氧化石墨烯基二維復(fù)合納米片對豬流行性腹瀉病毒的抑制作用研究

關(guān)鍵詞 氧化石墨烯； 二氧化錳納米片； 豬流行性腹瀉病毒； 抗病毒活性； 納米治療平臺

中圖分類號 TB383.1 ； TQ127.11 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）03-0267-08

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是一種由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）感染引起的接觸性腸道傳染病，該病具有高發(fā)病率、高死亡率、能感染任何年齡及生產(chǎn)階段的豬等特點［1］。PEDV 屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，是一種有包膜的單鏈正向RNA病毒［2］。近年來，冠狀病毒在全球范圍內(nèi)的大暴發(fā)引起了廣泛關(guān)注。納米顆粒因其獨特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，如比表面積增大、表面活性增強、反應(yīng)特性更好、易于控制藥物釋放和靶向藥物輸送等［3］，在抗病毒研究應(yīng)用中取得了快速進展。利用納米材料本身特性損傷或殺死病毒［4-5］；將抗病毒藥物負載到納米顆粒中，不僅提高了藥物的生物利用程度，降低了藥物毒性，還可以實現(xiàn)靶向藥物遞送、精準釋放、藥效延長［6］；功能化的納米顆?？梢蕴禺惏邢蚬鉄釟缣囟ǖ牟《荆?］等。這些研究成果為開發(fā)抗病毒感染的新型廣譜納米治療平臺拓展了思路。

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是由石墨烯氧化剝離得到［8］，具有鋒利邊緣帶負電荷的單層片狀結(jié)構(gòu)，表面帶有大量活性氧化基團，包括環(huán)氧基、羥基、羰基和羧基，材料的親水性和生物相容性提高，易于功能化修飾。此外，GO 已被證實具有抗病毒活性，其作用機制主要涉及3 個方面：一是GO 能通過靜電力作用和氧化還原反應(yīng)吸附和破壞病毒［9］，對一些帶正電荷，或者衣殼蛋白富含精氨酸且?guī)д姾山Y(jié)構(gòu)域的病毒具有抗病毒活性［10］；二是GO 具有鋒利邊緣的單層結(jié)構(gòu)，可直接對病毒造成物理破壞，如Ye等［5］以PEDV 和PRV 為病毒模型，證實了GO 具有廣譜抗病毒的活性且效果顯著，并指出GO 的抗病毒活性可能取決于其特殊的具有鋒利邊緣的單層結(jié)構(gòu)和表面電荷；三是GO 還具有優(yōu)異的光催化活性，能夠增強ROS 的生產(chǎn)，從而直接作用于捕獲的病毒，表現(xiàn)出良好的抗病毒效果。Hu 等［11］利用GO 的光催化特性，制備石墨烯-適配體納米片捕獲并殺死噬菌體，證實了GO 光催化活性的抗病毒作用。

二氧化錳納米片（MnO₂ nanosheets，MnO₂ NSs）是一種二維片狀的功能性納米材料，具有穩(wěn)定性好、光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異、比表面積大、生物相容性好等特點［12］。目前對MnO₂ NSs 的研究主要集中在催化、電池以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的生物傳感器、藥物輸送控釋以及生物成像等方面，但MnO₂對食源性致病菌和動物源性病原體的抑制作用研究較少。本研究將GO 與MnO₂ NSs 復(fù)合，保留了2 種原材料的本身特性，以期產(chǎn)生協(xié)同增效的抗病毒效果，為抗動物源性病毒新型材料的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯化錳（AR）、無水乙醇（AR）、甲醇（AR），購于天津市百世化工有限公司；單層氧化石墨烯粉末，購于南京先豐納米材料科技有限公司，4% 多聚甲醛（AR），購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；噻唑藍（MTT，BR）、牛血清白蛋白（BSA，BR）、脫脂奶粉、總RNA 提取試劑、RIPA 組織/細胞裂解液、JC-1 試劑盒，購于北京索萊寶科技有限公司；四甲基氫氧化銨（AR）、二甲基亞砜（DMSO，AR），購于美國Aladdin公司；FITC-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗鼠二抗，購于武漢艾美捷科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（BR），購于美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 GO-MnO₂ NSs 的制備

1） 二氧化錳納米片（MnO₂ NSs）的制備。在劇烈攪拌下，15 s 內(nèi)將10 mL 0.3 mol/L 氯化錳（MnCl₂·4H₂O）溶液注入到20 mL 含有0.6 mol/L 四甲基氫氧化銨和3% H₂O₂的混合水溶液中，溶液立即變成深棕色，表明Mn²⁺被氧化為Mn⁴⁺。將深棕色懸浮液于室溫下劇烈攪拌過夜，離心、洗滌、干燥后得到塊狀MnO₂，利用超聲制備MnO₂ NSs，剩余塊狀MnO₂于常溫放置，備用。

2）GO-MnO₂ NSs 的制備。參照文獻［13］并加以改進合成GO-MnO₂ NSs。將0.2 g 單層氧化石墨烯粉末分散于30 mL 去離子水中，超聲處理20 min，將0.25 mmol MnCl2·4H₂O 在攪拌中慢慢加入，超聲處理1 h，用四甲基氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)pH 值至8.5。

在上述2 種溶液中，快速攪拌下滴加0.55 mL 的30% H₂O₂ 溶液，攪拌30 min 后，離心、洗滌，將最終產(chǎn)物烘干，常溫放置，備用。

1.3 細胞毒性的測定

將Vero 細胞接種到96 孔板中，培養(yǎng)至單層后棄去上清液。使用0.22 μm 一次性無菌濾膜將GOMnO₂NSs 過濾除菌，將細胞與不同質(zhì)量濃度（1250、625、313、156 μg/mL）的GO-MnO₂ NSs 分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入20 μL MTT 試劑（5.0 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）輕輕振蕩使甲瓚完全溶解。用酶標儀測定OD490 nm 的吸光值，根據(jù)公式（1）計算細胞存活率（cell survivalrate，CSR）。根據(jù)試驗結(jié)果選擇細胞毒性低的GOMnO₂NSs 進行后續(xù)試驗。

CSR=［（A_s-A_b）/（A_c-A_b）］ × 100% （1）

式（1）中，As 表示實驗孔吸光度（含細胞、培養(yǎng)基、MTT 溶液和GO-MnO₂ NSs）；Ab 表示空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、MTT 溶液，但不含細胞和GOMnO₂NSs）；Ac表示對照孔吸光度（含細胞、培養(yǎng)基、MTT 溶液，但不含GO-MnO₂ NSs）。

1.4 半數(shù)效應(yīng)濃度（EC₅₀）的測定

EC₅₀是能夠抑制50% 病毒感染引起的細胞病變的藥物有效濃度。將Vero 細胞接種到96 孔板中，培養(yǎng)至單層后棄去上清液，向100TCID₅₀的PEDV 中分別加入625、313、156、78、39 μg/mLGO-MnO₂ NSs，同時設(shè)置細胞對照組和病毒對照組。置于37 ℃ 5%的CO₂培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)至侵染后12、24、36、48 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，直至細胞病變不再進展，記錄并按照Reed-Muench 法［14］計算EC₅₀。

1.5 間接免疫熒光實驗

將Vero 細胞接到24 孔板中，培養(yǎng)至單層，將病毒PEDV 與625 μg/mL GO‐MnO2 NSs 在4 ℃預(yù)混1 h 后加入24 孔板中于37 ℃下培養(yǎng)1 h，同時設(shè)置陽性對照組及陰性對照組，PBS 沖洗后，用DMEM（補充10 μg/mL 胰蛋白酶）分別培養(yǎng)至侵染后12、24、36、48 h。參照文獻［15］方法，先用4% 多聚甲醛室溫固定，用-20 ℃預(yù)冷的甲醇透化，并用5% BSA室溫封閉后，加入一抗（抗PEDV N 蛋白小鼠單克隆抗體）溫育1 h，然后加入二抗（FITC 標記的羊抗鼠二抗）溫育45 min，最后加入DAPI 染料避光染色，PBS 沖洗3 遍后，使用倒置熒光顯微鏡對FITC 所呈現(xiàn)的綠色熒光和DAPI 所呈現(xiàn)的藍色熒光進行拍攝。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗

將Vero 細胞接種到6 孔板中，培養(yǎng)至單層，將病毒PEDV 與625 μg/mL GO-MnO₂ NSs 在4 ℃預(yù)混1 h 后加入6 孔板中，在37 ℃下培養(yǎng)1 h，同時設(shè)置陽性對照組及陰性對照組，先用PBS 沖洗后，加入DMEM（補充10 μg/mL 胰蛋白酶）分別培養(yǎng)至侵染后12、24、36、48 h；然后使用150 μL 裂解緩沖液收獲細胞，通過12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳解析裂解的樣品，并將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，參照文獻［16］的方法，最后使用化學(xué)發(fā)光成像儀進行顯色分析。

1.7 細胞因子表達水平的測定

干擾素刺激基因（ISGs）作為由干擾素（IFNs）誘導(dǎo)表達的基因，在宿主抵抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用。將Vero 細胞接種到24 孔板中，培養(yǎng)至單層。每孔加入625 μg/mL GO-MnO₂ NSs，同時設(shè)置細胞對照組，各3 個復(fù)孔，培養(yǎng)至侵染后24 h，每孔加入1.0 mL 的Trizol 試劑，通過Trizol 法［16］提取細胞樣品的總RNA，采用實時熒光定量PCR 檢測Ⅰ型干擾素（IFN?α、IFN?β）和干擾素刺激基因（ISG?20、ISG?54）2 種抗病毒因子的表達水平，進而評估GO-MnO₂NSs 對抗病毒因子表達水平的影響。

1.8 活性氧水平的測定

將Vero 細胞接種到24 孔板中，培養(yǎng)至單層，將病毒PEDV 與625 μg/mL GO-MnO₂ NSs 在4 ℃預(yù)混1 h 后加入24 孔板中，同時設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，37 ℃下培養(yǎng)1 h，PBS 沖洗后，用DMEM（補充10 μg/mL 胰蛋白酶）分別培養(yǎng)至侵染后12、24、36、48 h。然后加入10 mmol/L 2'，7'-二氯熒光二乙酸酯（DCFH-DA），37 ℃避光染色30 min，PBS 洗掉多余染料后，通過倒置熒光顯微鏡觀察細菌細胞熒光強度，測定細胞內(nèi)ROS 水平。

1.9 線粒體膜電位的測定

線粒體膜電位的降低常作為細胞凋亡早期的標志。將Vero 細胞接種到玻底細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至單層，將PEDV 病毒與625 μg/mL GO-MnO₂ NSs 在4 ℃預(yù)混1 h 后加入24 孔板中，同時設(shè)置病毒感染組、CCCP 陽性對照組和無處理的細胞陰性對照組，在37 ℃ 下培養(yǎng)1 h，PBS 沖洗后，用DMEM（補充10 μg/mL 胰蛋白酶）進一步培養(yǎng)至侵染后12 h，參照JC-1 試劑盒說明進行操作處理，最后用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，以JC-1 熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的檢測指標。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用完全隨機設(shè)計，每項試驗至少重復(fù)3 次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用 t-檢驗方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。在α=0.05 水平進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO-MnO₂ NSs 的透射電子顯微鏡表征

利用透射電子顯微鏡（TEM）對GO-MnO₂ NSs的表面形貌進行表征（圖1）。MnO₂ NSs 與氧化石墨烯薄層之間緊密結(jié)合，合成的GO-MnO₂ NSs 呈典型的片狀二維結(jié)構(gòu)，能提供更多的吸附結(jié)合位點。

2.2 GO-MnO₂ NSs 的XRD表征

通過X 射線衍射（XRD）測定GO、MnO₂ NSs 和GO-MnO₂ NSs 的結(jié)晶度，結(jié)果見圖2。GO 在10.76°處的特征峰對應(yīng)（111）晶面，MnO₂ NSs 在18.42°、36.62°和65.22°處的特征峰分別對應(yīng)于（101）、（006）和（119）晶面。GO-MnO₂ NSs 在10.68° 處出現(xiàn)與GO 的（111）晶面對應(yīng)的特征峰，且在17.96°、36.12°、64.7°處的特征峰分別與MnO₂ NSs 的（101）、（006）、（119）晶面對應(yīng)，證明GO-MnO₂ NSs 復(fù)合納米片材料的成功制備。

2.3 GO-MnO₂ NSs 的XPS表征

通過X 射線光電子能譜（XPS）光譜測定GOMnO₂NSs 的元素和表面化學(xué)狀態(tài)。圖3A 為GOMnO₂NSs 的XPS 總譜圖，在284.78、532.59、641.48eV 處有3 個峰，分別對應(yīng)C 1s、O 1s、Mn 2p。圖3B為GO-MnO₂ NSs 的C 1s 光譜，在283.88、286.06 eV處分別歸屬于C—C 鍵和C—O 鍵。圖3C 中O 1s 光譜中在531.71 和530.88 eV 處顯示出2 個擬合峰分別歸屬于Mn—O 鍵和O—H 鍵。圖3D 的Mn 2p 光譜中，在結(jié)合能640.88 和652.17 eV 處顯示出2 個擬合峰，分別對應(yīng)Mn 2p3/2、Mn 2p1/2。這些結(jié)果均表明GO-MnO₂ NSs 的制備完成。

2.4 GO-MnO₂ NSs 對細胞毒性的影響

采用MTT 法測定不同濃度GO-MnO₂ NSs 對Vero 細胞的細胞毒性的影響，結(jié)果見圖4。以1 250μg/mL GO-MnO₂ NSs 為最大質(zhì)量濃度，分別與Vero細胞孵育不同時間后，625 μg/mL GO-MnO₂ NSs細胞存活率均在85% 以上，說明此濃度的GOMnO₂NSs 細胞毒性小，生物相容性良好。因此選用625 μg/mL GO-MnO₂ NSs 進行后續(xù)試驗。

2.5 GO-MnO₂ NSs 的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC₅₀）

由圖5 可知，EC₅₀ 為140 μg/mL，即GO-MnO₂NSs 為140 μg/mL 時已經(jīng)能夠抑制半數(shù)病毒感染引起的細胞病變效應(yīng)，表明采用625 μg/mL GO-MnO₂NSs 能夠有效抑制PEDV 引起的細胞病變。

2.6 間接免疫熒光實驗結(jié)果

不同處理時間的GO-MnO₂ NSs 間接免疫熒光結(jié)果如圖6 所示。由圖6 可見，與陽性對照組（PEDV 病毒感染組）相比，經(jīng)GO-MnO₂ NSs 處理12、24、36 和48 h 后，試驗組的細胞綠色熒光信號明顯降低，即PEDV N 蛋白（FITC-羊抗鼠抗體標記）的表達量下降，這說明GO-MnO₂ NSs 可以抑制病毒感染細胞。

2.7 Western blot 實驗結(jié)果

Western blot 實驗結(jié)果如圖7 所示，與陽性對照組（PEDV 感染組）相比，經(jīng)過625 μg/mL GO-MnO2NSs 處理后，PEDV N 蛋白的表達量在12、24、36 和48 h 均明顯下調(diào)，說明GO-MnO₂ NSs 可以有效抑制病毒的復(fù)制，具有較好的抗病毒活性。

2.8 GO-MnO₂ NSs 對抗病毒因子表達的影響GO-MnO₂ NSs 對抗病毒因子表達的影響如圖8所示，與陰性對照組相比，GO-MnO₂ NSs 處理后IFN-α、IFN-β、ISG-20、ISG-54 的表達水平明顯上調(diào)，表明GO-MnO₂ NSs 可以通過刺激細胞中Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的mRNA 表達水平上調(diào)來抑制病毒感染。

2.9 GO-MnO₂ NSs 對活性氧的影響

病毒侵染后細胞會產(chǎn)生大量的活性氧，而過量的活性氧（ROS）會導(dǎo)致細胞DNA 的損傷。如圖9 所示，陽性對照組（病毒感染組）綠色熒光明顯，且隨著病毒侵染時間加長，綠色熒光增強。而GO-MnO₂NSs 處理組的綠色熒光明顯減弱，說明GO-MnO₂NSs 能夠抑制PEDV 感染后引起的ROS 過量產(chǎn)生。

2.10 GO-MnO₂ NSs 對線粒體膜電位的影響

如圖10 所示，在沒有GO-MnO₂ NSs 的情況下，PEDV 侵染Vero 細胞后，經(jīng)染色可以觀察到強烈的綠色熒光，表明病毒感染會導(dǎo)致線粒體膜電位下降。而經(jīng)GO-MnO₂ NSs 處理的試驗組中綠色熒光明顯降低，表明經(jīng)GO-MnO₂ NSs 處理能夠減少被感染細胞的線粒體膜電位降低的情況。以上結(jié)果表明GOMnO₂NSs 能夠通過抑制細胞凋亡來減輕PEDV 的感染。

3討論

近年來，許多功能性納米顆粒已被證實具有顯著的抗病毒作用，如量子點、金/銀納米顆粒、納米團簇、碳點、氧化石墨烯、硅材料、聚合物和樹枝狀聚合物［17］。作為潛在的抗病毒候選物，盡管在抗病毒機制和抑制效果方面存在差異，但這些功能性納米顆粒具有各自的突出特征。與其他具有不同結(jié)構(gòu)和尺寸的功能材料相比，二維納米材料憑借超大的比表面積，已成為抗病毒藥物遞送的優(yōu)良載體之一。

GO 是目前研究最廣泛的一種二維納米材料。本研究采用室溫超聲法合成GO-MnO₂ NSs 二維復(fù)合納米片材料，在XRD 表征結(jié)果中，GO 的（111）晶面與Chaiyakun 等［18］的研究結(jié)果一致；MnO₂ NSs 的（101）、（006）和（119）晶面與Peng 等［19］的研究結(jié)果一致。在XPS 的O 1s 光譜圖中，531.71 和530.88 eV處顯示出2 個擬合峰，可以歸因于晶格氧（Mn—O）和表面吸附的氧物種（如O—H）［20-21］。XRD 和XPS的表征結(jié)果證實GO-MnO₂ NSs 的制備已完成。

病毒侵入宿主后，宿主的先天免疫系統(tǒng)被觸發(fā)會迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（IFN），這些干擾素進一步與相應(yīng)的受體結(jié)合，并誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）表達，從而使細胞產(chǎn)生抗病毒防御［22］。本文對GOMnO₂NSs 處理后IFN?α、IFN?β、ISG?20、I SG?54 的基因表達水平進行研究，結(jié)果顯示這些基因均明顯上調(diào)，與已有相關(guān)研究中的變化趨勢一致［22］，表明GO-MnO₂ NSs 能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)干擾素及干擾素刺激基因等抗病毒因子的表達，從而增強細胞對抗病毒侵染的第一道防線作用。

此外，有諸多研究表明石墨烯相關(guān)二維材料與細菌、病毒和真菌之間的相互作用可能產(chǎn)生強大的抗菌和抗病毒活性。例如，氧化石墨烯（GO）衍生物已被證實在結(jié)合單純皰疹病毒1 型（HSV-1）時與細胞表面受體硫酸乙酰肝素競爭［23］；Donskyi 等［24］合成了一系列具有特定聚甘油硫酸酯和脂肪胺官能團的石墨烯衍生物，研究發(fā)現(xiàn)當二維納米片用C6-和C9-烷基鏈官能化時，其在Vero E6 細胞中顯示出對HSV-1 的有效抑制，且沒有任何明顯的毒性，這表明可以通過對石墨烯片的控制和官能化來獲得針對HSV-1 的抗病毒藥物。

綜上，本研究以PEDV 作為冠狀病毒的模式病毒，探索了GO-MnO₂ NSs 對PEDV 的抗病毒活性和抗病毒機制。結(jié)果表明，GO-MnO₂ NSs 復(fù)合納米材料的生物相容性較好，對PEDV 增殖的體外抑制效果顯著，可為冠狀病毒的防治提供新的思路和基礎(chǔ)。此外，基于GO 和MnO₂ NSs 經(jīng)近紅外照射會產(chǎn)生光熱的特性，可進一步探究其光熱抗病毒活性及實際應(yīng)用。

（責任編輯：趙琳琳）