不同產(chǎn)地杜仲葉活性成分的定量分析

摘 要：通過杜仲葉中主要活性成分綠原酸的提取率，優(yōu)化杜仲葉活性成分的提取工藝，比較不同產(chǎn)地杜仲葉組成及含量的差異.以綠原酸為目標產(chǎn)物，通過單因素實驗和Box-Behnken模型，并采用高效液相色譜法測定秦仲葉和華仲葉中蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸五種活性成分含量.單因素條件對兩者葉的提取效果影響均為：提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比.在最佳提取條件下，秦仲葉綠原酸提取率為62.94%，華仲葉綠原酸提取率為47.84%.兩者葉中綠原酸含量最高，秦仲葉中蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷含量比華仲葉高出1.97倍和6.59倍，但華仲葉中金絲桃苷和綠原酸含量比秦仲葉高出1.41倍和1.16倍.本研究旨在為不同地域杜仲樹種的選育以及臨床上應用標準提供理論依據(jù)，幫助更加全面地評價不同產(chǎn)地杜仲藥材質(zhì)量.

關(guān)鍵詞：綠原酸； 響應面法； 高效液相色譜； 不同產(chǎn)地； 定量

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼： A

Quantitative analysis of active components in Eucommia ulmoides leaves from different places

GONG Pin1， KE Ying-ying1， ZHAI Peng-tao1， ZHAI Wen-jun2，LI Bai-cun2， ZHENG Ben-zhong3， CUI Meng-jiao3

（1.School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China; 2.School of Life Science and Food Engineering， Shaanxi Xueqian Normal University， Xi′an 710000， China; 3.Shaanxi Tiancheng Biotechnology Co.， Ltd.， Xi′an 710075， China）

Abstract：To optimize the extraction process of Eucommia ulmoides leaves by extracting the main active component chlorogenic acid，and to compare the composition and content of Eucommia ulmoides leaves from different regions.With chlorogenic acid as the target product，the contents of five active ingredients in leaves of C.intifolia and C.intifolia were determined by single factor experiment and Box-Behnken model，and the contents of rutin，pinelliol diglucoside，hyperoside，chlorogenic acid and gallic acid were determined by high performance liquid chromatography.The influence of single factor conditions on the extraction effect of both leaves was as follows：extraction temperaturegt;extraction timegt;ethanol volume fractiongt;solid-liquid ratio.Under the optimal extraction conditions，the yield of chlorogenic acid was 62.94%，and that of chlorogenic acid was 47.84%.The contents of chlorogenic acid in leaves of C.sinensis were the highest.The contents of rutin and pinereol diglucoside in leaves of C.sinensis were 1.97 and 6.59 times higher than those of C.sinensis，but the contents of hyperoside and chlorogenic acid in leaves of C.sinensis were 1.41 and 1.16 times higher than those of C.sinensis.This study aims to provide a theoretical basis for the selection of Eucommia species in different regions and clinical application standards，and help to evaluate the quality of Eucommia ulmoides in different regions more comprehensively.

Key words：chlorogenic acid; response surface method; high performance liquid chromatography; different producing areas; quantify

0 引言

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我國特有的木本藥用植物［1，2］，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品［3］，杜仲含有木脂素、苯丙素、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜等多種活性成分［4，5］，具有降血脂、降血壓［6］、降血糖［7］、抗骨質(zhì)疏松［8］、抗腫瘤［9］、抗菌［10］、抗炎［11，12］等藥理作用，傳統(tǒng)上常以杜仲皮入藥，但由于杜仲皮生長周期長，剝皮易造成原植物枯死，從而使得杜仲藥用資源匱乏、價格昂貴，極大的限制了杜仲資源的可持續(xù)發(fā)展［13-15］.研究表明，杜仲葉片的化學組成及藥理作用和杜仲皮類似［16-20］，并且前期課題組通過建立HFD誘導的高脂血癥小鼠模型，證明杜仲葉和杜仲皮通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善高脂血癥，二者在抗高脂血癥作用方面無顯著差異，杜仲葉可能是杜仲皮的合適替代品［21，22］.目前關(guān)于杜仲葉的研究多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，包括對其活性成分提供工藝的優(yōu)化、分離鑒定、藥理作用以及質(zhì)量標準等研究較多，但是生態(tài)環(huán)境對杜仲葉活性成分組成的影響被忽略，地理環(huán)境、氣候類型和物種來源能夠干擾植物次生代謝產(chǎn)物合成，是影響中藥質(zhì)量的重要因素［23］.因此，有必要對不同區(qū)域的杜仲葉的化學組成和含量差異進行分析，從而為優(yōu)化杜仲樹種結(jié)構(gòu)，促進杜仲資源高品質(zhì)發(fā)展［24］.

秦杜仲主要分布于陜西省略陽，該地區(qū)氣候溫和，降雨充沛，光照充足，土壤PH值（5.0～7.9）和土壤種類滿足杜仲生長需求；而華杜仲是由國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心培育的新品種，適應性強，對土壤的酸堿度要求不嚴，抗干旱、寒冷的能力強，主要分布于河南省，本研究通過比較兩種不同來源的杜仲葉中活性成分的差異，以期為不同地域杜仲樹種的選育以及臨床上應用標準提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗原料

秦杜仲采自于陜西省略陽縣（北緯105.42′53″，東經(jīng)33.23′6″），華杜仲來自于國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，均自然晾干.將杜仲葉進行粉碎并過40目篩.

1.1.2 實驗試劑

蘆丁對照品、金絲桃苷對照品、綠原酸對照品、沒食子酸對照品、松脂醇二葡萄糖苷對照品，均HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈，均色譜級，西安三浦精細化工廠；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.3 實驗儀器及設(shè)備

Waters2998型高效液相色譜儀和紫外檢測器，美國Waters公司；G1310A型高壓泵，美國安捷倫科技有限公司；Varioskan fiash全波長掃描式多功能讀數(shù)酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機，無錫郎寧儀器制造有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HGZF-101-2電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；H-1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器場；WH-2微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Levo Pius Pipette移液槍，SCILOGEX.

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸標準曲線的制作

精密稱定2 mg綠原酸標準品，加2 mL甲醇溶解，得到母液.按照梯度依次稀釋為0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL，在波長為327 nm處測量其吸光值.以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，制作相應標準曲線.

1.2.2 單因素實驗

秦仲葉和華仲葉的實驗方案一致，分別稱取適量葉細粉，按照實驗條件調(diào)整對應料液比，相應體積分數(shù)的乙醇，在相應的溫度下，提取相應的時間，提取兩次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑，至貼壁，用20 mL50%甲醇水將提取物超聲溶解至試管中.在327 nm波長下測定吸光度，利用標準曲線進行綠原酸濃度的計算，并計算得到含量.綠原酸提取率計算公式如下：

綠原酸提取率=C×V×Nm

（1）

式（1）中：C為通過標準曲線計算的綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL; V為甲醇體積，mL; N為稀釋倍數(shù); m為樣品質(zhì)量，g.

（1）乙醇體積分數(shù)對綠原酸提取率的影響

準確稱取2 g杜仲葉細粉，共5份，料液比例為1∶20 g/mL，用30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，60℃下提取50 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，計算出綠原酸的提取率.

（2）提取溫度對綠原酸提取率的影響

準確稱取2 g杜仲葉細粉，共5份，料液比例為1∶20 g/mL，加入50%的乙醇，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取 50 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，計算綠原酸的提取率.

（3）料液比對綠原酸提取率的影響

準確稱取2 g杜仲葉細粉，共5份，料液比例分別為1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL、1∶30 g/mL、1∶35 g/mL，加入50%的乙醇，60 ℃下提取50 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，計算綠原酸的提取率.

（4）提取時間對綠原酸提取率的影響

準確稱取2 g杜仲葉細粉，共5份，料液比例為1∶20 g/mL，加入50%的乙醇，在60℃下分別提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，計算出綠原酸的提取率.

1.2.3 響應面優(yōu)化實驗

基于單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken對綠原酸的最佳提取工藝進行了研究，并利用Design-Expert 8.0對其進行了試驗設(shè)計和分析.選擇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間等三個因子，將每個變量的低、中、高試驗水平分別用A、B、C代替，得到的因素和水平設(shè)計見表1所示.

1.2.4 高效液相色譜法對杜仲葉中五種組分的同時檢測

（1）供試品溶液的制備

秦仲葉供試品溶液：精密稱取2 g秦仲葉細粉，料液比例為1∶20 g/mL，用50%乙醇在60 ℃下提取50 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得.

華仲葉供試品溶液：精密稱取2 g華仲葉細粉，料液比例為1∶20 g/mL，用50%乙醇在60 ℃下提取50 min，共兩次，合并提取液，離心后取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得.

（2）對照品溶液的制備

精密稱定蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98％）適量，加甲醇配制成0.8 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL的混合對照品溶液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得.

（3）色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；流動相乙腈（A）-0.4％磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，95％B；40 min，85％B；50 min，75％B；60 min，70％B；65 min，95％B）.其最大吸收波長均在260 nm左右，因此選擇檢測波長為260 nm，進樣量20 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來源杜仲葉綠原酸含量差異分析

2.1.1 綠原酸標準曲線構(gòu)建

圖1顯示，在0.005～0.1 mg/mL的綠原酸標準品溶液中，吸收值線性關(guān)系較好.回歸曲線方程為Y=20.57X+0.086 6，R2=0.999 5.經(jīng)過穩(wěn)定性實驗、精密度實驗等驗證表明該標準曲線用于綠原酸質(zhì)量濃度的計算有效，可靠.

2.1.2 單因素實驗考察不同因素對不同來源杜仲葉中綠原酸含量的影響

（1）乙醇體積分數(shù)對不同來源杜仲葉中綠原酸含量的影響

由圖2可知，乙醇體積分數(shù)60%以上時綠原酸提取率最高可達50.56%，綠原酸是一種弱極性分子，溶液的極性差隨濃度的增大而增大，會對綠原酸的浸出不利.此外，葉綠素等脂溶性成分的溶解速率隨溶劑中酒精含量的提高而增加，提取液的綠色程度也逐漸加深.30%乙醇的浸出物為呈棕色，70%為墨綠色.在其他條件一定的情況下，60%乙醇提取效果最佳，因此選擇50%、60%、70%三個水平作為考察因素.

（2）提取溫度對不同來源杜仲葉中綠原酸含量的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，綠原酸提取率先增加后逐漸降低.溫度越高，分子的擴散速度越快，越有利于組分的溶解，綠原酸提取率在60 ℃時達59.49%.但是，溫度越高，乙醇會汽化，雜質(zhì)溶解也會增加，且綠原酸是一種熱敏感的物質(zhì)，容易被分解和破壞.在其他條件一定的情況下，60℃時綠原酸提取效果最佳，因此選擇50 ℃、60 ℃、70 ℃三個水平作為考察因素.

（3）料液比對不同來源杜仲葉中綠原酸含量的影響

由圖4可知，隨著溶解劑量的增大，綠原酸提取率逐漸增大，尤其是1∶15增加到1∶20提高幅度較大，液料比超過1∶20時，提取率隨之下降，變化緩慢.綠原酸提取率在1∶20時達64.57%，液料比增大，增加溶質(zhì)和溶質(zhì)的濃度差異，有利于物質(zhì)的傳質(zhì)，但溶劑過多，不利于后續(xù)的旋蒸工序，且耗費成本.所以，選擇1∶20為宜.

（4）提取時間對不同來源杜仲葉中綠原酸含量的影響

由圖5可知，隨著時間的推移，綠原酸提取率逐漸提高.當細胞內(nèi)、外濃度達到平衡時，其有效成分不會再被溶出，且時間過長，會造成綠原酸分解，降低提取率.50 min時，綠原酸提取率達49.10%.在其他條件一定的情況下，50 min時綠原酸提取效果最佳，因此選擇40 min、50 min、60min三個水平作為考察因素.

2.1.3 響應面法優(yōu)化不同來源杜仲葉中綠原酸提取工藝

根據(jù)Design-Expert V8.0.6軟件，輸入響應面因素水平表，得出以下試驗設(shè)計表（表2），以提取時間、提取溫度、體積分數(shù)三個因素為自變量，以綠原酸提取率為響應值，得出綠原酸提取率Y（表2）、回歸模型方差分析表（表3）.

使用設(shè)計Design Expert軟件，對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得出了綠原酸提取率（Y）的二次元多項回歸方程，溫度（A）、體積分數(shù)（B）、提取時間（C）真實值的回歸模型方程為：

Y=50.23-1.00A+0.13B+0.14C-0.44AB+0.51AC+0.19BC-6.93A2-4.08B2-3.92C2

表3是顯著性檢驗分析結(jié)果，二次多項模式在統(tǒng)計學上有很高的顯著性（Plt;0.001），失擬項沒有顯著意義，其校正決定系數(shù)（R2adj）為0.996 0，說明99.60%的綠原酸提取率變化可從該模型來說明.相關(guān)系數(shù)R2為0.998 2，表明綠原酸提取率與試驗結(jié)果吻合良好，可應用于醇提物中的有效組分分析預測.回歸公式中各個因子的系數(shù)值反映了各個指標對指標的影響，F(xiàn)值愈大，則說明其對指標的影響愈大，愈重要.從表3可知，影響杜仲葉中綠原酸提取的因素依次是：提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數(shù).

圖6表示各因素的等高線圖和曲面圖，反映出了各因素之間的相互作用對結(jié)果的影響.響應面曲線為拋物線，表明該模型具有最大值.

由表4可得，該回歸模型得到的提取綠原酸提取率最優(yōu)工藝條件為提取溫度64.56 ℃，體積分數(shù)59.91%、提取時間50.48 min.考慮到實際情況，將提取最佳參數(shù)設(shè)為：提取溫度為65 ℃，60%乙醇、提取時間為50 min、以便進行驗證試驗.

2.2 HPLC法測定不同來源杜仲葉中五種活性成分含量

2.2.1 HPLC方法學考察

（1）線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液適量，甲醇逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度，進樣測定，記錄峰面積.以對照品峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結(jié)果見表5所示.由表可知，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

（2）精密度試驗

精密吸取混合對照品，每次20 μL，進樣測定6次，測得蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸峰面積RSD分別為1.76％、1.93％、1.16％、2.88％和2.23％（n=6），表明該儀器的精密度良好.

（3）穩(wěn)定性試驗

精密稱定杜仲葉粉2 g，配制供試品溶液，于室溫下放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時，進樣測定，記錄色譜峰圖.測得蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸峰面積的RSD分別為1.65%、1.47%、2.89%、1.16%、2.90%（n＝6），表明該樣品的穩(wěn)定性良好.

（4）重復性試驗

精密稱定杜仲葉粉2 g，平行6份，進樣測定，記錄色譜峰圖.測得蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸含量RSD分別為1.15%、1.29%、2.87%、1.46%、2.13%（n＝6），表明該方法重復性良好.

（5）加樣回收率試驗

精密稱定杜仲葉粉2 g，平行6份，分別精密吸取混合對照品溶液（蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸質(zhì)量濃度分別為0.656 mg/mL、0.488 mg/mL、0.589 mg/mL、0.553 mg/mL、0.021 mg/mL）各2 mL.制備樣品6份，進樣測定，計算回收率.結(jié)果，蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷、金絲桃苷、綠原酸及沒食子酸平均加樣回收率分別為98.91%、98.89%、98.20%、98.92%、98.82%，RSD分別為2.46%、3.14%、2.69%、2.78%、2.93%.

2.2.2 杜仲葉中活性成分含量測定

取3份樣品，制備供試品溶液，進樣測定，記錄對應待測組分的出峰面積，外標法計算各待測成分的含量，結(jié)果見表6所示，色譜圖見圖7所示.

3 結(jié)論

單因素實驗中，秦仲和華仲兩者各因素影響程度主次順序均為：提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞料液比.采用Design-Expert.V8.0.6 軟件，設(shè)計相應交互實驗，建立最優(yōu)提取條件為：溫度65 ℃，醇含量60%，提取時間50 min，秦仲綠原酸理論提取率為63.93%，華仲綠原酸理論提取率為48.35%.在模型預測值的基礎(chǔ)上，最優(yōu)條件下重新提取5次，測得秦仲綠原酸提取率62.94%，華仲綠原酸提取率47.84%，與理論提取率吻合度分別為98%、97%，表明響應面優(yōu)化的提取工藝可靠.并且秦仲和華仲二者由于所用部位和提取目標產(chǎn)物一致，綠原酸提取最優(yōu)工藝條件較相近，文中單因素和響應面實驗數(shù)據(jù)來源于華仲.

本研究建立的方法高效、簡便、重現(xiàn)性好，可以較好地檢測出杜仲葉五種成分的含量.杜仲葉綠原酸含量最高，秦仲中蘆丁、松脂醇二葡萄糖苷含量比華仲高出1.97倍和6.59倍，但華仲金絲桃苷和綠原酸含量比秦仲高出1.41倍和1.16倍，兩者沒食子酸含量都較低，可能是由于陜西與山西兩地氣溫和降水等關(guān)鍵地理因素所導致的.此結(jié)論與相關(guān)文獻報道相符［25-27］.本實驗對兩個產(chǎn)地的杜仲葉進行了活性成分含量測定，提示了秦仲和華仲的藥用部位葉中的成分組成及含量存在明顯的差異，為不同地域和不同用途樹種的選擇提供了理論支持，但是二者所含化學成分的差異是否對其藥理作用、臨床功效產(chǎn)生影響，還有待今后進一步探索.

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【責任編輯：蔣亞儒】