地黃UDP-鼠李糖:鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

摘" 要：尿苷二磷酸鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶能將活性鼠李糖基供體轉(zhuǎn)移到其糖基化受體分子上，合成鼠李糖基化的化合物.它們結(jié)構(gòu)多樣，活性廣泛，具有藥理、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和化學(xué)防御及調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素水平等重要作用.迄今，已從多種植物中分離得到這類酶，但有關(guān)其基因家族的結(jié)構(gòu)特性與在植物次生代謝產(chǎn)物毛蕊花糖苷生物合成中的作用研究較少.以地黃尿苷二磷酸鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因（RgURT）家族的4個(gè)成員RgURT1～RgURT4為材料，利用生物信息學(xué)對(duì)該家族的特征進(jìn)行了分析，比較了RgURT在高、低毛蕊花糖苷地黃品種塊根中的表達(dá)模式.結(jié)果表明，其cDNA大小為645～1 422 bp；編碼蛋白質(zhì)分子量為24.05～53.24 kDa，由214～473個(gè)氨基酸殘基組成，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT-B型超家族，C端具有保守結(jié)構(gòu)域盒（PSPG盒），無信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主；RgURT4與RgURT1～RgURT3分別聚類為2個(gè)簇，RgURT4蛋白與其他3個(gè)URT蛋白序列之間的同源性低；RT-qPCR分析表明，RgURT基因在高毛蕊花糖苷地黃塊根中的表達(dá)量高于低毛蕊花糖苷地黃塊根中的表達(dá)量.研究首次揭示了地黃RgURT家族的特征，初步驗(yàn)證了RgURT與地黃毛蕊花糖苷合成相關(guān)，將為進(jìn)一步研究毛蕊花糖苷合成提供了重要酶基因.

關(guān)鍵詞：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶;地黃;RgURT家族的特征;PSPG盒

中圖分類號(hào)：Q94""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-2367（2024）06-0128-07

地黃是玄參科地黃屬一種多年生草本藥用植物，主要分布于中國、日本和韓國等國家.其根部（鮮地黃、生地黃和熟地黃）可用作蔬菜和藥材，具有重要的藥食價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.隨著不同組學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)在地黃研究中的廣泛應(yīng)用，大量的地黃基因被挖掘與報(bào)道［1-3］，越來越多地黃基因的未知功能有待解析，如地黃尿苷二磷酸鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-rhamnose：rhamnosyltransferase）基因.

尿苷二磷酸鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶普遍存在于生物體中，將活性鼠李糖基供體轉(zhuǎn)移到其糖基化受體分子上.含鼠李糖基取代的化合物結(jié)構(gòu)多樣，藥理活性廣泛，具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和化學(xué)防御及調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素水平等重要作用.已有研究從多種植物中鑒定出鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶［4-5］.如，金蕎麥FtUGT79A15具有催化槲皮素3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為蘆丁的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶活性［6］；甘草皂素2''-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶GuRhaGT催化萜皂苷的C-3糖基配體的2''-羥基的鼠李糖基化［7］；梁平柚鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因Cm1，2RhaT的時(shí)空表達(dá)與其黃烷酮的含量相關(guān)［8］；擬南芥黃酮醇7-O-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因AtUGT78D1（F3RhaT）使類黃酮鼠李糖化［9］；擬巫山淫羊藿鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因（EpPF3RT）使異戊基類黃酮鼠李糖化［10］；甜蕎鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因（FeF3G6RhaT）和桑樹鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因參與蘆丁生物合成［11-12］；擬南芥鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶UGT89C1（F7RhaT）具有轉(zhuǎn)移鼠李糖基的作用［13］；半邊蓮的依賴尿苷二磷酸-鼠李糖的鼠李糖轉(zhuǎn)移酶使花青素鼠李糖

收稿日期：2022-12-12;修回日期：2023-02-27.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31870312）；河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)（212102110405）；河南省自然科學(xué)基金（182300410018）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目（23IRTSTHN022）.

作者簡介（通信作者）：周延清（1963-），男，河南鄧州人，河南師范大學(xué)教授，博士，研究方向?yàn)橹参镞z傳，E-mail：yqzhou@htu.edu.cn.

引用本文：周延清，李慧敏.地黃UDP-鼠李糖：鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族的生物信息學(xué)和表達(dá)分析［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，52（6）：128-134.（Zhou Yanqing，Li Huimin.Bioinformatics and expression analyses of UDP-rhamnose：rhamnosyltransferase family in Rehmannia glutinosa［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（6）：128-134.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2022.12.12.0001.）

化［14］.研究發(fā)現(xiàn)，許多天然產(chǎn)物的糖基化取代都表現(xiàn)出了顯著的位置特異性，如，苯乙醇苷類化合物的結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)多樣性，但其分子中鼠李糖基取代反應(yīng)都特異性地發(fā)生在葡萄糖3-OH位置，表明鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶催化鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶取代反應(yīng)具有高度的位置特異性［5］.迄今，對(duì)植物UDP-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶研究發(fā)現(xiàn)，其主要修飾萜類和黃酮類分子，序列相似性比較低，C-端具有PSPG盒子，沒有發(fā)揮催化功能的共同機(jī)制.因此，植物UDP-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的挖掘與應(yīng)用受到很大限制［4］.本團(tuán)隊(duì)在前期研究毛蕊花糖苷生物合成途徑與分子機(jī)理過程中，推測出其合成過程中的鼠李糖化反應(yīng)需要鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，并且用三代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘了一個(gè)地黃RgURT家族，包括RgURT1～RgURT4（基因注冊(cè)號(hào)：MN646769、MT767427、MT767428和MT767429），但是沒有對(duì)該基因家族的特征與合成毛蕊花糖苷功能的報(bào)道［15］，以高、低毛蕊花糖苷地黃品種的塊根為材料進(jìn)行該酶基因的基因型依賴性表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究毛蕊花糖苷合成提供了重要酶基因，對(duì)于完全解析毛蕊花糖苷合成分子調(diào)控機(jī)制和促進(jìn)毛蕊花糖苷的合成生物學(xué)研究以及分子輔助育種的分子標(biāo)記研發(fā)具有重要意義.

1" 材料與方法

1.1" 基因家族成員的堿基序列

地黃全長轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)見NCBI SRA Database（accession number：PRJNA780233）https：//trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/？study=SRP346035.鑒定出RgURT基因家族4個(gè)成員RgURT1～RgURT4.

1.2" 生物信息學(xué)分析

使用NCBI在線分析工具ORF Finder查找這些基因完整的開放閱讀框（ORF）；用ProtParam 對(duì)這些基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；采用TMHMM 2.0和NetPhos 3.1 Server預(yù)測分析這些蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和磷酸位點(diǎn)；應(yīng)用Signal P-5.0預(yù)測分析這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的信號(hào)肽；用SOPMA、SWISS-MODEL、NCBI 的CD search和InterProScan分別預(yù)測分析這些蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域；利用在線工具Blastn查找與這些蛋白質(zhì)同源性高的其他物種的蛋白序列；運(yùn)用軟件DNAMAN 6.0和MEGA 6.0軟件對(duì)其進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建［16］.

1.3" 地黃RgURT基因表達(dá)的熒光定量PCR測定

根據(jù)文獻(xiàn)［17］，選定地黃品種北京3號(hào)和溫85-5作為高、低毛蕊花糖苷地黃品種，其毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.53 mg·g-1和0.28 mg·g-1；從武陟縣四大懷藥研究所采挖其成熟期地黃植株各10株，取其塊根，去除泥沙，蒸餾水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面，按品種分別取其新鮮塊根，切成約3 mm厚的薄片，按品種不同株的切片混合，液氮研磨成粉末，用于提取RNA，以地黃RgTIP41作為內(nèi)參基因［1］，以上述RNA為模板，用附錄表S1中引物對(duì)RgURT1、RgURT2與RgURT4進(jìn)行基因型依賴性表達(dá)的qRT-PCR分析，引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成.

1.4" 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行基因在高、低毛蕊花糖苷含量的地黃品種中表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)與作圖.

2" 研究結(jié)果

2.1" RgURT基因家族成員大小及其相似性和開放閱讀框分析

RgURT基因家族有4個(gè)成員RgURT1～RgURT4，大小為 1 422 bp、963 bp、645 bp和1 416 bp.使用NCBI在線分析工具ORF Finder查找RgURT1～RgURT4基因完整的開放閱讀框（ORF）分別由1 419、960、642和1 413個(gè)堿基組成（附錄表S2）.RgURT1～RgURT4的多重比對(duì)結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因之間的相似性為59.24%，RgURT1與RgURT2之間的相似性為65.91%，RgURT1與RgURT4之間的相似性為42.72%，RgURT2與RgURT3之間的相似性為37.75%.

2.2" RgURT酶家族成員間的多重比對(duì)與理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

RgURT1～RgURT4依次由473、320、214和471個(gè)氨基酸殘基組成（附錄表S2），相似性為55.58%，RgURT1與RgURT2之間相似性為66.25%，RgURT4與RgURT1～RgURT3之間的相似性為41%、28%和21%（圖2）.其蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性、信號(hào)肽和二級(jí)結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)見表S2，亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)見附錄表S3；RgURT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖3，4個(gè)RgURT都很有可能定位于細(xì)胞質(zhì).

2.3" RgURT蛋白質(zhì)家族的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件分析RgURT蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，比對(duì)結(jié)果顯示序列同源性（sequence identity）在 40% 以上時(shí)，則待預(yù)測蛋白與模板蛋白結(jié)構(gòu)可能屬于同一家族，即為同源蛋白，則同源建模方法可用于預(yù)測該蛋白三維結(jié)構(gòu)，預(yù)測模型可信度高.然后，根據(jù)GMQE值（全球性模型質(zhì)量估測）及QMEAN值評(píng)價(jià)同源建模的結(jié)果.GMQE值在0～1之間，越接近1則建模質(zhì)量越好，QMEAN值區(qū)間為-4～0，越接近0則匹配度越好（附錄表S4）.4RgURT的單體三維結(jié)構(gòu)如圖4.從圖4看，RgURT4的單體三維結(jié)構(gòu)與其他差異較大，其他三者相似性較大，圖中顏色同圖3.

2.4" 地黃RgURT酶家族屬性與保守結(jié)構(gòu)區(qū)域

利用NCBI CD search和InterProScan預(yù)測RgURT蛋白的家族，發(fā)現(xiàn)其屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GTB型超家族（圖5）.將RgURT蛋白與同源蛋白進(jìn)行序列多重比對(duì)和C末端保守區(qū)域預(yù)測分析結(jié)果表明，4個(gè)RgURT蛋白在352～395位都有一個(gè)由44個(gè)氨基酸殘基組成的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase）保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，即C末端保守區(qū)域PSPG盒（plant secondary product glycosyltransferase box）-HCGMNS（圖6）.

2.5" 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過NCBI的Blastn搜索與地黃RgURT基因編碼氨基酸序列相似性較高的植物物種的同源基因，利用MEGA6.0軟件以NJ算法進(jìn)行分析，構(gòu)建了相關(guān)植物URT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）.其中，RgURT4蛋白（Group1）、芝麻與獨(dú)腳金URT蛋白聚為一枝.其中，地黃和獨(dú)腳金同屬玄參科植物，親緣關(guān)系近；RgURT1、RgURT2和RgURT3聚在一起（Group2），與茶（Camellia sinensis）等植物URT所在聚類分支聚類在一起.其中，RgURT4氨基酸序列與芝麻Sesamum indicum（XP_011092852.1）、獨(dú)腳金Striga asiatica（GER45226.1）、一串紅Salvia splendens（TEY36988.1）、紫花風(fēng)鈴木Handroanthus impetiginosus（PIN20168.1）等物種的相似性分別為75%、70%、68%和65%（圖7）.

2.6" RgURT基因家族的基因型依賴性表達(dá)分析

RgURT基因家族中，RgURT1、RgURT2和RgURT4在高、低毛蕊花糖苷地黃品種塊根中在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量被測定與比較.基于用2-ΔΔCt法計(jì)算所得的基因相對(duì)表達(dá)水平值，用柱狀圖展現(xiàn)3個(gè)基因在高、低毛蕊花糖苷地黃品種塊根中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA水平（圖8）.結(jié)果表明，三者在高毛蕊花糖苷地黃中的表達(dá)量高于其在低毛蕊花糖苷地黃中的表達(dá)量，與兩地黃品種的毛蕊花糖苷含量相關(guān).

3" 討" 論

鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶或者URT廣泛存在于植物界中，參與不同種植物次生代謝產(chǎn)物的生成，在植物的結(jié)構(gòu)組成及多種生理功能中發(fā)揮重要的作用［3，5，16，18-19］.它們的基因具有多樣化的基因名［6-13］，如 擬南芥的AtUGT78D1（F3RhaT）和UGT89C1（F7RhaT）［9，13］、梁平柚的Cm1，2RhaT［8］和地黃的RgURT［15］，但是都具有編碼RhaT的功能.從系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果看，4個(gè)RgURT分為2個(gè)亞組（圖7）；從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)看，RgURT家族結(jié)構(gòu)比較保守，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT-B型亞家族（圖5），具有UGT家族的植物次生產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（PSPG-box）.該結(jié)構(gòu)域是多種植物RhaT的C端的一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域［4，19］.與其他物種RhaT的PSPG-box相比，RgURT家族的PSPG-box都具有完整的，但是，有一定數(shù)量的氨基酸差異（圖6）；從基因家族成員大小看，RgURT基因（表S1）與其他植物種的RhaT的大小均不同［4，8，20-21］.其中，RgURT1和RgURT4與其他植物種的RhaT的大小相近，RgURT2和RgURT3比其他植物種的RhaT小，同源性分析表明，RgURT基因家族成員之間的相似性不高（圖2），但是，與芝麻和獨(dú)腳金等植物的URT之間的相似性比較高（圖7）; 從亞細(xì)胞定位分析看，RgURT家族成員均定位于細(xì)胞質(zhì)（表S3）.這一結(jié)果與菊花CiRhaT-GD4x的定位結(jié)果一致［22］，而與多數(shù)植物RhaT定位于高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果不一致［21，23］.綜上所述，RgURT基因及其編碼酶與其他已知植物物種中URT基因及其編碼酶URT既有進(jìn)化上的保守性又有其獨(dú)特性，預(yù)示其既有RhaT的功能又可能具有一定的獨(dú)特生物學(xué)功能.

地黃和其他許多植物體內(nèi)毛蕊花糖苷的合成途徑是一個(gè)復(fù)雜的代謝過程，涉及很多代謝物與酶［3］.URT被認(rèn)為在毛蕊花糖苷的合成途徑的下游步驟中起作用，即3，4-二羥基酪醇葡萄糖至脫咖啡?；锘ㄌ擒盏牟襟E和脫鼠李糖基毛蕊花糖苷至毛蕊花糖苷的步驟［16-18］.目前，URT在毛蕊花糖苷合成過程中的作用研究鮮有報(bào)道，例如一個(gè)基于同源克隆的RgURT基因片段在高毛蕊花糖苷地黃品種的表達(dá)量比其在低毛蕊花糖苷地黃品種的表達(dá)量高，可能調(diào)控地黃毛蕊花糖苷合成［22］；RgURT1和RgURT2在地黃幼苗中的表達(dá)受茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)［15］，與其他地黃毛蕊花糖苷合成相關(guān)酶基因的表達(dá)對(duì)茉莉酸甲酯的應(yīng)答反應(yīng)相似［24］.本研究通過熒光定量PCR分析RgURT1、RgURT2和RgURT4在高、低毛蕊花糖苷地黃品種塊根中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诟呙锘ㄌ擒盏攸S品種的表達(dá)量比在低毛蕊花糖苷地黃品種的表達(dá)量高（圖8），可能與地黃品種塊根毛蕊花糖苷的含量相關(guān).這一結(jié)果與地黃毛蕊花糖苷合成途徑上游關(guān)鍵基因與甘蔗中蔗糖合成酶基因的基因型依賴性表達(dá)相似［24-26］.因此，這3個(gè)RgURT基因很可能是調(diào)控地黃毛蕊花糖苷合成的基因，其編碼的RgURT酶可能催化UDP-鼠李糖中的鼠李糖基與其兩種底物中葡萄糖的3C上的羥基之間形成鼠李糖苷鍵，合成脫咖啡?；锘ㄌ擒蘸兔锘ㄌ擒眨鼈兇呋锘ㄌ擒蘸铣傻淖饔糜写M(jìn)一步驗(yàn)證.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2022.12.12.0001）.

參" 考" 文" 獻(xiàn)

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Bioinformatics and expression analyses of UDP-rhamnose：rhamnosyltransferase family in Rehmannia glutinosa

Zhou Yanqing， Li Huimin

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： Rhamnosyltransferases can transfer active rhamnosyl donors to their rhamnosylated receptor molecules to synthesize rhamnosylated compounds with diverse structures and extensive activities. They play important roles in pharmacology， maintaining cell structure， signal transduction， chemical defense and regulating hormone levels in plants. So far， they have been isolated from many plants. However， few studies have been conducted on the structural characteristics of their gene families and their role in the biosynthesis of acteoside in plants. In this study， we used bioinformatics technology to analyze the structural characteristics of URT gene family in Rehmannia glutinosa（RgURT1-RgURT4）， and their expression patterns in higher acteoside level variety and lower acteoside level variety were compared using its four members as materials. The results showed that their cDNA sizes were from 645 to 1 422 bp， encoded from 214 to 473 amino acid residue-composed proteins with molecular weights from 24.05 to 53.24 kDa. They belonged to the GT-B superfamily of glycosyltransferases， had no signal peptide and a conserved domain box（PSPG box） at the C-terminal， and were localized in the cytoplasm. Their secondary structures mainly were random coil and α-Helix; RgURT4 and RgURT1-RgURT3 were clustered into two different groups， respectively， and the homology between RgURT4 protein and RgURT1-RgURT3 was low; RT-qPCR analysis showed that the expressions of three RgURT genes in the tuberous root of the high acteoside variety were higher than that in the low acteoside variety. This study revealed the structural features of RgURT family of Rehmannia glutinosa， and preliminarily verified the correlation between RgURT gene family and acteoside biosynthesis， and will provide candidate genes for further study of acteoside biosynthesis.

Keywords： rhamnosyltransferase; Rehmannia glutinosa; characteristics of RgURT gene family members; PSPG box

［責(zé)任編校" 劉洋" 楊浦］

附" 錄