紅托竹蓀液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：【目的】開展紅托竹蓀液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，為紅托竹蓀液體菌種應(yīng)用于工廠化栽培提供參考?！痉椒ā恳跃z體生物量為指標(biāo)，考察培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及培養(yǎng)方式對(duì)紅托竹蓀液體發(fā)酵的影響?！窘Y(jié)果】麥芽糖漿、玉米糖漿、玉米粉、發(fā)酵專用豆粕粉和黃豆粉可作為紅托竹蓀液體發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米糖漿用量為20 g/L時(shí)，菌絲體生物量最大，為7.13 g/L。玉米粉、發(fā)酵專用豆粕粉、黃豆粉在供試范圍內(nèi)（0～4 g/L）可顯著促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，當(dāng)使用量為4 g/L時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，分別為2.1 g/L、1.8 g/L、1.7 g/L?！窘Y(jié)論】采用250 mL三角瓶，紅托竹蓀液體發(fā)酵的適宜培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 5.5，裝液量100～120 mL，接種量16%，培養(yǎng)時(shí)間14 d。

關(guān)鍵詞：紅托竹蓀；液體菌種；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：S646.8" " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " 文章編號(hào)：2095-5774（2024）04-0278-07

Screening of Liquid Fermentation Medium and culture condition for Dictyophora rubrovolvata

Jiang Xiaoling，Lin Hui，Yang Chi，Xiao Donglai，Liu Xiaoyu，Lin Yanquan，Ma Lu*

（Institute of Edible Fungi，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences/National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding amp; Cultivation of Featured Edible Fungi，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China）

Abstract：【Objective】 Screen the liquid spawn fermentation medium for Dictyophora rubrovolvata and provide references for the application of liquid spawn of D. rubrovolvata in industrialized cultivation. 【Method】The effects of medium nutrients and culture methods on liquid fermentation of D. rubrovolvata were investigated with the mycelium biomass as the indicator. 【Result】 Maltose syrup，corn syrup，corn flour，soybean powder for fermentation and soybean flour are suitable for the liquid fermentation of D. rubrovolvata. When the amount of corn syrup was 20 g/L，the mycelial biomass was 7.13 g/L. Corn flour，soybean powder for fermentation and soybean flour could significantly promote the mycelial biomass in the test range，when the usage was 4 g/L，the mycelial biomass reach the maximum，which were 2.1 g/L，1.8 g/L，and 1.7 g/L respectively. 【Conclusion】Using 250 mL Erlenmeyer flasks，the suitable culture conditions for D. rubrovolvata were listed as follows：initial medium pH 5.5，liquid volume 100-120 mL，inoculation volume 16%，and the terminal point of liquid spawn is 14 d.

Key words：Dictyophora rubrovolvata；Liquid spawn；Culture method

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata）屬鬼筆科（Phallaceae）竹蓀屬（Dictyophora），是一種大型食藥用真菌，因其成熟后外表有一層形如傘狀的菌裙，又有“菌中皇后”的美譽(yù)［1］。紅托竹蓀營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，子實(shí)體富含氨基酸、多糖、維生素和多種無(wú)機(jī)鹽等［2-3］，具有提高免疫力［4］、抗氧化［5-6］、抗腫瘤［7］、抗衰老［8］、抗疲勞［9］、降血糖［8］等作用，長(zhǎng)期食用對(duì)高血壓、高膽固醇、肝損傷等都有明顯療效［10-11］。紅托竹蓀與其它竹蓀品種（如長(zhǎng)裙竹蓀、棘托竹蓀）的顯著區(qū)別是，紅托竹蓀的菌托和竹蓀蛋呈紅色，菌索和菌絲遇機(jī)械損傷后變成紅色、紫紅。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2021年全國(guó)竹蓀（包括棘托竹蓀、長(zhǎng)裙竹蓀、紅托竹蓀等）產(chǎn)量19.4萬(wàn)t，僅占全國(guó)食用菌總量

（4 133.9萬(wàn)t）的0.5%。雖然紅托竹蓀市場(chǎng)需求量逐年增多、栽培面積也不斷擴(kuò)大，但其在整個(gè)竹蓀市場(chǎng)中的占比卻依舊非常低，仍屬于珍稀食用菌品種。

采用固體菌種，紅托竹蓀菌種培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、菌齡不一致現(xiàn)象嚴(yán)重，菌種培養(yǎng)過(guò)程中常出現(xiàn)底部菌種尚未長(zhǎng)滿而上部菌絲已老化現(xiàn)象。而液體菌種具有培養(yǎng)周期短、活力強(qiáng)、菌齡一致等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食用菌工廠栽培。因此，研究紅托竹蓀液體菌種發(fā)酵技術(shù)并應(yīng)用于菌包制作，將為紅托竹蓀的規(guī)?；耘嗵峁┬碌耐緩?。

本試驗(yàn)針對(duì)紅托竹蓀液體發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及培養(yǎng)方式展開研究，以期為紅托竹蓀液體菌種應(yīng)用于工廠化栽培提供參考。

1" 材料與方法

1.1供試菌株

紅托竹蓀菌株‘Di001’由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，雜木屑浸提液40 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉16 g/L。

液體菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯浸提液200 g/L，葡萄糖20 g/L，麥芽提取物2 g/L，麥芽浸粉1.5g/L。

糖漿類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖

20 g/L，麥芽提取物2 g/L，麥芽浸粉1.5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 2 g/L。

淀粉類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖

20 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 2 g/L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、麥芽糖漿

20 g/L、麥芽提取物2 g/L、麥芽浸粉1.5 g/L、KH2PO4 2 g/L，MgSO4 2 g/L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化及培養(yǎng)

將紅托竹蓀母種接種于母種培養(yǎng)皿中24～25℃避光倒置培養(yǎng)20 d后，從活化菌落邊緣挑取相同數(shù)量菌塊（Φ=6 mm）接種至液體菌種培養(yǎng)基中（1 000 mL三角瓶，裝液量600 mL），培養(yǎng)溫度24～25 ℃、轉(zhuǎn)速150 rpm避光培養(yǎng)20 d，得到液體菌種母液，然后定量取液體菌種母液到液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2液體發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)篩選

采用250 mL三角瓶，對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加量進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度24～25℃，轉(zhuǎn)速150 rpm，每個(gè)處理重復(fù)3次，避光培養(yǎng)20 d后測(cè)定菌絲體生物量。具體試驗(yàn)水平如下：

糖漿類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)：分別以麥芽糖漿和玉米糖漿作為發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，添加量分別為：0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L。培養(yǎng)基初始pH自然，裝液量100 mL，接種量10%。

淀粉類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)試驗(yàn)：分別以面粉、玉米粉、發(fā)酵專用豆粕粉、黃豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，添加量分別為：0 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L，培養(yǎng)基初始pH自然，裝液量100 mL，接種量10%。

1.3.3液體發(fā)酵培養(yǎng)方式篩選

采用250 mL三角瓶，對(duì)液體發(fā)酵的培養(yǎng)方式進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度24～25 ℃，每個(gè)處理重復(fù)3次，避光培養(yǎng)20 d后測(cè)定菌絲體生物量。具體試驗(yàn)水平如下：

培養(yǎng)基初始pH：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0（滅菌前用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)），裝液量100 mL，接種量10 %（v/v）。以未經(jīng)調(diào)節(jié)pH的液體發(fā)酵培養(yǎng)方式篩選培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。

培養(yǎng)基裝液量：60" mL、80" mL、100" mL、120" mL、

140 mL、160 mL、180 mL、200 mL，初始pH自然，接種量10%。

菌種接種量（v/v）：2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，初始pH自然，裝液量100 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間：接種后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d，初始pH自然，裝液量100 mL，接種量10%。

1.4" 測(cè)定指標(biāo)

培養(yǎng)結(jié)束后，過(guò)濾培養(yǎng)液中的菌絲體，50 ℃烘干至恒重，電子天平稱重。液體發(fā)酵時(shí)間篩選試驗(yàn)中，從接種液體菌種母液后4 d開始，分別在發(fā)酵4、6、8、10、12、14、16、18 d收樣測(cè)定菌絲體生物量。

2" 結(jié)果與分析

2.1 不同糖漿類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)紅托竹蓀液體發(fā)酵的影響

在添加量為0～30 g/L的供試范圍內(nèi)，隨著麥芽糖漿添加量的增大，紅托竹蓀菌絲體生物量逐漸增大，當(dāng)麥芽糖漿添加量為20 g/L時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，之后隨著麥芽糖漿添加量的增大，菌絲生物量呈下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（圖1）。

圖1" "麥芽糖漿添加量對(duì)紅托竹蓀液體

發(fā)酵菌絲體生物量的影響

Figure 1" Effect of maltose syrup addition on mycelial biomass of liquid fermentation of D. rubrovolvata

隨著玉米糖漿添加量的增加，紅托竹蓀菌絲體生物量逐漸增大，當(dāng)玉米糖漿添加量為20 g/L時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，為7.13 g/L，但在15～30 g/L

之間，不同添加量的菌絲體生物量之間無(wú)顯著性差異（圖2）。

圖2" "玉米糖漿添加量對(duì)紅托竹蓀

液體發(fā)酵菌絲體生物量的影響

Figure 2" Effect of corn syrup addition on mycelial biomass of liquid fermentation of D. rubrovolvata

2.2 不同淀粉類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)紅托竹蓀液體發(fā)酵的影響

在添加量為0 ～4 g/L的供試范圍內(nèi)，隨著面粉添加量的增大，紅托竹蓀菌絲體生物量雖然呈增大趨勢(shì)，但變化趨勢(shì)不明顯（圖3）。培養(yǎng)基中添加玉米粉（圖4）、發(fā)酵專用豆粕粉（圖5）、黃豆粉（圖6）時(shí)可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，在供試范圍內(nèi)，隨著添加量的增大，菌絲體生物量均顯著提高；當(dāng)添加量均為4 g/L時(shí)，菌絲體生物量均達(dá)到最大，添加玉米粉、發(fā)酵專用豆粕粉、黃豆粉的菌絲體生物量分別為：2.1 g/L、1.8 g/L、1.7 g/L，且與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比差異顯著。

2.3 紅托竹蓀液體培養(yǎng)方式優(yōu)化

液體培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，培養(yǎng)基pH值會(huì)降低，本研究也呈現(xiàn)類似結(jié)果；且隨著培養(yǎng)基初始pH的逐漸升高，滅菌后培養(yǎng)基實(shí)際pH降低的幅度越大。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH逐漸升高，紅托竹蓀菌絲體生物量逐漸增大，當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，之后呈降低趨勢(shì)，但差異不顯著（圖7）。

在250 mL三角瓶中培養(yǎng)基裝液量60～200 mL、初始pH自然、接種量10%，增加培養(yǎng)基裝液量，紅托竹蓀菌絲體生物量呈下降趨勢(shì)，且差異顯著，說(shuō)明紅托竹蓀液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)對(duì)通氣要求較高（圖8）。在接種量2%～16%的供試范圍內(nèi)，增大接種量可以促進(jìn)菌絲體生物量的增大，當(dāng)接種量為16%時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，為9.0 g/L，差異顯著（圖9）。紅托竹蓀接種后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體生物量逐漸增大，第14 d時(shí)，菌絲體生物量最大，為6.8 g/L，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間增大，菌絲體生物量增加趨勢(shì)緩慢，差異不顯著（圖10）。

綜上所述，紅托竹蓀液體發(fā)酵的適宜條件為：培養(yǎng)基初始pH 5.5，裝液量100～120 mL，接種量16%，培養(yǎng)時(shí)間14 d。

3" 結(jié)論與討論

紅托竹蓀栽培模式多樣，但目前仍以菌棒脫袋覆土栽培模式為主，菌棒多采用固體菌種接種，由于菌絲生長(zhǎng)較慢，菌棒生長(zhǎng)周期約120～140 d，嚴(yán)重制約了紅托竹蓀的規(guī)?；茝V。液體菌種具有生產(chǎn)成本低、培養(yǎng)周期短、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于食用菌工廠化栽培，是食用菌未來(lái)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)［12］。據(jù)報(bào)道，采用液體菌種時(shí)，紅托竹蓀菌棒培養(yǎng)周期可縮短至50 d以內(nèi)，比傳統(tǒng)的固體菌種生產(chǎn)時(shí)間縮短90 d以上，且接種成本降低近90%［13-14］。

盧征華等［15］的研究結(jié)果表明，紅托竹蓀液體發(fā)酵以蛋白胨為氮源時(shí)，菌絲體生物量8.0 g/L，

菌球平均密度15.3個(gè)/mL，菌球平均直徑0.3 mm，此時(shí)效果最好。劉錫等［16］也認(rèn)為蛋白胨適宜作為紅托竹蓀液體發(fā)酵的適宜氮源，除此之外，小麥粉和玉米粉也是紅托竹蓀液體發(fā)酵過(guò)程中最容易吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，采用玉米粉時(shí)，菌絲體特濃密、白色，菌絲生物量為4.8 g/L。本試驗(yàn)結(jié)果與已有研究結(jié)果類似：玉米粉可作為紅托竹蓀液體發(fā)酵的適宜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除此之外，發(fā)酵專用豆粕粉和黃豆粉也可作為適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使用。除培養(yǎng)基外，培養(yǎng)條件在一定程度上也影響發(fā)酵效果。已有研究結(jié)果表明［15］，采用500 mL三角瓶，當(dāng)培養(yǎng)基裝液量為300 mL時(shí)，紅托竹蓀最佳培養(yǎng)條件為溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速150 rpm、培養(yǎng)時(shí)間20 d。由于本試驗(yàn)采用的是250 mL三角瓶，適宜的裝液量較小，僅為100～120 mL，因此培養(yǎng)時(shí)間也較短，僅為14 d。三角瓶培養(yǎng)僅僅是紅托竹蓀液體菌種制備的一個(gè)環(huán)節(jié)，想要獲得高活性的液體菌種，后續(xù)還需對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的條件進(jìn)一步的調(diào)整和優(yōu)化。

參考文獻(xiàn)：

［1］陳飛，韓冰，于廣峰，等. 紅托竹蓀菌種快速分離培養(yǎng)基優(yōu)化［J］. 微生物學(xué)雜志，2023，43（6）：54-61.

［2］梁亞麗，秦禮康，王何柱，等. 紅托竹蓀及竹蓀蛋各部位主要營(yíng)養(yǎng)功能成分分析［J］. 食品與機(jī)械，2020，36（4）：72-76，114.

［3］張麗麗，張磊，章玉萍，等. 工廠化栽培紅托竹蓀的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定及食用安全性評(píng)價(jià)［J］. 中國(guó)食用菌，2023，42（1）：111-117.

［4］Deng C，Shang J Y，F(xiàn)u H T，et al. Mechanism of the immunostimulatory activity by a polysaccharide from Dictyophora indusiata ［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2016，91：752-759.

［5］Wang W S，Song X L，Zhang J J，et al. Antioxidation，hepatic-and renal-protection of water-extractable polysaccharides by Dictyophora indusiata on obese mice ［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2019，134：290-301.

［6］葉敏. 紅托竹蓀多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（12）：172-175.

［7］趙凱，王飛娟，潘薛波，等. 紅托竹蓀菌托多糖的提取及抗腫瘤活性的初步研究［J］. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27（2）：289-296.

［8］葉敏，文竹，彭源芳，等. 紅托竹蓀多糖抗衰老和降血糖作用研究［J］. 食品工業(yè)科技，2016，37（7）：343-345.

［9］葉敏，文竹，黃家振，等. 紅托竹蓀多糖抗疲勞和耐缺氧作用研究［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（3）：416-419.

［10］顏蜜，滕春麗，陶會(huì)，等. 紅托竹蓀多糖對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］. 菌物學(xué)報(bào)，2022，41（2）：291-302.

［11］葉建方，劉泳廷，鄭沖. 紅托竹蓀菌柄水提液對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2017，24（4）：55-58，2.

［12］劉啟燕，戚俊，周洪英，等. 食用菌液體菌種工廠化生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展淺析［J］. 食用菌，2018，40（6）：8-10，22.

［13］陳翠翠，鞏玉輝，方曄，等. 紅托竹蓀工廠化栽培技術(shù)研究［J］. 中國(guó)食用菌，2022，41（10）：31-35，49.

［14］陳翠翠，方曄，鞏玉輝，等. 紅托竹蓀液體菌種生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用［J］. 中國(guó)食用菌，2021，40（9）：17-21.

［15］盧征華，文庭池，徐彥軍，等. 紅托竹蓀液體菌種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］. 北方園藝，2021（22）：124-129.

［16］劉錫，葛萃萃，羅倩，等. 紅托竹蓀液體菌種發(fā)酵條件配方優(yōu)化研究［J］. 種子，2021，40（8）：127-131.

（責(zé)任編輯：許" " 玲）