基于形態(tài)性狀和SSR 標記的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

關(guān)鍵詞 克氏原螯蝦； 形態(tài)性狀； 微衛(wèi)星； 遺傳多樣性

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）03-0258-09

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱淡水小龍蝦，因具有較高的商業(yè)價值和食用價值而深受養(yǎng)殖者及消費者的歡迎［1-2］，現(xiàn)已被廣泛養(yǎng)殖，是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種［3］。但由于克氏原螯蝦屬于外來物種，在我國的養(yǎng)殖時間較短，加之人們對其種質(zhì)資源的保護和利用缺乏重視，這導致克氏原螯蝦種質(zhì)退化和病害肆虐等問題日益突出。為了克氏原螯蝦種質(zhì)資源的保護和良種培育，對克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)進行研究具有重要意義。

物種或種群的遺傳多樣性大小是其生存適應和發(fā)展進化的先決條件［4］。了解種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)有助于防止過度捕撈、保護種質(zhì)資源并確保種群的可持續(xù)開發(fā)。形態(tài)學方法是進行種群遺傳變異分析的最傳統(tǒng)、最直接的方法，已被廣泛應用于克氏原螯蝦的種群變異及種群鑒定等研究中［5-7］。但由于形態(tài)性狀受到遺傳和外部環(huán)境的共同作用，會隨著環(huán)境出現(xiàn)適應性進化［8］，基于形態(tài)學的研究方法在一定情況下不能準確反映遺傳變異信息［9］，且易受生物生長階段和數(shù)據(jù)處理方法的影響［10］。因此，形態(tài)學方法還需要與遺傳分子標記方法相結(jié)合，才能對研究對象的遺傳多樣性進行客觀的評估。微衛(wèi)星分子標記因其具有多態(tài)性和共顯性特征而在遺傳分析中越來越受青睞，已被廣泛應用于水產(chǎn)動物的遺傳多樣性分析、親子鑒定、連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等領(lǐng)域［11-13］。因此，為進行更加客觀地評估，本研究分別采用形態(tài)學和微衛(wèi)星分子標記的分析方法對來自廣西南寧（3 個群體）、湖北荊州（1 個群體）和江西湖口（1 個群體）共5 個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性進行分析，旨在更好地了解廣西南寧周邊地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，為克氏原螯蝦的綜合養(yǎng)殖和科學育種提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本試驗采集的5 個克氏原螯蝦群體，包括3 個廣西南寧群體（埃及群體、良慶群體和上林群體）、1 個湖北荊州群體和1 個江西湖口群體。其中，埃及群體為2019 年從埃及引種抗逆性較強的克氏原螯蝦品種親本的F2代；良慶群體為2019 年從湖北荊州和江西鄱陽湖引種親本自然交配產(chǎn)生的F3 代；上林群體為2018 年從湖北監(jiān)利引種親本的F4 代；荊州群體為2016 年采集自湖北荊州區(qū)長江中游南岸；湖口群體為2016 年采集自江西九江湖口縣，為長江與鄱陽湖的交匯處。各群體具體采樣信息見表1。對所有樣本進行了形態(tài)參數(shù)的測量，并取腹部肌肉組織保存于無水乙醇中待用于提取DNA。

1.2 形態(tài)參數(shù)測量與數(shù)據(jù)處理

參照王克行［14］的測量方法，使用游標卡尺（精度為0.01 mm）測量每個個體的形態(tài)性狀，包括全長（TL）、頭胸甲長（CL）、頭胸甲寬（CW）、腹節(jié)長（ASL）、腹節(jié)寬（ASW）（圖1）。為了消除形態(tài)特征的個體大小依賴性，測量的5 項形態(tài)性狀均標準化為以全長為基數(shù)的比值或2 個形態(tài)性狀的比值。本研究共使用了6 項形態(tài)比例參數(shù)，分別為：CL/TL、CW/TL、ASL/TL、ASW/TL、CL/CW 和ASL/ASW。

1.3 DNA的提取和PCR擴增

采用醋酸銨/異丙醇的方法［15］進行克氏原螯蝦基因組DNA 的提取，檢測濃度和質(zhì)量后，稀釋至100ng/μL 保存于?20 ℃冰箱備用。從Wang 等［16］開發(fā)的克氏原螯蝦微衛(wèi)星標記中選擇具有較高多態(tài)性的四堿基重復位點12 個，具體信息見表2。上述微衛(wèi)星位點引物對的正向引物5'端分別用FAM、HEX、ROX進行熒光修飾并合成。12 對熒光引物在5 個克氏原螯蝦群體上得到擴增并進行基因分型。PCR 擴增體系為10 μL，包括PCR Mix 5 μL，ddH2O 4 μL，正反引物（10 μmol/L）各0.25 μL 和DNA 模板（100 ng/μL）0.5 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，最適退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物由武漢擎科生物有限公司在ABI 3730XL 遺傳分析儀上進行分離，利用Gene Marker v1.75 軟件讀取各個體在各微衛(wèi)星位點的基因型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究中形態(tài)數(shù)據(jù)以平均值和標準差（SD）的形式呈現(xiàn)。采用SPSS 23.0 進行單因素方差分析，通過公式CV=（M₁-M₂）/（S₁+S₂）［17］計算差異系數(shù)（CV），式中M₁和M₂表示某項形態(tài)參數(shù)的平均值，S₁和S₂為標準差。若CV 值小于1.28，則表示2 個群體在這項形態(tài)參數(shù)上的差異未達到亞種水平。使用SPSS 23.0 軟件對6 項經(jīng)過標準化的形態(tài)參數(shù)采用逐步判別的方法進行判別分析，在計算每個群體的6 項形態(tài)比例參數(shù)的平均值后，采用歐式最短距離系統(tǒng)聚類法進行聚類分析。

在讀取各群體在各微衛(wèi)星位點的基因型并校準后，使用Cervus 3.0 軟件計算每個位點的等位基因數(shù)（number of alleles，N_a）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，H_e）和多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC），使用GenAIEx v6.51 軟件計算每個位點的有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，N_e）、固定指數(shù)（fixation index，F(xiàn)_st）及Nei’s 遺傳距離（geneticdistance，D_A）。并基于Nei’s 遺傳距離用Mega7.0 構(gòu)建UPGMA 系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學分析

1）單因素方差分析。分別對克氏原螯蝦雌雄群體的6 項形態(tài)比例參數(shù)進行單因素方差分析。結(jié)果表明，雌雄群體中，6 項形態(tài)比例參數(shù)在群體之間均存在顯著性差異。對克氏原螯蝦雌雄群體的形態(tài)比例參數(shù)進行差異分析，最大差異系數(shù)的結(jié)果顯示，雌性群體中，在6 項形態(tài)比例參數(shù)中僅有2 項（ASW/TL 和ASL/ASW）的最大差異系數(shù)值大于臨界值（1.28）；而雄性群體中有3 項（CL/TL、ASW/TL 和CL/CW）的最大差異系數(shù)值大于臨界值（表3）。群體之間的最大差異系數(shù)主要體現(xiàn)在上林群體和湖口群體之間，雄性群體間的形態(tài)差異大于雌性。

2） 判別分析。對克氏原螯蝦雌雄群體6 項形態(tài)比例參數(shù)的判別F 檢驗結(jié)果表明，判別結(jié)果均較好（Plt;0.01）。利用前2 個判別函數(shù)繪制散點圖可以更直觀地表現(xiàn)出5 個克氏原螯蝦群體的分離和重疊情況（圖2 A、B）。雌雄群體的散點圖顯示了相似的結(jié)果：5 個克氏原螯蝦雌性群體間存在不同程度的重疊，其中埃及群體和上林群體的重疊比例較大，相對難以區(qū)分，而良慶群體、荊州群體和湖口群體的重疊比例較小，相對容易區(qū)分。5 個克氏原螯蝦雄性群體的散布趨勢與雌性群體基于一致，但群體之間的重疊比例均較小。判別分析結(jié)果顯示，雌性群體中，湖口群體的判別準確率最高為82.61%，而上林群體的判別準確率最低為46.67%，綜合判別準確率為68.59%；雄性群體中，判別準確率最高的是埃及群體（83.33%），最低的仍是上林群體（66.67%），綜合判別準確率為73.60%（表4）。

3）聚類分析。在形態(tài)比例參數(shù)平均值聚類分析中，雌性和雄性群體呈現(xiàn)出相似的分組（圖2 C、D）。5 個群體被分為2 支，其中湖口群體單獨聚為一支，其他4 個群體則聚為另一支。結(jié)果表明，埃及群體、上林群體和荊州群體的形態(tài)相似度較高，湖口群體與其他4 個群體的形態(tài)差異較大。

2.2 微衛(wèi)星分析

1）群體遺傳多樣性分析。5個克氏原螯蝦群體在12 個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)介于4～12 個（平均9.250 個），有效等位基因數(shù)介于3.268 ～ 6.981 個（平均4.940個），觀測雜合度介于0.430～0.815，期望雜合度介于0.696～0.859，多態(tài)信息含量介于0.632～0.840（表5）。12 個微衛(wèi)星位點均屬于高度多態(tài)性位點（PICgt;0.5），可用于對克氏原螯蝦遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

5 個克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性參數(shù)如表6 所示。5 個群體的平均等位基因數(shù)在5.167～6.167，平均有效等位基因數(shù)在3.379～3.797，平均觀測雜合度值在0.574～0.644，平均期望雜合度值在0.674～0.729，平均PIC 值在0.618～0.674。結(jié)果表明，5 個群體均具有較高的遺傳多樣性，具體表現(xiàn)為：良慶群體和埃及群體的遺傳多樣性最高，湖口群體和上林群體次之，荊州群體最低。

2）群體遺傳分化分析。由表7 可見，5 個克氏原螯蝦群體間發(fā)生了不同程度的分化。其中，上林群體和良慶群體間的固定指數(shù)（Fst）最小，其次是荊州和埃及群體（0.026）與良慶和湖口群體（0.049），均屬于輕微分化水平（Fst lt;0.05），而其他群體間處于中度分化水平（0.05lt; Fst lt;0.15）。群體間遺傳距離為0.065～0.930，結(jié)果顯示，上林和良慶群體間的遺傳距離最?。?.065），荊州和上林群體間的遺傳距離最大（0.930）。

基于Nei’s 遺傳距離，采用UPGMA 方法構(gòu)建了5 個克氏原螯蝦群體的聚類樹。聚類結(jié)果顯示，研究中涉及的5 個群體可分為兩大分支（圖3），埃及群體和荊州群聚類為一支，而良慶群體先與上林群體聚類為一支后再與湖口群體聚類為另一支。

3 討論

形態(tài)學分析方法是研究物種遺傳變異的有效方法之一［18］。在本研究中，單因素方差分析結(jié)果顯示，6 項形態(tài)比例參數(shù)在群體之間均存在顯著性差異，且最大形態(tài)差異主要體現(xiàn)在上林群體和湖口群體之間。判別分析結(jié)果顯示，在281 尾克氏原螯蝦樣本中，有199 尾（70.82%）根據(jù)其外部形態(tài)被正確分類，分類正確率低于韓曉磊等［5］、張萌等［19］、徐濱等［6］的研究結(jié)果。這與本研究中使用的形態(tài)參數(shù)較少有很大關(guān)系。基于形態(tài)的聚類結(jié)果顯示，埃及群體、上林群體和荊州群體的形態(tài)相似性最大，良慶群體與這3個群體聚為一支，而湖口群體單獨聚為一支。聚類的結(jié)果與群體的地理分布的遠近并無一致性，主要體現(xiàn)在荊州群體的異常分類?？耸显r作為漁業(yè)產(chǎn)品，由于其經(jīng)濟的重要性被大量開發(fā)，并在世界范圍內(nèi)廣泛養(yǎng)殖［20］。因此，其苗種或成蝦可能通過貿(mào)易等其他非自然因素存在于地理位置較遠的水域。Yue 等［21］的研究也表明，克氏原螯蝦群體的遺傳距離與其地理距離的遠近并無顯著相關(guān)性。遺傳距離和固定指數(shù)反映了不同群體之間遺傳關(guān)系的遠近親疏。不同群體間的固定指數(shù)越大，群體間的遺傳分化水平就越高［10， 22］，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近［23］。在本研究中，5 個克氏原螯蝦群體的遺傳距離趨勢與遺傳分化系數(shù)趨勢一致。其中，埃及群體和荊州群體的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，這與埃及群體與荊州群體的形態(tài)的相似性一致，具體原因有待進一步研究。良慶群體與上林群體的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，表明兩者的親本在被引種前可能已產(chǎn)生了基因交流或兩個群體在養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生了基因交流。另外，良慶群體與其雜交親本來源地的2 個早期野生群體的遺傳距離較大，可能原因有：（1）因克氏原螯蝦養(yǎng)殖熱的興起造成各地群體間的基因混雜，導致雜交親本與早期野生群體間遺傳差異較大；（2）雜交后的養(yǎng)殖群體在養(yǎng)殖過程中與其他群體產(chǎn)生了基因混雜。埃及群體作為一個從埃及引種的養(yǎng)殖群體，與上林群體和良慶群體的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠，但與生活在相近環(huán)境下的上林群體和良慶群體具有較高的形態(tài)相似度。這與甲殼動物較高的環(huán)境可塑性有關(guān)［24］，此外，物種外部形態(tài)的變化也通常被解釋為對棲息地環(huán)境的適應［25-26］。

物種的遺傳多樣性越高，對環(huán)境的適應能力越強，進化的潛力就越大。對物種遺傳多樣性的研究是育種研究的基礎(chǔ)，明確其遺傳多樣性，獲得理想的種質(zhì)資源后才能更好地進行育種研究，提高育種效率［27-28］。本研究結(jié)果顯示，12 個位點在5 個群體上均表現(xiàn)出高多態(tài)性（0.632lt;PIClt;0.840）［29］，滿足對克氏原螯蝦遺傳多樣性分析的要求。雜合度表示位點上雜合子的頻率，是對群體的遺傳多樣性評價的重要指標之一，雜合度越高，遺傳變異程度越大。期望雜合度是指當種群處于平衡狀態(tài)時的理論雜合子頻率，與觀測雜合度相比，能夠更準確地反映群體的遺傳多樣性水平［10，30-31］。本研究中，12 個微衛(wèi)星位點的期望雜合度平均值為0.786，表明群體雜合度水平較高，與以往的報道相比，高于江蘇地區(qū)［32］、長江水系的一些群體［33-35］和廣西地區(qū)的其他群體［36］，與安徽地區(qū)［37-38］和原產(chǎn)地種群［39］相當。本研究中的5個克氏原螯蝦群體均具有高水平的遺傳多樣性（0.674lt;Helt;0.840，0.618lt;PIClt;0.674），5 個群體的平均期望雜合度均遠高于平均觀測雜合度，說明在5 個克氏原螯蝦群體中均存在雜合子丟失現(xiàn)象［40］，這可能是由于群體的規(guī)模較小且出現(xiàn)了瓶頸效應，產(chǎn)生了遺傳漂變等原因，導致了等位基因丟失［36］。

綜上所述，本研究基于12 個微衛(wèi)星位點對克氏原螯蝦的養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行評估，結(jié)果表明廣西南寧周邊的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性，從國外引種或國內(nèi)不同地理來源群體的雜交可能是提高克氏原螯蝦群體遺傳多樣性的重要途徑，該研究為克氏原螯蝦的綜合養(yǎng)殖和科學育種提供了參考資料。

（責任編輯：邊書京）