瓶，并加冰水至刻度線，搖勻混合。取1 mL所得試液，與蒽酮硫酸溶液混合后，在沸水浴中反應(yīng)，最后在590 nm處測定吸光度。

2.4" 正交試驗

在地木耳多糖的提取過程中，三氯乙酸的濃度、用量、提取溫度以及提取時間等參數(shù)對提取效率具有顯著影響。為了優(yōu)化提取條件，本研究采用L9（3×4）的正交試驗設(shè)計來評估這些因素?；谥皢我蛩貙嶒灥慕Y(jié)果，為每個影響因素設(shè)定了3個不同的水平，具體水平設(shè)置見表2。

3" 結(jié)果與分析

3.1" 三氯乙酸濃度對海藻糖提取效率的影響

為評估三氯乙酸濃度對海藻糖提取效率的影響，本實驗設(shè)計采用了不同濃度的三氯乙酸作為提取溶劑，具體濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.8和1.0 M。在所有實驗中，固定使用10 mL三氯乙酸，設(shè)定提取時間為40 min，并在40 ℃條件下進行提取。隨后測定各實驗條件下提取液中海藻糖的含量，以此考察三氯乙酸濃度對提取效率的具體影響。結(jié)果詳細記錄于表3。

由表3可知，三氯乙酸濃度對海藻糖提取量有顯著影響。當(dāng)三氯乙酸濃度為0.3 M時，海藻糖的提取含量達到最高，為32.56 mg/g。隨著三氯乙酸濃度的進一步增加到0.5 M，海藻糖含量略有下降至31.03 mg/g。在0.8 M時，海藻糖含量減少到30.21 mg/g，而在三氯乙酸濃度為1 M時，海藻糖含量進一步降至28.55 mg/g，為5個濃度水平中最低。這表明在本實驗條件下，三氯乙酸濃度過高或過低都會對海藻糖的提取效率產(chǎn)生不利影響，而0.3 M是最適宜的三氯乙酸濃度，能夠最大限度地提取海藻糖。

3.2" 三氯乙酸用量對海藻糖提取效率的影響

在固定的提取條件下，即溫度設(shè)定為40 ℃，三氯乙酸濃度為0.3 M，提取時間為40 min，本實驗采用了不同體積的三氯乙酸作為提取溶劑，分別為5、10、15、20、25 mL。通過測定這些不同體積的提取溶液中海藻糖的含量，本研究評估了三氯乙酸用量對海藻糖提取效率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，海藻糖的提取量隨三氯乙酸的使用量呈現(xiàn)出一定的變化趨勢。當(dāng)三氯乙酸用量為10 mL時，提取得到的海藻糖含量最高，為34.02 mg/g，這表明在本實驗條件下，10 mL是最優(yōu)的三氯乙酸用量。而在使用5 mL三氯乙酸時，海藻糖的含量也相對較高，為32.32 mg/g。隨著三氯乙酸用量的增加至15、20、25 mL，海藻糖含量出現(xiàn)了下降，分別為30.66、31.32、30.64 mg/g。這可能表明較高體積的三氯乙酸并未進一步提高海藻糖的提取效率，反而可能因為溶劑量的增加而稀釋了提取物中的海藻糖濃度。綜合考慮，10 mL三氯乙酸用量在本實驗條件下最有利于海藻糖的提取，而過量的三氯乙酸使用對提取效率并無益處，甚至可能對海藻糖含量產(chǎn)生負面影響。

3.3" 提取溫度對海藻糖提取效率的影響

在一系列恒定的實驗條件下，即三氯乙酸的體積為10 mL，濃度為0.3 M，提取時間為40 min。本研究探討了不同提取溫度（30、40、50、60、70和80 ℃）對海藻糖提取效率的影響。通過測定在上述各溫度條件下得到的提取液中海藻糖的含量，旨在確定最佳的提取溫度，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，提取溫度對海藻糖提取量有顯著的影響。隨著提取溫度的升高，海藻糖提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在40 °C時達到第一個峰值3 5.32 mg/g。之后提取量有所下降，在50～70 °C維持在31～32 mg/g左右的水平。當(dāng)提取溫度繼續(xù)提高到80°C時，提取量再次顯著提高，達到38.21 mg/g。結(jié)果表明，適宜的提取溫度可以促進海藻糖的溶出，提高提取效率。但是，過低或過高的溫度則不利于海藻糖的提取。40 °C和80 °C是2個最佳的提取溫度。

3.4" 提取時間對海藻糖提取的影響

在三氯乙酸體積為10 mL、濃度0.3 M、提取溫度40 ℃條件下，分別提取20、30、40、50、60和70 min測定提取液中海藻糖的含量，考察提取時間對海藻糖提取的影響，結(jié)果見表6。

由表6可知，在其他提取條件固定的情況下，提取時間的延長也影響了海藻糖的提取效果。當(dāng)提取時間在20～40 min間延長時，海藻糖的提取量持續(xù)增加，在40 min時達到峰值34.28 mg/g。但提取時間繼續(xù)延長到50 min以上時，海藻糖的提取量則開始下降，在70 min時減少到28.76 mg/g。這表明在一定范圍內(nèi)，提取時間的增加有利于海藻糖的充分溶出，但過長的提取時間會導(dǎo)致已經(jīng)溶出的海藻糖發(fā)生降解，從而使得提取率下降。40 min是提取時間的最佳選擇。

綜合以上各個單因素實驗可得海藻糖提取的最優(yōu)條件：三氯乙酸濃度0.3 M，三氯乙酸用量10 mL，提取溫度80 ℃，提取時間40 min。

3.5" 正交試驗綜合分析

采用三氯乙酸濃度、三氯乙酸用量、提取溫度和提取時間4個因素進行正交試驗，通過對海藻糖含量的測定來確定各因素的最優(yōu)水平。正交試驗的直觀分析結(jié)果見表7。

通過正交實驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)的直觀分析結(jié)果顯示，4個考察因素對海藻糖提取率的影響大小順序：三氯乙酸濃度、提取溫度、三氯乙酸用量、提取時間。其中，三氯乙酸濃度的影響最為顯著，其極差值最大，且0.3 M濃度級別對應(yīng)的平均提取量較高。提取溫度的影響次之，80 °C提取量較優(yōu)。三氯乙酸用量和提取時間的影響相對較小。綜合各因素水平的提取效果，確定最佳工藝參數(shù)組合為A2B1C2D3，即三氯乙酸濃度0.3 M、用量5 mL、溫度80 ℃、時間50 min。

4" 結(jié)論

本研究以地木耳為原材料，采取三氯乙酸提取法，通過單因素試驗和正交試驗這2種實驗優(yōu)化設(shè)計方法，系統(tǒng)地優(yōu)化了地木耳中海藻糖的提取工藝條件。結(jié)果表明，三氯乙酸提取液的濃度是影響海藻糖提取效率的主要因素，其最佳濃度水平為0.3 M。提取溫度對提取效果也有重要影響，80 °C為較優(yōu)溫度水平。三氯乙酸溶液的用量以10 mL為宜，提取時間以40 min為最佳。正交試驗結(jié)果進一步驗證，考慮提取效率及操作便捷性，確定最優(yōu)的參數(shù)組合為三氯乙酸濃度0.3 M、用量5 mL、溫度80 °C、時間50 min。

本研究初步建立和優(yōu)化了地木耳中海藻糖的提取方法，為后續(xù)大規(guī)模開發(fā)利用這一重要資源提供了科學(xué)依據(jù)。在今后的研究中，還需繼續(xù)改進提取工藝以提高產(chǎn)率，并開展地木耳中海藻糖的功能及應(yīng)用方面的研究，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供支持。

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基金項目：常德市2020年度科技創(chuàng)新發(fā)展指導(dǎo)性計劃項目（2020ZD65）

第一作者簡介：徐曼（1984-），女，碩士，副教授。研究方向為農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用、職業(yè)教育。