甘薯U6啟動子克隆及其轉(zhuǎn)錄活性分析

摘要： 在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，U6啟動子可以通過驅(qū)動sgRNA的表達來編輯目的基因，因而其轉(zhuǎn)錄活性會影響基因編輯效率。盡管人們已經(jīng)在擬南芥、玉米、大豆、棉花等植物中開展了U6啟動子的克隆與應用研究，然而目前在甘薯中U6啟動子的相關(guān)研究還未見報道。本研究利用擬南芥的AtU6 SnRNA的保守序列在三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）基因組數(shù)據(jù)庫中搜索候選U6 RNA，然后在其上游搜索到2個不同的候選U6啟動子，長度分別為526 bp（IbU6p-1）和532 bp（IbU6p-2）；序列比對分析結(jié)果顯示，甘薯的U6啟動子具有上游序列元件（USE）以及TATA-box，其序列也與擬南芥高度相似。然后，利用獲得的U6啟動子核酸序列構(gòu)建了能夠驅(qū)動螢火蟲熒光素酶基因（LUC）表達的重組框U6：：LUC。最后，將含有上述重組載體的根癌農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片和甘薯愈傷組織中，并通過熒光成像技術(shù)分析熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在煙草及甘薯愈傷組織中2個甘薯U6啟動子均能驅(qū)動LUC基因表達，具有轉(zhuǎn)錄活性。同時，IbU6p-2的轉(zhuǎn)錄活性無論是在煙草葉片中還是在甘薯愈傷組織中都顯著高于擬南芥U6啟動子。本研究結(jié)果為進一步發(fā)展甘薯基因編輯技術(shù)提供了參考。

關(guān)鍵詞： 甘薯；U6啟動子；克隆；基因編輯；轉(zhuǎn)錄活性

中圖分類號： S531"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）06-0969-06

Cloning and transcriptional activity analysis of U6 promoter in sweetpotato

TANG Wei， KOU Meng， SONG Weihan， YAN Hui， WANG Xin， LI Chen， GAO Runfei， ZHANG Yungang， LI Qiang

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai District/Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xuzhou 221131， China）

Abstract： In the CRISPR/Cas9 gene editing system， the U6 promoter can edit target genes by driving sgRNA expression， so its transcriptional activity can affect the efficiency of gene editing. Although studies on cloning and application of U6 promoter have been carried out in Arabidopsis thaliana， corn， soybean， cotton and other plants， there aren’t any reports on relative research of U6 promoter in sweetpotato. In this study， we searched the Ipomoea trifida genome database for candidate U6 RNA， using the conservative sequence of AtU6 SnRNA in A. thaliana， and then found two different candidate U6 promoters with lengths of 526 bp （IbU6p-1） and 532 bp （IbU6p-2）， respectively. Through sequence alignment analysis， we found that the U6 promoter of sweetpotato has upstream sequence element （USE） and TATA box， and its sequence was highly similar to that of A. thaliana. Then， a recombinant box U6 ：： LUC was constructed using the obtained U6 promoter nucleic acid sequence to drive the expression of firefly luciferase gene. Finally， Agrobacterium tumefaciens containing the recombinant vector was genetically transformed into Nicotiana benthamiana leaves and sweetpotato callus tissues by transient expression， and luciferase activity was analyzed using fluorescence imaging technology. The results showed that both sweetpotato U6 promoters could drive the expression of LUC gene and had transcriptional activity in tobacco and sweetpotato calli. At the same time， the transcriptional activities of IbU6p-2 in tobacco leaves and sweetpotato calli were significantly higher than that of A. thaliana U6 promoter. The results of this study lay a foundation for further development of sweetpotato gene editing technology.

Key words： sweetpotato；U6 promoter；cloning；gene editing；transcriptional activity

基因編輯是現(xiàn)代生物學發(fā)展史上的一項革命性的技術(shù)，它已經(jīng)被廣泛運用到與醫(yī)學、動物、植物、昆蟲、微生物等相關(guān)的多個研究領(lǐng)域[1-5]。該項技術(shù)從發(fā)明至今已從最初的鋅指核酸酶系統(tǒng)發(fā)展到了簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）。現(xiàn)今，CRISPR/Cas9憑借其具有高效、便捷、易操作等優(yōu)點已經(jīng)成為進行基因功能研究與種質(zhì)遺傳改良的主要工具，并被運用于作物的各個品質(zhì)性狀的改良，比如用于研制富含抗氧化成分的紫番茄[6]、高產(chǎn)水稻[7]、富含omega-3脂肪酸的亞麻薺[8]和高油酸大豆[9]等。

CRISPR/Cas9通過sgRNA將Cas9蛋白帶到靶點，對DNA進行切割，產(chǎn)生特異性雙鏈斷裂（DBS），隨后利用非同源末端連接或同源重組機制來修復DSB，從而產(chǎn)生堿基的突變、缺失，進而造成基因突變[10]。U6 RNA是雙子葉植物中的一類非編碼小RNA，它所對應的U6啟動子是CRISPR/Cas9的主要組成部分之一，已廣泛被人們用來驅(qū)動sgRNA的轉(zhuǎn)錄[11]。研究結(jié)果表明，U6啟動子通過影響sgRNA的表達豐度從而決定基因的編輯效率[12]。為了提高在不同物種中的基因編輯效率，人們對植物內(nèi)源的U6啟動子開展了相關(guān)研究。Gao等[13]根據(jù)自身的內(nèi)源啟動子成功建立了適用于煙草的CRISPR / Cas9系統(tǒng)。在蘋果愈傷組織中，卞書迅等[14]使用內(nèi)源性U6啟動子，大大增強了sgRNA的表達。唐志強等[15]在金銀花中克隆了3個U6啟動子，并篩選出一個具有高效轉(zhuǎn)錄活性的啟動子。目前，研究者已在多個植物中開展了U6啟動子相關(guān)研究，但是未見關(guān)于甘薯U6啟動子的報道。為了更好地在甘薯中開展基因編輯工作，本研究擬將克隆到的2個甘薯U6啟動子分別與常用的擬南芥U6啟動子進行轉(zhuǎn)錄活性比較，為優(yōu)化甘薯CRISPR / Cas9基因編輯系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的甘薯品種徐紫薯8號、本氏煙草和植物表達載體pGreenII-0800：：LUC（LUC表示熒光素酶基因）均保存于江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所甘薯遺傳育種研究室。農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105細胞由上海唯地生物技術(shù)有限公司提供； ECL化學發(fā)光試劑盒由碧云天生物技術(shù)有限公司提供。引物合成及測序由上海擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯U6啟動子克隆與生物信息學分析 取徐紫薯8號的幼嫩葉片，并參考十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法抽提其基因組DNA[16]。用擬南芥的AtU6 SnRNA保守序列在三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）基因組數(shù)據(jù)庫 （http：//sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/）中搜索候選U6 RNA，然后在其上游找到對應啟動子序列。根據(jù)同源序列法設(shè)計引物（表1），用高保真酶（寶生物工程有限公司產(chǎn)品，大連）在甘薯中擴增U6啟動子片段（IbU6p）。PCR反應體系如下：98 ℃變性 2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸 3 min。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收單個片段并利用pEASY-T1 Cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）進行TA（Original TA Cloning Kit）克隆和測序分析。

使用BioEdit軟件對甘薯U6啟動子與擬南芥的AtU6-1啟動子進行序列比對，分析甘薯U6啟動子的序列特征。然后，利用植物啟動子分析軟件PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析甘薯U6啟動子的順式作用元件。

1.2.2 U6啟動子表達載體的構(gòu)建 首先，將植物表達載體pGreenII-0800：：LUC用Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ進行雙酶切，獲得線性化質(zhì)粒。然后，根據(jù)同源重組的方法，以重組測序載體pEASY-T1：：IbU6p為模板擴增U6啟動子片段。利用膠回收試劑盒獲得純化的線性化質(zhì)粒pGreenII-0800：：LUC和插入片段IbU6p。根據(jù)pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit試劑盒說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），進行目的片段和載體的連接反應。然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。挑取抗性平板上的單克隆進行菌落PCR檢測并送公司測序，將測序結(jié)果正確的單克隆進行搖菌并獲得重組表達載體IbU6p：：LUC。以同樣的方法將擬南芥的AtU6-1啟動子插入pGreenII-0800：：LUC中，將該重組載體命名為AtU6p：：LUC。

1.2.3 煙草和甘薯愈傷組織中的瞬時表達 將構(gòu)建成功的IbU6p：：LUC和AtU6p：：LUC重組表達載體以及陰性對照pGreenII-0800：：LUC空載通過液氮法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105；然后，在抗性LB培養(yǎng)基[含有50 μg/ml卡那霉素、50 μg/ml利福平和100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]中振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.8。離心后，用重懸液[10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES，pH 5.6），100 μmol/L AS]重懸菌體至OD600為0.3～0.5。室溫條件下放置2～3 h后注射到煙草葉片中，3 d后進行熒光發(fā)光檢測。

將上述含有IbU6p：：LUC和AtU6p：：LUC的農(nóng)桿菌液同樣在抗性LB培養(yǎng)基中振蕩至菌液OD600值為0.8，然后用含有100 μmol/L AS和2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600為0.5。將準備好的甘薯愈傷組織放入其中，暗培養(yǎng)30 min后，超聲波處理30 s。然后將侵染的愈傷組織在MS+2，4-D+AS的固體培養(yǎng)基中于28 ℃暗培養(yǎng)72 h，再用無菌水重復清洗甘薯愈傷組織4次后放在MS+2，4-D培養(yǎng)基上。最后，利用螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）進行熒光發(fā)光檢測。

1.2.4 生物發(fā)光檢測與分析 將瞬時轉(zhuǎn)化的煙草葉片和甘薯愈傷組織分別在100 mmol/L的熒光素鉀鹽溶液中反應5 min。通過高分辨率制冷電荷耦合器件（CCD）熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司產(chǎn)品）對煙草葉片發(fā)光圖像進行采集，并運用成像軟件對采集數(shù)據(jù)進行分析；另外，使用Leica DM4000 B型熒光顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品）對甘薯愈傷組織進行拍照。試驗數(shù)據(jù)利用Excel 365進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子克隆與序列分析

本試驗基于U6啟動子基因序列的保守性，在現(xiàn)有的甘薯近緣野生種Ipomoea trifida的基因組數(shù)據(jù)中搜索到2個不同的候選U6啟動子。然后，根據(jù)同源序列法設(shè)計引物，以甘薯品種徐紫薯8號的基因組DNA為模板擴增了2個甘薯U6啟動子片段，分別命名為IbU6p-1和IbU6p-2，片段長度分別為526 bp和532 bp（圖1）。同時，從已報道的基因編輯載體pHSE401[15]中分離到了擬南芥U6啟動子片段AtU6p。

將克隆到的2個甘薯U6啟動子和擬南芥U6啟動子進行序列比對，著重分析影響U6啟動子轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件USE和TATA-box以及兩者之間的距離。結(jié)果表明，IbU6p-1和IbU6p-2具有與AtU6p一樣保守的USE元件以及TATA-box，而且2個元件之間的間隔也相對一致（圖2），暗示所克隆的IbU6啟動子很可能具有與AtU6p一樣的轉(zhuǎn)錄活性。

2.2 U6啟動子表達載體構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Bam HⅠ對植物瞬時表達載體pGreenII-0800：：LUC進行雙酶切后，分別將IbU6p-1、IbU6p-2和AtU6p核酸片段插入該載體中。然后，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞獲得單克隆。挑選陽性菌落經(jīng)液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并進行酶切驗證和測序分析。結(jié)果（圖3）表明，重組載體IbU6p-1：：LUC、IbU6p-2：：LUC和AtU6p：：LUC酶切后出現(xiàn)2個條帶，大小與預期結(jié)果一致；同時測序結(jié)果也與各個U6啟動子序列完全一致，說明U6啟動子表達載體構(gòu)建成功。

2.3 IbU6啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析

分別將含有IbU6p-1：：LUC、IbU6p-2：：LUC和AtU6p：：LUC載體的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化到煙草，并以pGreenII-0800：：LUC空載為陰性對照。待72 h后對注射的煙草葉片部分開展熒光素酶活性檢測，同時對熒光信號強弱進行方差分析，發(fā)現(xiàn)IbU6p-2的熒光信號最強，其次為AtU6p，而IbU6p-1的熒光信號最弱（圖4）。

為了進一步比較分析IbU6p-1、IbU6p-2和AtU6p在甘薯中的轉(zhuǎn)錄活性，通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法分別用IbU6p-1：：LUC、IbU6p-2：：LUC和AtU6p：：LUC轉(zhuǎn)化甘薯愈傷組織，并在熒光顯微鏡下進行觀察。結(jié)果（圖5）表明，盡管所有的U6啟動子都可以在甘薯愈傷組織中驅(qū)動LUC基因表達，但其效率存在明顯的差異。與AtU6p：：LUC相比，IbU6p-1：：LUC和IbU6p-2：：LUC轉(zhuǎn)染的甘薯愈傷組織熒光信號明顯增加。同時，在IbU6p-1：：LUC轉(zhuǎn)染的甘薯愈傷組織中，能明顯觀察到的熒光信號發(fā)光點相對較少，而在IbU6p-2：：LUC轉(zhuǎn)染的甘薯愈傷組織中，其熒光信號發(fā)光點的數(shù)量和發(fā)光強度要明顯高于IbU6p-1：：LUC。上述結(jié)果說明，在甘薯愈傷組織中，甘薯內(nèi)源U6啟動子驅(qū)動基因表達的能力要高于外源的擬南芥U6啟動子，特別是IbU6p-2啟動子能夠大幅提高sgRNA的轉(zhuǎn)錄效率。

3 討論

在植物基因編輯系統(tǒng)中，U6啟動子通常被用來驅(qū)動sgRNAs的高效表達。它一般以高度保守的鳥嘌呤核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始點，有助于改善轉(zhuǎn)錄的sgRNA的同質(zhì)性，并減少脫靶效應[17-18]。因此，在許多植物物種中擬南芥U6（AtU6）啟動子和水稻U6（OsU6）啟動子被廣泛用于異源表達sgRNAs[19-22]。一般而言，在CRISPR/CAS9系統(tǒng)中，AtU6啟動子用于雙子葉植物，OsU6啟動子用于單子葉植物[23-25]。然而，U6啟動子的異源應用大多在親緣關(guān)系較近的植物物種中[26]。最近，在棉花、大豆、菊苣、小麥等作物的研究中，已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源U6啟動子能更好地驅(qū)動sgRNA的高表達，從而提高自身的基因編輯效率[27-30]。所以，內(nèi)源性U6啟動子的克隆與研究，對優(yōu)化CRISPR/Cas9介導的作物基因組編輯系統(tǒng)有著重要的意義。

最近，人們在甘薯中已經(jīng)實現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9的基因編輯研究[31-32]，然而該研究是通過AtU6啟動子異源驅(qū)動sgRNAs表達。本研究首先克隆了甘薯U6啟動子，然后將U6啟動子片段插入到LUC報告基因的上游，獲得重組表達載體IbU6p-1：：LUC和IbU6p-2：：LUC，最后通過瞬時表達LUC基因和化學發(fā)光來分析甘薯U6啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘薯IbU6p-1和IbU6p-2都含有RNA聚合酶Ⅲ識別的USE和TATA-box順式元件，并具有轉(zhuǎn)錄活性，并且IbU6p-2的轉(zhuǎn)錄活性無論是在煙草葉片還是在甘薯愈傷組織中都顯著高于AtU6p。上述結(jié)果表明IbU6p-2可以作為優(yōu)異的內(nèi)源U6啟動子用于甘薯基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建。

4 結(jié)論

從甘薯品種徐紫薯8號中克隆到2條長度分別為526 bp和532 bp的U6啟動子（分別命名為IbU6p-1、IbU6p-2），均具有轉(zhuǎn)錄活性，其中IbU6p-2的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于IbU6p-1。此外，甘薯U6啟動子在其愈傷組織中的轉(zhuǎn)錄活性高于擬南芥的U6啟動子，特別是IbU6p-2的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于AtU6p。

參考文獻：

[1] MILLS E M， BARLOW V L， LUK L Y P， et al. Applying switchable Cas9 variants to in vivo gene editing for therapeutic applications[J]. Cell Biology and Toxicology，2020，36（1）：17-29.

[2] TANIHARA F， HIRATA M， OTOI T. Current status of the application of gene editing in pigs[J]. Journal of Reproduction and Development，2021，67（3）：177-187.

[3] YIN K Q， GAO C X， QIU J L. Progress and prospects in plant genome editing[J]. Nature Plants，2017，3：17107.

[4] GANTZ V M， AKBARI O S. Gene editing technologies and applications for insects[J]. Current Opinion in Insect Science，2018，28：66-72.

[5] ADIEGO-PREZ B， RANDAZZO P， DARAN J M， et al. Multiplex genome editing of microorganisms using CRISPR-Cas[J]. FEMS Microbiology Letters，2019，366（8）：86.

[6] CˇERMK T， BALTES N J， CˇEGAN R， et al. High-frequency， precise modification of the tomato genome[J]. Genome Biology，2015，16：232.

[7] BANDYOPADHYAY A， YIN X， BISWAL A， et al. CRISPR-Cas9-mediated genome editing of rice towards better grain quality[J]. Methods in Molecular Biology，2019，1892：311-336.

[8] JIANG W Z， HENRY I M， LYNAGH P G， et al. Significant enhancement of fatty acid composition in seeds of the allohexaploid，Camelina sativa，using CRISPR/Cas9 gene editing[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（5）：648-657.

[9] 張 威，許文靜，許亞男，等. 基于CRISPR/Cas9基因編輯的高油酸大豆品系創(chuàng)制[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2023，39（2）：321-327.

[10]PICKAR-OLIVER A， GERSBACH C A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications[J]. Nature Review Molecular Cell Biology，2019，20（8）：490-507.

[11]CONG L， RAN F A， COX D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science，2013，339（6121）：819-823.

[12]WEI Y D， QIU Y， CHEN Y H， et al. CRISPR/Cas9 with single guide RNA expression driven by small tRNA promoters showed reduced editing efficiency compared to a U6 promoter[J]. RNA，2017，23（1）：1-5.

[13]GAO J P， WANG G H， MA S Y， et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J]. Plant Molecular Biology，2015，87（1/2）：99-110.

[14]卞書迅，韓曉蕾，袁高鵬，等. 蘋果U6啟動子的克隆及功能分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2019，52（23）：4364-4373.

[15]唐志強，李小麗，許小涵，等. 金銀花U6啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性分析[J]. 山東科學，2022，35（2）：11-17.

[16]李 強，揭 琴，劉慶昌，等. 甘薯基因組DNA高效快速提取方法[J]. 分子植物育種，2007，5（5）：743-746.

[17]SHAN Q W， WANG Y P， LI J， et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31（8）：686-688.

[18]SATHEESH V， ZHANG H， WANG X T， et al. Precise editing of plant genomes-prospects and challenges[J]. Seminars in Cell amp; Developmental Biology，2019，96：115-123.

[19]JIANG W Z， ZHOU H B， BI H H， et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（20）：e188.

[20]FAUSER F， SCHIML S， PUCHTA H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2014，79（2）：348-359.

[21]LI J F， NORVILLE J E， AACH J， et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9[J]. Nature Biotechnology，2013，31（8）：688-691.

[22]ZHOU H B， LIU B， WEEKS D P， et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（17）：10903-10914.

[23]BORTESI L， FISCHER R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond[J]. Biotechnology Advances，2015，33（1）：41-52.

[24]MA X L， ZHANG Q Y， ZHU Q L， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant，2015，8（8）：1274-1284.

[25]BELHAJ K， CHAPARRO-GARCIA A， KAMOUN S， et al. Plant genome editing made easy：targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system[J]. Plant Methods，2013，9（1）：39.

[26]WANG M B， HELLIWELL C A， WU L M， et al. Hairpin RNAs derived from RNA polymerase Ⅱ and polymerase Ⅲ promoter-directed transgenes are processed differently in plants[J]. RNA，2008，14（5）：903-913.

[27]LONG L， GUO D D， GAO W， et al. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing in cotton by improved sgRNA expression[J]. Plant Methods，2018，14：85.

[28]DI Y H， SUN X J， HU Z， et al. Enhancing the CRISPR/Cas9 system based on multiple GmU6 promoters in soybean[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2019，519（4）：819-823.

[29]BERNARD G， GAGNEUL D， ALVES DOS SANTOS H， et al. Efficient genome editing using CRISPR/Cas9 technology in chicory[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（5）：1155.

[30]LIU H Y， WANG K， JIA Z M， et al. Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system[J]. Journal of Experimental Botany， 2020， 71（4）： 1337-1349.

[31]WANG H X， WU Y L， ZHANG Y D， et al. CRISPR/Cas9-Based mutagenesis of starch biosynthetic genes in sweetpotato （Ipomoea Batatas） for the improvement of starch quality[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（19）：4702.

[32]劉霞宇. 甘薯CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的建立及miR2111調(diào)控甘薯塊根中花青素積累的功能研究[D]. 太原：山西農(nóng)業(yè)大學，2020.

（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2023-07-29

基金項目：徐州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點專項（KC21116）；國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-10）

作者簡介：唐 維（1982-），男，湖北武漢人，博士，副研究員，主要從事甘薯分子遺傳育種研究。（E-mail）tangweilhr@163.com

通訊作者：李 強，（E-mail）instrong@163.com