楊樹響應(yīng)腐皮鐮刀菌侵染的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

摘要：[目的]基于RNA-Seq測序技術(shù)，初步探究了楊樹一腐皮鐮刀菌互作過程中相關(guān)基因的表達(dá)、主要信號通路和代謝途徑，篩選了楊樹防御腐皮鐮刀菌侵染的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步揭示此類病害的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]以生長2個月的銀腺楊84K為材料，用1×107個·mL-1的腐皮鐮刀菌孢子液侵染根系，于侵染0h（對照組）、48 h和72 h（接菌組）后取根組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘楊樹響應(yīng)腐皮鐮刀菌侵染的相關(guān)基因。[結(jié)果]（1）與對照組0h相比，侵染48 h和72 h分別檢測到8 939個和8 246個DEGs（Differen-tially Expressed Genes）。（2） GO分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在單一生物體過程、對刺激反應(yīng)、碳水化合物代謝、生物調(diào)節(jié)和對激素響應(yīng)等過程。（3） KEGG分析表明，糖酵解，糖異生、碳代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成等途徑在病原菌侵染后發(fā)生顯著變化。（4）楊樹糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEETs家族中21個成員的表達(dá)受腐皮鐮刀菌侵染誘導(dǎo)。乙烯受體ETR、乙烯信號通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上調(diào)表達(dá)，木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因CCR、4CL、C3'H、COMT表達(dá)量顯著升高。[結(jié)論]楊樹可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)，激活乙烯信號通路，促進(jìn)木質(zhì)素積累、細(xì)胞壁增厚等策略，響應(yīng)腐皮鐮刀菌的侵染。

關(guān)鍵詞：楊樹；腐皮鐮刀菌；侵染過程；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）03-0024-13

楊樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)和能源物種，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)等方面發(fā)揮著重要作用，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著楊樹種植面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，受環(huán)境、氣候等因素影響導(dǎo)致病害頻發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防治楊樹病害主要靠物理防治或化學(xué)防治，不僅耗費(fèi)人力、物力和財(cái)力，長期使用農(nóng)藥也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，培育楊樹抗病品種是防治楊樹病害最為經(jīng)濟(jì)、安全、有效的措施。與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，分子育種技術(shù)能夠定向、高效地培育出新品種，在植物抗病育種領(lǐng)域，尤其是周期較長的林木抗病育種領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。研究楊樹抗病的分子機(jī)理，可為分子育種提供理論支撐和基因資源，是開展楊樹抗病分子育種的基礎(chǔ)。

植物在長期應(yīng)對生物脅迫過程中形成了PTI（PAMP-triggered immunity）和ETI（Effectortriggered immunity）雙層級免疫系統(tǒng)以防御病原菌的入侵。植物通過自身細(xì)胞表面模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）感知病原菌特征分子（PAMPs，pathogen-associatedmolecular patterns）可激活PTI反應(yīng)，通過體內(nèi)核苷酸結(jié)合和富亮氨酸重復(fù)受體（Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containingreceptor，NLRs）識別病原菌釋放的毒性效應(yīng)子（Effectors）可啟動ETI反應(yīng)，PTI和ETI協(xié)同作用可激活一系列抗病反應(yīng)的發(fā)生，包括病程相關(guān)基因的表達(dá)、活性氧（ROS）爆發(fā)、細(xì)胞壁胼胝質(zhì)沉積等。對楊樹-膠孢炭疽菌（Colletotrichungloeosporioides）互作的研究表明，膠孢炭疽菌的侵染可誘導(dǎo)NB-LRR類蛋白的上調(diào)表達(dá)，繼而引起細(xì)胞中活性氧爆發(fā)和超敏反應(yīng)（HR）發(fā)生，以防御該病菌的進(jìn)一步入侵。在落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina Kleb）和楊樹非親和互作中，銹菌吸器母細(xì)胞可誘導(dǎo)寄主細(xì)胞壁增厚，并產(chǎn)生乳狀突，從而阻止其侵入。水楊酸、乙烯、茉莉酸等激素是植物防御反應(yīng)重要的信號分子。外施水楊酸或其類似物可誘導(dǎo)楊樹對銹菌（M. larici-populina）的防御反應(yīng)。WRKY、TGA等轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控激素合成酶或激素受體的積累，抑制或激活激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要組分的表達(dá)，在植物防御反應(yīng)過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。對胡楊PeTGA1的研究表明，該轉(zhuǎn)錄因子不僅可以結(jié)合水楊酸合成酶PeSARD1編碼基因的啟動子從而誘導(dǎo)SA的積累，還可以直接調(diào)控病程相關(guān)基因PR1的表達(dá)。過表達(dá)PeTGA1轉(zhuǎn)基因植株顯著提高了胡楊對膠孢炭疽菌的抗病能力。楊樹PtoWRKY60可調(diào)控PR5.7、PR5.2、PR5.4、PR5.5和CPR5等基因的表達(dá)，在楊樹中過表達(dá)這些基因顯著增強(qiáng)了對潰瘍病菌（DothioreHagregaria Sacc.）的抗性。

腐皮鐮刀菌（Fusarium solani （Mart.） Sacc）寄主范圍十分廣泛，可入侵楊樹（Populustrichocarpa Torr.＆Gray）、桉樹（Eucalyptus camaldulensis Dehn.）、橄欖（Olea europaea L.）、蘇鐵（Cycas L．）等多種林木植物。該病菌主要從根部侵入，由維管束疏導(dǎo)組織向上擴(kuò)展，造成根部腐爛、樹干或枝條干枯、葉片枯萎脫落，最終導(dǎo)致植株死亡，具有傳染速度快、致死率高等特點(diǎn)。由于楊樹的廣泛種植，由腐皮鐮刀菌引起的病害造成了該樹種的大面積死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重。但目前，該病害防治手段主要依賴于日常栽培管護(hù)，例如造林時盡量選擇木質(zhì)化程度較高的粗壯苗木以減少病害的發(fā)生。有關(guān)該病害的研究主要集中于病害發(fā)生的描述和防治措施的探討，針對楊樹響應(yīng)腐皮鐮刀菌侵染的分子機(jī)理的研究仍十分有限。

隨著測序手段和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量、快速、低成本的轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物與病原菌分子互作研究，成為研究林木抗病機(jī)制、挖掘抗病基因的重要手段。本研究以銀腺楊84K為試驗(yàn)材料，在轉(zhuǎn)錄水平上分析腐皮鐮刀菌（F.so/ani（Mart.）Sacc）侵染楊樹根部后不同時間內(nèi)差異表達(dá)基因（Differentially ExpressionGenes）及相關(guān)信號通路，以期為進(jìn)一步揭示楊樹抗腐皮鐮刀菌侵染的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試楊樹材料為中國林業(yè)科學(xué)研究院保存的84K楊（Populus a/ba×P．glandulosa）。將培養(yǎng)4周的組培苗移栽至上口徑6.5 cm，下口徑5 cm，高6 cm的小營養(yǎng)缽中，栽種基質(zhì)為草炭土與珍珠巖（比例為3：1），每盆裝土量約為營養(yǎng)缽的90%，每盆栽種1株。待幼苗在小營養(yǎng)缽中生長2周后移栽至大營養(yǎng)缽（內(nèi)口徑×底徑×盆高=20 cm×14.5 cm×15 cm），生長1個月后進(jìn)行接菌實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件為：溫度22～25℃、相對濕度70%、光照16 h／黑暗8h，生長期間適時澆水，保證植株正常生長。供試病原菌為腐皮鐮刀菌（F. solani （Mart.） Sacc），由中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，菌種保存號為CFCC 51703．培養(yǎng)條件為：溫度25～28℃，黑暗，采用PDA培養(yǎng)基擴(kuò)繁。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：植物組織RNA提取試劑盒（天根，北京）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RTreagent Kit（Perfect Real Time）（Takara，日本）；熒光定量試劑KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix（KAPA Biosystems，美國）；改良型霍格蘭營養(yǎng)液NSP1020（酷萊博，北京）；Calcofluor White stain solution（酷萊博，北京）。NanoDrop One微量紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國）、The RocheLight Cycler 480（Roche，瑞士）；奧林巴斯熒光顯微鏡（Olympus BX 51）。

1.2 方法

1.2.1 腐皮鐮刀菌孢子液制備

孢子液制備：將在PDA培養(yǎng)基上生長5d的腐皮鐮刀菌用滅菌水沖洗并收集其孢子制成孢子液?，F(xiàn)用現(xiàn)制，以保證孢子的最佳活性。取100 μL收集到的孢子液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子液濃度至1×107個·mL-1。

1.2.2 危害癥狀觀察

針對莖干危害癥狀觀察，選擇正常生長2個月的84K植株，使用排針在莖干上制造傷口，利用直徑5mm的打孔器獲取腐皮鐮刀菌菌餅，敷于傷口處。將脫脂棉球用無菌水濕潤后包裹菌餅，并用封口膜纏繞，爪夾固定。接種兩天后，拆卸夾子、封口膜、棉球，以觀察傷口處病斑擴(kuò)散情況。針對根部危害癥狀的觀察，用1x1 07個·mL-1濃度的孢子液浸泡生長20 d的組培小苗根部3h后移栽至土中培養(yǎng)，12 d后觀察腐皮鐮刀菌對植株生長的影響。

1.2.3 Calcofluor white染色

在莖干接腐皮鐮刀菌菌餅5d后，撕下傷口處樹皮，用清水清洗，使用2～3滴Calcofluor white（CFW）熒光染料和2～3滴10% KOH對樹皮進(jìn)行染色，1 min后用清水清洗1～2次，將樣本置于載玻片上于奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長約在355 nm。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組接菌和取樣

將在營養(yǎng)土中生長45 d的84K楊幼苗根部洗凈，清洗過程中盡可能保證根部的完整。試驗(yàn)設(shè)置對照組（0h）和2個接菌組（48 h和72 h），每組3棵幼苗，即3次生物學(xué)重復(fù)。利用添加了改良型霍格蘭營養(yǎng)液的水調(diào)整孢子液濃度為1×107個·mL-1，以保證植株正常生長所需的營養(yǎng)成分，霍格蘭營養(yǎng)液主要營養(yǎng)成分濃度：Ca（NO3）2·4H2O為945 mg·L-1，KNO3為506 mg·L-1，NH4NO3為80 mg·L-1，KH2PO4為136 mg·L-1，MgSO4·7H2O為241 mg·L-1，F(xiàn)eNaEDTA為36.7 mg.L-1。將清洗干凈的84K楊幼苗的根部置于提前配好的孢子液中，在浸泡孢子液的過程中，根部完全浸泡，并且保證苗子正常生長所需的適宜溫度和光照強(qiáng)度。之后分別在侵染后0、48、72 h采集根部組織，并立即將其根組織置于液氮中冷凍，然后移至-80℃超低溫冰箱中保存，以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序

樣品由基迪奧生物科技（廣州）有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序。通過Trizol總RNA提取試劑盒對樣品進(jìn)行RNA的提取，采用安捷倫2100生物分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)所提取RNA的質(zhì)量。樣品質(zhì)量檢測合格后，采用Illumina Novaseq6000進(jìn)行雙端測序分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

通過fastq0.18.0軟件對序列進(jìn)行質(zhì)量控制，過濾去除只含adapter、含N比例大于10%、全部都是A堿基和低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條reads的50%以上）后得到Clean Reads。通過堿基錯誤率為1%（Q20）和1%a（Q30）來評估過濾后reads的質(zhì)量，通常Q20在95%以上，Q30達(dá)到90%以上，說明測序結(jié)果質(zhì)量合格。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)量分析

采用HISAT 2.2.4軟件將獲得的Clean Reads與毛果楊4.1參考基因組（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Ptri-chocarpa_v4_1）進(jìn)行比對。根據(jù)比對結(jié)果，利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并使用RSEM軟件計(jì)算每個樣本中所有基因的表達(dá)量，即FPKM。通過計(jì)算FPKM值比較不同樣本中基因表達(dá)水平的差異。

1.2.8 差異表達(dá)基因的篩選、功能注釋及富集分析

利用DESeq2軟件對原始reads count進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)模型計(jì)算假設(shè)檢驗(yàn)概率（p value）和多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率）。以FDR＜0.05、｜log2FC｜≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著差異表達(dá)基因。利用GO數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneont-ology.org/）對差異基因進(jìn)行功能注釋分析，利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行富集通路分析，使用基迪奧生物信息云平臺（https：//www.omicshare.com/）對GO功能注釋和KEGG富集分析并進(jìn)行圖形可視化。

1.2.9 qRT-PCR分析

選取6個差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。利用SnapGene 6.0.2和DNAMAN V6對所選基因和內(nèi)參基因PagActin設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min; 95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，45個循環(huán)。采用2-△△Cr法計(jì)算基因相對表達(dá)水平。每個處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置4次技術(shù)重復(fù)。采用GraphPad Prism 8.0.1和Excel 2010對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐皮鐮刀菌侵染楊樹后的危害癥狀

腐皮鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上生長時菌落較致密，正面形態(tài)呈雪白色，邊緣呈黃色（圖1A）。將該病菌菌餅接種于84K莖段，接種處利用CFW熒光染料染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)病原菌孢子定殖在樹皮上（圖1B）。用孢子液侵染小苗根部，觀察發(fā)現(xiàn)病菌從根部入侵，沿維管束向上蔓延，莖干變黑潰爛，葉片變黃枯萎（圖1C），最終導(dǎo)致整個植株死亡。用腐皮鐮刀菌菌餅接種84K莖段，2d后開始出現(xiàn)病斑，12 d時莖段黑斑擴(kuò)散明顯（圖1D）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

對侵染不同時期的84K楊根部組織進(jìn)行RNA提取，通過質(zhì)量檢測后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序獲得原始數(shù)據(jù)。過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到了37 366 426～469 727 56個Clean reads。對不同樣本的質(zhì)量檢測表明，各樣本Q20均大于等于97.61%，Q30均大于等于93.05%，GC含量為44.05%～45.79%（表2）。樣品主成分分析（圖2）顯示，接菌組（48 h和72 h）與對照組（Oh）各聚為一類，樣品間生物學(xué)重復(fù)較好。

2.3 侵染過程中差異表達(dá)基因分析

通過轉(zhuǎn)錄組測序共檢測到35 235個表達(dá)基因，以FDR＜0.05、差異倍數(shù)FC≥2或者FC≤0.5為篩選條件，對DEGs數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，接菌后48 h，對照組和接菌組之間共檢測到8939個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因3 020個，下調(diào)基因5 919個（圖3A）。接菌后72 h，共檢測到差異表達(dá)基因8 246個，其中上調(diào)基因2 910個，下調(diào)基因5 336個（圖3B）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，接菌48 h和72 h后均被檢測到的差異表達(dá)基因共有327個（圖4）。

2.4 差異表達(dá)基因的注釋和富集分析

對差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果（圖5）顯示，在生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分方面均存在顯著富集。接菌48 h后，差異表達(dá)基因主要富集在單一生物體過程（Single-organism process）、對刺激的反應(yīng)（Responseto stimulus）和碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等過程。接菌72 h后，則主要富集在對刺激的反應(yīng)（Response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（Biologicalregulation）和對激素的響應(yīng)（Response tohormone）等通路。

進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，接菌48 h后，92個差異基因富集到糖酵解／糖異生（Glycolysis／Gluconeogenesis）途徑，127個差異基因富集到苯丙烷生物合成途徑（Phenylpropanoid biosynthesis），1 47個差異基因富集到碳代謝途徑（Carbon metabolism）、40個差異基因富集到果糖和甘露糖代謝途徑（Fructose and mannose metabolism），144個差異基因富集到植物激素信號傳遞途徑（Planthormone signal transduction）。接種病原菌72 h后，124個差異基因富集到苯丙烷生物合成途徑，76個差異基因富集到糖酵解，糖異生途徑，128個差異基因富集到植物激素信號傳遞通路，122個差異基因富集到碳代謝通路、69個差異基因富集到淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）通路（圖6）。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究選取6個基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，即Potri.005G187300、Potri.012G031400、Potri.015G101500、Potri.003G166800、Potri.013G013800、Potri.012G001400，選取PagActin為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，6個基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致（圖7），表明本研究中分析獲得的差異表達(dá)基因可信度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 楊樹SWEETs家族表達(dá)分析

KEGG富集通路結(jié)果顯示，接菌48 h和72h后差異基因顯著富集到多個與糖合成與代謝相關(guān)的途徑。植物SWEETs家族是一類重要的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在植物和病原菌互作過程中，不僅可以作為病原菌效應(yīng)子的識別受體，還可以通過負(fù)責(zé)糖的運(yùn)輸影響植物本身的免疫反應(yīng)。之前的研究表明，楊樹SWEET家族共有27個家族成員。本研究共檢測到26個楊樹SWEET基因，其中48 h后10個上調(diào)、10個下調(diào)，72 h后11個上調(diào)、10個下調(diào)。9個SWEET基因在病原菌侵染48h和72 h后均上調(diào)表達(dá)（表3）。因此，推測SWEETs可能在楊樹與腐皮鐮刀菌的互作過程中發(fā)揮重要作用。

2.7 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及相關(guān)基因表達(dá)分析

進(jìn)一步對KEGG富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中乙烯、水楊酸和茉莉酸信號通路中的基因受腐皮鐮刀菌不同程度誘導(dǎo)。接菌后，乙烯合成限速酶基因ACS6表達(dá)量上調(diào)2.1～2.6倍，乙烯受體ETR3個成員Potri.002G201500、Potri.008G164400和Potri．010G07300上調(diào)表達(dá)1.8～3.0倍。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵成員EIN3和ERF//2的表達(dá)水平被腐皮鐮刀菌誘導(dǎo)，前者在接菌48 h顯著升高，后者在48 h和72 h均顯著上調(diào)。乙烯信號通路重要調(diào)控因子MPK6的編碼基因表達(dá)量顯著下降。水楊酸信號通路中，水楊酸受體NPR1的編碼基因（Potri.005G206100）表達(dá)量和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TGA的編碼基因（Potri.002G090700）在接菌48 h顯著上調(diào)。該通路標(biāo)志基因PR1的表達(dá)水平在接菌后48 h和72 h均顯著上調(diào)。茉莉酸酰氨基酸結(jié)合物合成酶JAR1編碼基因（Potri.002G168200）受腐皮鐮刀菌誘導(dǎo)后表達(dá)量下調(diào)，茉莉酸信號通路關(guān)鍵基因JAZ、MYC2在接菌后48 h和72 h均顯著下調(diào)表達(dá)（圖8）。

2.8 苯丙烷生物合成途徑及相關(guān)基因表達(dá)分析

KEGG富集結(jié)果分析顯示，楊樹在響應(yīng)腐皮鐮刀菌入侵的過程中，苯丙烷類生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。肉桂酰輔酶A還原酶CCR為該途徑第一個限速酶，同時催化3種羥基肉桂酸CoA酯的還原反應(yīng)，生成相應(yīng)的肉桂醛。接菌后48 h和72 h，CCR基因表達(dá)量分別為Oh的1.4～10.5倍和1.7～10.5倍?？Х人幔甇-甲基轉(zhuǎn)移酶COMT催化苯丙素類化合物羥基上氧原子的甲基化生成阿魏酸、芥子酸，受腐皮鐮刀菌誘導(dǎo)后表達(dá)量上調(diào)4.0～4.5倍。4-香豆酸輔酶A連接酶4CL催化肉桂酸及其衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，在接菌后48 h和72 h，表達(dá)量分別上調(diào)1.3倍和1.7倍。香豆酸-3-羥基化酶C3'H催化對香豆酰莽草酸，奎寧酸到咖啡酰莽草酸，奎寧酸C3位置的羥基化反應(yīng)，在接菌后表達(dá)量顯著升高。莽草酸O-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶HCT催化對香豆酰CoA生成對香豆酰莽草酸，在接菌后48 h和72 h分別下調(diào)1.5～8.2倍和1.3～8.2倍（圖9）。

3 討論

由腐皮鐮刀菌引起的楊樹病害是近幾年江蘇、安徽等南方地區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重的楊樹病害，主要發(fā)病于新生幼苗，一旦發(fā)病，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。從分子方面研究其發(fā)病機(jī)理，可為楊樹抗病新品種的培育提供理論基礎(chǔ)，但是目前相關(guān)研究仍十分有限。本研究利用RNA-seq技術(shù)對該病菌侵染楊樹根部后不同時間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，鑒定出楊樹·腐皮鐮刀菌互作過程關(guān)鍵基因、相關(guān)信號通路及代謝途徑，為進(jìn)一步揭示楊樹對該致病菌的抗性分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

對腐皮鐮刀菌侵染楊樹后差異表達(dá)基因的GO和KEGG代謝途徑富集分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解、果糖和甘露糖代謝等糖代謝途徑發(fā)生顯著變化。糖代謝是植物和微生物能量獲取的主要方式，也可為二者細(xì)胞內(nèi)生物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，產(chǎn)生的部分糖還可作為信號分子調(diào)控寄主防御反應(yīng)。糖轉(zhuǎn)運(yùn)是植物一病原菌互作過程中伴隨糖代謝的重要事件。研究表明，植物遭受病原菌侵染后，二者會發(fā)生營養(yǎng)爭奪，競爭調(diào)控糖在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)方向，負(fù)責(zé)糖運(yùn)輸?shù)奶寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白在此過程中發(fā)揮重要作用。SWEET是植物中廣泛存在的一類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。對擬南芥一腐霉?。≒ythium irregulare）的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）AtSWEET2在根中高度表達(dá)，參與其與腐霉菌的互作過程，敲除該基因后促進(jìn)了腐霉菌的進(jìn)一步擴(kuò)展，導(dǎo)致敏感性明顯增強(qiáng)。蕪菁SWEET家族成員被根瘤菌（Plasmodiophora brassicae）接種誘導(dǎo)，可操縱寄主體內(nèi)糖從合成部位到根瘤菌定植部位，為病菌的生長和擴(kuò)繁提供營養(yǎng)，敲除SWEET11增強(qiáng)了寄主對根腫病的抗病性。棉花（Gossypium hirsutum L.）GhSWEET42過表達(dá)植株在感染大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）后具有高感病性，該基因的突變體則表現(xiàn)為抗病性。由此可見，SWEET家族成員在不同的寄主一病原菌互作過程中所表現(xiàn)的作用不同。本研究分析表明，楊樹27個SWEETs家族成員中有21個成員參與了對腐皮鐮刀菌侵染的響應(yīng)，其中SWEETlb等9個成員在接菌48 h和72 h后表達(dá)了均上調(diào)，SWEETla等9個成員在接菌48 h和72 h后均下調(diào)，推測該基因家族在二者互作過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。后續(xù)，將通過進(jìn)一步研究明確楊樹SWEET不同成員在互作過程中的具體作用。

水楊酸、乙烯和茉莉酸信號通路不僅參與植物自身的生長發(fā)育，還調(diào)控植物的抗病反應(yīng)，三者通過相互協(xié)同或拮抗的方式，使植物以最少的能量代價(jià)維持自身生長和防御各種病原微生物入侵。在植物免疫反應(yīng)中，通常認(rèn)為水楊酸參與植物對活體營養(yǎng)型病原菌的抗性，乙烯與茉莉酸協(xié)同作用誘導(dǎo)植物對死體營養(yǎng)型病原的抗性。對作物類土傳真菌類病害的研究表明，乙烯信號通路參與棉花一枯萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻·紋枯病菌（Rhizoctonia solani）的互作過程。棉花枯萎病菌的侵染可誘導(dǎo)乙烯信號通路下游關(guān)鍵調(diào)控因子GbERFl-like的表達(dá)，從而激活PR3、PR4等病程相關(guān)基因，引發(fā)抗病反應(yīng)。在水稻（OryzasativaL.）中過表達(dá)乙烯合成酶基因OsACS2，可促進(jìn)內(nèi)源乙烯水平的積累，激活乙烯信號通路，提高了對紋枯病的抗性。番茄枯萎病菌（Fusariumoxysporum）的侵染可誘導(dǎo)番茄水楊酸和乙烯信號通路標(biāo)志基因顯著上調(diào)，推測兩條通路共同參與番茄-枯萎病菌的互作。對楊樹葉銹病的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸信號通路可通過提高葉片中兒茶素、原花青素等次生代謝物的含量，增強(qiáng)楊樹對葉銹病的抗性。上述研究表明，植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受植物基因型、與病原菌的互作及環(huán)境等因素的影響，不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在傳遞信號時也可能會存在相互交叉或重疊。本研究發(fā)現(xiàn)，接種腐皮鐮刀菌后，楊樹根中乙烯受體ETR、乙烯信號通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上調(diào)表達(dá)，乙烯通路負(fù)調(diào)控因子MPK6下調(diào)表達(dá)。水楊酸信號通路關(guān)鍵基因上調(diào)表達(dá)，茉莉酸信號通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子下調(diào)表達(dá)。推測乙烯信號通路在楊樹-腐皮鐮刀菌互作中起關(guān)鍵作用，水楊酸通路可能協(xié)同乙烯通路共同參與了楊樹對腐皮鐮刀菌的防御反應(yīng)。

苯丙烷生物合成途徑是植物體內(nèi)物質(zhì)合成與代謝的重要途徑，也是植物抗性防御系統(tǒng)的重要組成部分。該途徑產(chǎn)生的酚類、黃酮類等代謝產(chǎn)物可以抑制病原菌的生長，同時具有強(qiáng)大的抗氧化作用，幫助植物抵御自由基的傷害，在抗病過程中起化學(xué)屏障作用。對楊樹-葉銹菌互作的研究表明，葉銹菌侵染可誘導(dǎo)原花青素等化學(xué)物質(zhì)的積累，從而阻止病斑的進(jìn)一步擴(kuò)展。苯丙烷生物合成途徑的另一個重要產(chǎn)物是木質(zhì)素，是由酚類物質(zhì)經(jīng)過復(fù)雜過程結(jié)合而成的多聚體，也是植物細(xì)胞壁的主要成分。當(dāng)植物遭受病原菌侵染后，細(xì)胞壁會積累大量的木質(zhì)素。細(xì)胞壁的木質(zhì)化可以阻止病原菌的擴(kuò)散，減少真菌溶解酶類對植物細(xì)胞的滲透和毒害作用，為抵抗病原菌的入侵提供了物理屏障。研究發(fā)現(xiàn)，楊樹潰瘍病菌（Dothiorella gregaria）及其菌絲體提取物能誘導(dǎo)楊樹細(xì)胞壁木質(zhì)素的積累，而且抗病品種中木質(zhì)素積累的速度和水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于感病品種。對土傳病害的研究表明，棉花在應(yīng)對大麗輪被菌入侵時，Gh4CL、GhC3H、GhCCR4等木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著提高，抗黃萎病棉花品種中的木質(zhì)素含量明顯高于感病棉花品種。煙草經(jīng)青枯病菌（Ralstonia solanacearum）侵染可誘導(dǎo)抗病品種中CCoAOMT、4CL、CCR等木質(zhì)素合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，CCR、4CL、C3'H和COMT等與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因被腐皮鐮刀菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測細(xì)胞壁增厚可能是楊樹應(yīng)對該病原菌侵染的策略之一。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定到327個腐皮鐮刀菌侵染誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因，這些基因主要富集到糖酵解／糖異生、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、果糖和甘露糖代謝以及淀粉和蔗糖代謝等通路上。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，楊樹SWEETs家族中有9個家族成員在侵染48 h和72 h后均上調(diào)表達(dá)，乙烯信號通路關(guān)鍵成員EIN3在侵染發(fā)生48h時上調(diào)表達(dá)，ETR、ERF1、ERF2在侵染48 h和72 h后均上調(diào)表達(dá)，木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因CCR、4CL、C3'H、COMT上調(diào)表達(dá)，推測糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、乙烯信號通路、木質(zhì)素積累等可能是楊樹響應(yīng)腐皮鐮刀菌侵染的主要事件。后續(xù)將對挖掘到的關(guān)鍵候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

（責(zé)任編輯：張研）

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD2200201）;農(nóng)業(yè)生物育種重大項(xiàng)目（2022ZD0401505）;