基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子模擬的“黃芪補(bǔ)肺飲”協(xié)同氧化及3D打印研究

摘 要： 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)“黃芪補(bǔ)肺飲”調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激分子機(jī)制進(jìn)行研究，篩選出主要活性成分（山柰酚、槲皮素、豆甾醇）和核心靶點(diǎn)（AKT1、MMP9、CASP3），通過(guò)基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，從分子水平推測(cè)其在“黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化應(yīng)激過(guò)程中的作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示：活性成分與靶點(diǎn)均能結(jié)合形成穩(wěn)定構(gòu)象，揭示了“黃芪補(bǔ)肺飲”多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)。聯(lián)合指數(shù)的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：烏梅、黃芪、五味子、麥冬的最佳配比為4∶1∶1∶4，具有最高清除率及最佳協(xié)同效果。利用3D打印技術(shù)將最佳配比的“黃芪補(bǔ)肺飲”制成凝膠，能提高其便捷性和緩釋能力，為傳統(tǒng)食療的規(guī)?；a(chǎn)提供了新思路。

關(guān)鍵詞： 黃芪補(bǔ)肺飲;氧化應(yīng)激;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;抗氧化能力;聯(lián)合指數(shù)

中圖分類號(hào)： TS 972.161"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號(hào)：

2095-8730（2024）03-0088-09

氧化應(yīng)激是指在內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致活性氧過(guò)量而出現(xiàn)的病理狀態(tài)［1］。ZHA等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)累積的氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)病程和早衰。研究表明，抑制氧化應(yīng)激對(duì)于慢性阻塞性肺疾?。?］、心血管疾病［4］、糖尿?。?］等多種慢性病患者來(lái)說(shuō)都是一種有效手段。然而，迄今為止，并沒有足夠的針對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)手段。雖然在藥物治療方面已經(jīng)有如天麻素注射液與吡咯烷酮類藥物的聯(lián)合治療［6］方式，維生素D［7］和維生素E［8］等可以有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的治療方法，但這些西藥不總是有效并且可能會(huì)帶來(lái)副作用［9-10］。因此尋找針對(duì)氧化應(yīng)激的安全有效的輔助調(diào)節(jié)方法迫在眉睫。

近年來(lái)，藥食同源養(yǎng)生理念備受青睞，廣泛用于預(yù)防和治療慢性疾?。?1］?！包S芪補(bǔ)肺飲”是中華民族食療養(yǎng)生文化瑰寶之一，由黃芪、麥冬、五味子、烏梅煎煮制成。其中，黃芪、烏梅于2021年被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為藥食同源食品，而麥冬、五味子被列于可用于保健食品的中藥名單。從中醫(yī)視角看，氧化應(yīng)激是肺部疾病發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［12］，因此本研究借助補(bǔ)肺方“黃芪補(bǔ)肺飲”研究其抗氧化應(yīng)激效果，為開發(fā)“黃芪補(bǔ)肺飲”新的應(yīng)用方式提供有益參考。本方以黃芪補(bǔ)肺、益氣、固表，輔以五味子、烏梅、麥冬，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的生物活性功能［13］。近年來(lái)，已有大量體內(nèi)外研究表明，黃芪、麥冬、五味子和烏梅中的活性成分可輔助調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。如HAO等［14］發(fā)現(xiàn)黃芪中的主要活性物質(zhì)黃芪甲苷IV對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的由H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有潛在的保護(hù)作用。WU等［15］通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥冬不但可以抑制炎癥和氧化應(yīng)激，還能通過(guò)這種抑制作用改善阿霉素誘導(dǎo)的慢性心力衰竭。五味子和烏梅也已被證實(shí)具有抗氧化應(yīng)激效果［16-17］。上述研究皆表明“黃芪補(bǔ)肺飲”對(duì)氧化應(yīng)激有輔助調(diào)節(jié)作用，但其抗氧化應(yīng)激的具體作用機(jī)制尚不明確，關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)仍有待確認(rèn)。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子模擬，從分子層面上對(duì)“黃芪補(bǔ)肺飲”輔助調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的機(jī)制進(jìn)行探究。

3D打印技術(shù)作為一項(xiàng)重要的新型加工技術(shù)，可以設(shè)計(jì)出造型獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)配比精準(zhǔn)、滿足個(gè)性化定制需求的新型食品，具有廣闊的發(fā)展前景。普通水凝膠物理性能較差，穩(wěn)定性相對(duì)不足，而3D打印水凝膠結(jié)合了3D打印和水凝膠的優(yōu)點(diǎn)，機(jī)械強(qiáng)度高，備受研究人員的關(guān)注［18］。YAN等［19］從中藥中提取活性多糖和羧甲基殼聚糖并將其制成3D打印凝膠。KOSHOVYI等［20］將桉樹水提取物納米乳化后與聚環(huán)氧乙烷混合制成具有克服葡萄球菌感染的3D打印凝膠。故而本項(xiàng)目擬采用3D打印技術(shù)，通過(guò)配方優(yōu)化將“黃芪補(bǔ)肺飲”制成強(qiáng)度適宜且穩(wěn)定性好的可食用凝膠，提高其食用便捷性，進(jìn)而為其規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黃芪、麥冬、五味子、烏梅：江蘇揚(yáng)州聯(lián)誼農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);乙醇：上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司;橄欖油、高?；参锬z、海藻酸鈉、過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SS-1022型高速多功能粉碎機(jī)：武義海納電器有限公司;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Infinite F50酶標(biāo)儀：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司;UV-6100S型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司;1-14K型離心機(jī)：北京博勱行儀器有限公司;KQ5200型超聲機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司;LuckyBot ONE型食品3D打印機(jī)：南京威布三維科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥膳的活性成分及靶點(diǎn)收集

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索“黃芪補(bǔ)肺飲”中的4種藥材，以黃芪（Hedysarum multijugum maxim）、麥冬（Ophiopogon japonicus）、五味子（Schisandrae chinensis fructus）、烏梅（Mume fructus）為關(guān)鍵詞初步獲取活性成分，同時(shí)對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充［21-22］。以口服生物利用度（Oral bioavailability， OB）≥30％和類藥性指數(shù)（Drug-likeness， DL）≥0.18為篩選條件確定活性成分。檢索活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息并將所得靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Homo sapiens”為限制條件轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一形式。

1.2.2 篩選氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)和“黃芪補(bǔ)肺飲-氧化應(yīng)激”交叉靶點(diǎn)

以“氧化應(yīng)激”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得氧化應(yīng)激的潛在靶點(diǎn)。篩選出氧化應(yīng)激和“黃芪補(bǔ)肺飲”的交叉靶點(diǎn)，并導(dǎo)入STRING 11.0，物種限定為“Homo sapien”，獲取中等置信度（大于等于0.4）的蛋白質(zhì)相互作用信息。

1.2.3 “黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖繪制及核心靶點(diǎn)篩選

利用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。為了系統(tǒng)地分析該網(wǎng)絡(luò)，MCODE、Centiscape 2.2和NetworkAnalyzer插件被用于聚類分析和核心靶點(diǎn)篩選。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為度截止值（Degree Cutoff）為2、節(jié)點(diǎn)得分截止值（Node Score Cutoff）為0.5和K值（K-Core）為2，選出網(wǎng)絡(luò)中的核心聚類模塊（Cluster）。通過(guò)Centiscape 2.2插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)介度中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）和借助度中心性（Degree），得到核心靶點(diǎn)。

1.2.4 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集的分析

通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行在線基因ID轉(zhuǎn)換，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function，MF）的GO和KEGG富集分析，以校正后P值lt;0.05為條件進(jìn)行“黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化應(yīng)激的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路分析。

1.2.5 分子對(duì)接

分別從PubChem及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB）獲取關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)文件。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件去水加氫，采用AutoDock Vina對(duì)關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算最佳結(jié)合能并利用PyMol對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行可視化分析［23］。

1.2.6 抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.6.1 “黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化物質(zhì)提取

煎水取汁是“黃芪補(bǔ)肺飲”的常規(guī)制作方法，其雖能提取“黃芪補(bǔ)肺飲”中的有效成分，但效率相對(duì)較低［24］。為了更高效地提取“黃芪補(bǔ)肺飲”中的有效成分，縮短提取時(shí)間，本研究對(duì)“黃芪-麥冬-五味子-烏梅”粉末進(jìn)行加熱超聲，以更高效地模擬實(shí)際情況。參照任晨汐等［25］的方法，分別將黃芪、麥冬、五味子、烏梅置于60 ℃的烘箱中烘干12 h，粉碎后過(guò)0.25 mm篩，以料液比1∶10（g／mL）加入超純水，置于50 ℃、超聲功率300 W條件下提取20 min，以8 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液為待測(cè)液。

1.2.6.2 “黃芪補(bǔ)肺飲”復(fù)配方式篩選

參照李小龍等［26］的方法，對(duì)黃芪、麥冬、五味子、烏梅進(jìn)行混料設(shè)計(jì)中的極端頂點(diǎn)設(shè)計(jì)（表1），結(jié)合抗氧化試驗(yàn)以及聯(lián)合指數(shù)進(jìn)行“黃芪補(bǔ)肺飲”最佳配比優(yōu)化。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參照BINSAN等［27］的方法，將7 mmol／L ABTS和2.45 mmol／L K2S2O8等體積混勻，常溫避光放置12～16 h，用95％乙醇稀釋至405 nm處吸光度為1.4，得到ABTS+溶液，分別移取10 μL質(zhì)量濃度為20、40 mg／mL的不同配比“黃芪補(bǔ)肺飲”水提液，與200 μL ABTS工作液充分混合，在室溫下靜置2～6 min，通過(guò)公式計(jì)算ABTS+自由基清除率［27］。選出清除率較高的“黃芪補(bǔ)肺飲”組別，分別移取10 μL質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg／mL的不同配比“黃芪補(bǔ)肺飲”水提液，重復(fù)上述操作。

ABTS+自由基清除率（％）=1-A1-A2A0×100（1）

式中：A1表示移取10 μL不同質(zhì)量濃度的提取樣液，加入200 μL ABTS 工作液并混合均勻，室溫避光反應(yīng)20 min，于405 nm條件下測(cè)定上清液的吸光度值;A0表示用10 μL蒸餾水代替樣液，測(cè)定405 nm處的吸光度值;A2表示用200 μL蒸餾水代替ABTS溶液，測(cè)定405 nm處的吸光度值。

1.2.6.4 “黃芪-麥冬-五味子-烏梅”聯(lián)合指數(shù)計(jì)算

參照CHOU等［28］的方法，通過(guò)計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（Combination Index，CI）評(píng)價(jià)協(xié)同作用。聯(lián)合指數(shù)越低，協(xié)同效果最好?；诘刃ё饔煤椭兄刀ɡ碛?jì)算 CI 值，計(jì)算公式如下：

CI=D1（Dx）1+D2（Dx）2+…+Dn（Dx）n（2）

式中：D1，D2，…，Dn 表示n種組分聯(lián)合作用時(shí)，抑制率為50％的每個(gè)組分各自的作用濃度;（Dx）1，（Dx）2，…，（Dx）n 表示n種組分單獨(dú)作用時(shí)，抑制率為50％的作用濃度;CI=1、CIlt;1和CIgt;1分別表示受試物具有加合、協(xié)同和拮抗作用。

1.2.7 “黃芪補(bǔ)肺飲”3D打印凝膠的制備

參照Z(yǔ)HOU等［29］的方法，稱取1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高?；参锬z、適量的橄欖油，緩慢連續(xù)加入至97 mL含“黃芪補(bǔ)肺飲”20 mg／mL水提液中，室溫下經(jīng)300 r／min轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌10 min，得到均勻的混合物。3D 打印機(jī)的噴頭直徑為0.5 mm，打印速度為5 mm／s，打印溫度為25 ℃。構(gòu)建40 mm×40 mm×5 mm（長(zhǎng)×寬×高）的3D打印立方體模型，底部三層填充密度為100％，內(nèi)層的填充密度為50％，頂層設(shè)置多個(gè)5 mm×5 mm×2 mm（長(zhǎng)×寬×高）的立方體空隙，立方體之間的間隔為4 mm。將制備的質(zhì)地均勻的混合物通過(guò)3D打印機(jī)制成“黃芪補(bǔ)肺飲”3D打印凝膠。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行IC50的預(yù)測(cè)，采用CompuSyn軟件進(jìn)行聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算，采用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 “黃芪補(bǔ)肺飲”有效成分及靶點(diǎn)的篩選

以O(shè)B≥30％和DL≥0.18為篩選條件，刪除重復(fù)項(xiàng)后，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)參考文獻(xiàn)中共篩選出44個(gè)“黃芪補(bǔ)肺飲”的有效活性成分，度值（Degree）排名前10的活性成分見表2。在這44個(gè)化合物中，黃芪含有17個(gè)、五味子含有8個(gè)、烏梅含有8個(gè)、麥冬含有14個(gè)，其中3種化合物山柰酚、槲皮素、豆甾醇來(lái)源于“黃芪補(bǔ)肺飲”中的多種食材，可能是“黃芪補(bǔ)肺飲”中具有抗氧化應(yīng)激作用的關(guān)鍵活性成分。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收集“黃芪補(bǔ)肺飲”活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，得到293個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)以及“黃芪補(bǔ)肺飲-氧化應(yīng)激”交叉靶點(diǎn)的獲取

在DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵字“Oxidative stress”，分別獲得4 954個(gè)和203個(gè)氧化應(yīng)激靶點(diǎn)（圖1.A）。刪除重復(fù)項(xiàng)后，共得到5 094個(gè)氧化應(yīng)激靶點(diǎn)。如圖1.B所示，氧化應(yīng)激和黃芪補(bǔ)肺飲共有222個(gè)交叉靶點(diǎn)，由此可初步推測(cè)，“黃芪補(bǔ)肺飲”通過(guò)“多成分-多靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。

2.3 “黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

在Cytoscape 3.9.1中構(gòu)建“黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并通過(guò)Degree值分別對(duì)活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行排序。其中橢圓形代表活性成分，矩形代表活性靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。如附圖1所示，“黃芪-麥冬-五味子-烏梅”44個(gè)活性成分和293個(gè)靶點(diǎn)之間共涉及341個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 042條邊。其中，Degree值最高的活性成分是槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、豆甾醇（MOL000449），可能在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

2.4 核心團(tuán)簇及核心靶點(diǎn)的篩選

為了進(jìn)一步可視化和分析“黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”，運(yùn)用Cytoscape 3.9.1中的MCODE算法，將目標(biāo)分為5個(gè)獨(dú)立的團(tuán)簇，核心團(tuán)簇1由95個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 495個(gè)相互作用（邊）組成;核心團(tuán)簇2由33個(gè)節(jié)點(diǎn)和121個(gè)相互作用（邊）組成;核心團(tuán)簇3由40個(gè)節(jié)點(diǎn)和123個(gè)相互作用（邊）組成;核心團(tuán)簇4由9個(gè)節(jié)點(diǎn)和13個(gè)相互作用（邊）組成;核心團(tuán)簇5由3個(gè)節(jié)點(diǎn)和3個(gè)相互作用（邊）組成，具體節(jié)點(diǎn)如表3所示。通過(guò)Centiscape 2.2插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)Betweenness、Closeness和Degree并進(jìn)行排序（表4）。選擇排名最高的AKT1（n=91）、MMP9（n=90）、CASP3（n=89）作為核心靶點(diǎn)。

2.5 GO富集分析

為了進(jìn)一步探索“黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化應(yīng)激的潛在機(jī)制，通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析。按-lgP由大到小排名，取排名前5的通路進(jìn)行GO富集分析。雌激素反應(yīng)（GO：0032355）、衰老（GO：0007568）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（GO：0001934）、細(xì)胞缺氧反應(yīng)（GO：0071456）、細(xì)胞遷移的正調(diào)控（GO：0030335）等生物學(xué)過(guò)程在參與氧化應(yīng)激的調(diào)控中起主要作用。HUANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，良好地調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激可以促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)。SROUGI等［31］的研究同樣證實(shí)氧化應(yīng)激能積極調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。細(xì)胞組分集中于線粒體膜（GO：0031966）、突觸（GO：0045202）、GABA-A受體復(fù)合物（GO：1902711）、受體復(fù)合物（GO：0043235）、突觸后膜（GO：0099055）等成分。其中，RAZA［32］、SCHEFF等［33］的研究同樣論證了調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過(guò)程中有胞質(zhì)溶膠、突觸后膜的參與。分子功能富集在類固醇激素受體（GO：0003707）、轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合（GO：0001221）、雌激素反應(yīng)元件結(jié)合（GO：0034056）、細(xì)胞外配體門控離子通道活性（GO：0005230）、蛋白酶結(jié)合（GO：0002020）等。其中，核心靶點(diǎn)MMP9能通過(guò)抑制線粒體損傷和氧化應(yīng)激來(lái)減弱瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化，從而體現(xiàn)出在CAVS進(jìn)展過(guò)程中線粒體代謝和氧化應(yīng)激中的潛在作用［34］。

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析顯示，“黃芪補(bǔ)肺飲”可以影響多通道，其中與氧化應(yīng)激相關(guān)性較高的包括朊病毒?。╤sa05020）、細(xì)胞衰老（hsa04218）、糖尿病性心肌病（hsa05415）、胰腺癌（hsa05212）、膀胱癌（hsa05219）、阿爾茨海默?。╤sa05010）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（hsa05167）、TNF信號(hào)通路（hsa04668）、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾?。╤sa05022）、人巨細(xì)胞病毒感染（hsa05163）、IL-17信號(hào)通路（hsa04657）、前列腺癌癥（hsa05215）、化學(xué)致癌-受體激活（hsa05207）、非酒精性脂肪肝（hsa04932）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（hsa05418）、乙型肝炎（hsa05161）、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（hsa05417）、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用（hsa0493）、化學(xué)致癌作用-活性氧（hsa05208）、癌癥的發(fā)病途徑（hsa05200）等。其中，GALKIN［35］等研究發(fā)現(xiàn)TNF信號(hào)通路會(huì)引起異?；罨?，從而導(dǎo)致內(nèi)表皮細(xì)胞的損傷及凋亡，而線粒體靶向抗氧化劑SkQR1可以抑制TNF信號(hào)通路，表明TNF信號(hào)通路是抑制氧化應(yīng)激的主要途徑。因此，“黃芪補(bǔ)肺飲”可能通過(guò)上述途徑發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用。

2.7 分子對(duì)接

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，分別獲得了三個(gè)關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)。為進(jìn)一步研究“黃芪補(bǔ)肺飲”的抗氧化應(yīng)激作用，采用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，從而探究關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合行為。如附表1所示，關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合能都低于-5 kcal／mol，表明關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、MMP9和CASP3能夠分別與活性成分山柰酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）和豆甾醇（MOL000449）穩(wěn)定結(jié)合。槲皮素與MMP9形成了以范德華力、氫鍵、Pi-陽(yáng)離子、π-σ相互作用、π-π堆疊、Pi-烷基等作用力共同驅(qū)動(dòng)的復(fù)合物，結(jié)合能最低（-10.7 kcal／mol），結(jié)合構(gòu)象最穩(wěn)定，表明其在“黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化應(yīng)激過(guò)程中作用顯著，具有極大的應(yīng)用潛力。此外，已有研究證實(shí)豆甾醇的抗氧化作用［36］，其同樣與本研究篩選出的核心靶點(diǎn)具有相當(dāng)廣譜的親和力（結(jié)合能lt;-7 kcal／mol）。MMP9是一種重要的蛋白水解酶，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，是線粒體代謝紊亂和氧化應(yīng)激的新型生物標(biāo)志物［37］。本研究中，3種活性成分在與MMP9結(jié)合時(shí)均呈現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象（結(jié)合能lt;-9 kcal／mol），顯示出較高的親和力。綜上，分子對(duì)接結(jié)果顯示，“黃芪補(bǔ)肺飲”的主要活性成分和靶點(diǎn)都能自發(fā)且穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)一步論證了“黃芪補(bǔ)肺飲”抗氧化應(yīng)激的功能。

2.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

2.8.1 黃芪、麥冬、五味子和烏梅的抗氧化能力

在ABTS+自由基清除試驗(yàn)中，烏梅、黃芪、五味子、麥冬的 IC50 值分別是0.269 mg／mL、1.176 mg／mL、0.874 mg／mL和0.602 mg／mL。其中，烏梅的ABTS+自由基清除能力最強(qiáng)，而黃芪的ABTS+自由基清除能力最弱。

2.8.2 “黃芪補(bǔ)肺飲”的配比優(yōu)化

為了選出“黃芪補(bǔ)肺飲”自由基清除能力的最佳配比，參照表1進(jìn)行不同配比“黃芪補(bǔ)肺飲”的ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，第1、8、9、10、12組的清除率在40 mg／mL時(shí)就已經(jīng)超過(guò)90％，明顯高于其他組（在20mg／mL時(shí)，ABTS+自由基清除率分別為60％、72％、94％、95％和95％，在40 mg／mL時(shí)，ABTS+自由基清除率分別為96％、97％、95％、98％和95％）。所以進(jìn)一步將第1、8、9、10、12組的樣液稀釋50倍，繼續(xù)測(cè)定ABTS+自由基清除率。如圖2所示，第1、10、12組顯示出較高的ABTS+自由基清除率。

2.8.3 不同“黃芪補(bǔ)肺飲”復(fù)配體系的協(xié)同作用評(píng)價(jià)

眾所周知，食材按照不同比例進(jìn)行復(fù)配可能會(huì)出現(xiàn)不同的相互作用（協(xié)同、加合、拮抗）。因此，本研究基于聯(lián)合指數(shù)探究“黃芪補(bǔ)肺飲”按不同比例復(fù)配后的ABTS+清除效果，以期選出“黃芪補(bǔ)肺飲”的最佳配比［38-40］。對(duì)第1、10、12組進(jìn)行聯(lián)合指數(shù)的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)CI值均小于1（第1、10、12組的CI值分別為0.375、0.714、0.261），表明第1、10、12組復(fù)配體系皆為協(xié)同作用。第12組的ABTS+自由基清除率最高，且協(xié)同效果最好，所以第12組是“黃芪補(bǔ)肺飲”的最佳配比。

2.9 “黃芪補(bǔ)肺飲”凝膠3D打印

最佳配比“黃芪補(bǔ)肺飲”的3D凝膠打印樣品見圖3。在橄欖油濃度優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)橄欖油濃度降低為1～2 mL時(shí)，由于凝膠強(qiáng)度過(guò)高，在打印過(guò)程中出現(xiàn)堵塞噴嘴的情況，導(dǎo)致凝膠細(xì)絲擠出時(shí)連續(xù)性差、成品外觀出現(xiàn)毛刺和缺陷。當(dāng)橄欖油濃度升高為4～5 mL時(shí)，打印凝膠出現(xiàn)坍塌，自支撐能力差。隨著橄欖油濃度的增加，擠出流暢度呈上升趨勢(shì)但自支撐能力呈下降趨勢(shì)。濃度過(guò)高不利于自支撐性，濃度過(guò)低不利于擠出性。考慮到擠出性和自支撐性之間的矛盾，發(fā)現(xiàn)橄欖油濃度為3 mL時(shí)凝膠強(qiáng)度適宜，在打印過(guò)程中未出現(xiàn)堵塞3D打印機(jī)噴嘴的情況，凝膠細(xì)絲能夠連續(xù)擠出且速度適宜。打印樣品效果圖光滑平整，外壁基本垂直，外觀上幾乎沒有缺陷，在打印完成后也能自我支撐并保持一定高度，具有良好的穩(wěn)定性。

綜上所述，基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定以1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高酰基植物凝膠、3 mL的橄欖油混合97 mL含20 mg／mL的“黃芪補(bǔ)肺飲”為配方的3D打印凝膠的打印效果較好，有大規(guī)模投入市場(chǎng)的可能性。

3 結(jié)論

“黃芪補(bǔ)肺飲”由黃芪、麥冬、五味子、烏梅煎煮制成，具有補(bǔ)肺、益氣、固表等多種生物活性功能。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接等技術(shù)對(duì)其調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的分子機(jī)制進(jìn)行研究，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集“黃芪補(bǔ)肺飲”的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)。借助Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“黃芪補(bǔ)肺飲-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用AutoDock Vina對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接并評(píng)估其結(jié)合能力與作用模式，進(jìn)而采用聯(lián)合指數(shù)的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)確定“黃芪補(bǔ)肺飲”的最佳配比。以此為基礎(chǔ)，按1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高酰基植物凝膠、3 mL的橄欖油、97 mL 20 mg／mL“黃芪補(bǔ)肺飲”的配比進(jìn)行3D打印可食用凝膠制備。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，山柰酚、槲皮素、豆甾醇為“黃芪補(bǔ)肺飲”主要活性成分，AKT1、MMP9和CASP3為核心靶點(diǎn)，且均具有較高結(jié)合能?；诼?lián)合指數(shù)的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏梅、黃芪、五味子、麥冬的最佳配比為4∶1∶1∶4，顯示出最高清除率及最佳協(xié)同效果。本研究初步揭示“黃芪補(bǔ)肺飲”的“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”模式能協(xié)同調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，進(jìn)而為其工業(yè)化生產(chǎn)與精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

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Study on synergistic oxidation and 3D printing of “Huangqi Bufei Yin” based on network pharmacology and molecular docking

GAO Mingyuan， REN Chenxi， FENG Yining， LI Ning， XIAO Lixia， YANG Zhenquan， GUAN Tianzhu

（School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127， China）

Abstract： In this research， the molecular mechanism of “Huangqi Bufei Yin” regulating oxidative stress was studied using network pharmacology and molecular docking. The main active ingredients （kaempferol， quercetin and stigmasterol） and core targets （AKT1， MMP9 and CASP3） were screened out. Through Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis， the role of these components in the antioxidative stress process of “Huangqi Bufei Yin” was inferred at the molecular level. The molecular docking results showed that the active ingredients could bind to the targets to form stable conformations， revealing the characteristics and advantages of “Huangqi Bufei Yin” in terms of the multi-component， multi-target and multi-pathway. In addition， in vitro antioxidant experiment based on the combination index indicated that the optimal ratio of Mume fructus， Hedysarum multijugum maxim， Schisandrae chinensis fructus and Ophiopogon japonicus was 4∶1∶1∶4， showing the highest scavenging rate and best synergistic effect. Using 3D printing technology， the optimally ratioed" of “Huangqi Bufei Yin” was made into a gel， improving its convenience and slow-release ability， providing a new idea for the large-scale production of traditional diet therapy.

Key words：

“Huangqi Bufei Yin”; oxidative stress; network pharmacology; molecular docking; antioxidant capacity; combination index

（責(zé)任編輯：趙 勇）