球形賴(lài)氨酸芽孢桿菌WH07 對(duì)潛育化水稻土的改良效果和土壤微生態(tài)的影響

摘要 為建立潛育化稻田微生物改良技術(shù)，采用MWMM（modified wolfe’s mineral medium）培養(yǎng)基富集微好氧FeOB，結(jié)合16S rRNA 測(cè)序等技術(shù)鑒定菌株種類(lèi)，分別采用100 mL 106（ T1）、107（ T2）、108（ T3） CFU/mL菌株發(fā)酵液處理潛育化水稻土，評(píng)價(jià)菌株對(duì)潛育化水稻土壤的還原性物質(zhì)、土壤養(yǎng)分、氮循環(huán)功能基因豐度和水稻秧苗生長(zhǎng)的影響，并利用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)評(píng)價(jià)該菌株對(duì)土壤微生態(tài)的影響。結(jié)果顯示：篩選到的對(duì)Fe2+具有較強(qiáng)氧化作用的FeOB 為球形賴(lài)氨酸芽孢桿菌WH07（Lysinibacillus sphaericus WH07）；相比于CK，土壤氧化還原電位（Eh）顯著提高（Plt;0.05），并由負(fù)電位轉(zhuǎn)為正電位；T1、T2、T3 處理土壤還原性物質(zhì)總量分別減少26.47%、41.53%、53.19%，亞鐵含量分別減少0.37%、21.50%、50.09%，亞錳含量分別減少7.84%、21.57%、37.25%。土壤堿解氮含量分別顯著增加15.50%、27.38%、48.90%（Plt;0.05），速效磷分別顯著增加12.52%、17.34%、27.38%（Plt;0.05），速效鉀分別顯著增加11.56%、17.20%、19.34%（Plt;0.05），有機(jī)質(zhì)分別顯著增加8.66%、22.22%、45.05%（Plt;0.05），pH 顯著分別增加3.40%、8.94%、16.99%（Plt;0.05）。土壤AOAamoA基因豐度分別增加11.94%、14.68%、33.83%，nosZ 基因豐度分別增加42.97%、75.78%、118.75%，nifH 基因豐度分別增加38.29%、51.05%、216.13%，UreC 基因豐度分別增加16.74%、54.51%、60.94%。水稻株高分別增加5.44%、10.98%、36.00%，葉齡分別增加10.21%、23.42%、36.94%，鮮質(zhì)量增加分別12.61%、22.52%、28.38%，白根數(shù)分別增加10.14%、32.92%、46.81%。土壤微生物多樣性指數(shù)Chao1 和Shannon 指數(shù)相比于CK均顯著降低（Plt;0.05）。門(mén)水平上相對(duì)豐度前10 的土壤細(xì)菌中，有8 個(gè)顯著下調(diào)（Plt;0.05），如Proteobacteria 等、2個(gè)（Bacteroidetes和Firmicutes）顯著上調(diào)。在相對(duì)豐度前50的屬中，3個(gè)處理分別有20、19、22個(gè)屬顯著上調(diào)（Plt;0.05），包括Macellibacteroides 等6 個(gè)FeOB；25 個(gè)屬在3 個(gè)處理中均顯著下調(diào)（Plt;0.05），包括MBNT15 等4 個(gè)鐵還原菌。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示菌株WH07 潛在地與FeOB 協(xié)同改善土壤理化性質(zhì)和生物活性，最終促進(jìn)了秧苗生長(zhǎng)。結(jié)果表明，應(yīng)用菌株WH07 顯著改善了潛育化水稻土壤理化性質(zhì)，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。

關(guān)鍵詞 潛育化稻田； 土壤改良； 球形賴(lài)氨酸芽孢桿菌； 還原性物質(zhì)； 氧化還原電位； 氮循環(huán)功能基因；土壤微生態(tài)

中圖分類(lèi)號(hào) S156.99 ； S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）04-0169-13

潛育化稻田是我國(guó)南方主要低產(chǎn)田類(lèi)型，面積約有346萬(wàn)hm2［ 1］，且近來(lái)有擴(kuò)大趨勢(shì)，潛育化稻田中的水稻生長(zhǎng)發(fā)育不良、產(chǎn)量?jī)H為正常的一半，這嚴(yán)重制約著南方地區(qū)水稻穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)。潛育化是由于土壤長(zhǎng)期在漬水條件下嚴(yán)重缺氧，土壤中有毒還原性物質(zhì)如Fe2+等累積、氧化還原電位（Eh）下降、土壤變成藍(lán)灰色或青灰色的土壤退化現(xiàn)象［2］。潛育化土壤中有毒還原性物質(zhì)累積、生物活性不高、礦化度低、有效養(yǎng)分偏少等導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)慢、分蘗少、黑根多、僵苗不發(fā)、遲熟低產(chǎn)［1］。然而，潛育化稻田主要分布于肥水條件較好的低洼地區(qū)，土壤富含有機(jī)質(zhì)和全量養(yǎng)分，具有較大的增產(chǎn)潛力［2］，對(duì)這類(lèi)稻田進(jìn)行有效改良和利用將有利于我國(guó)糧食生產(chǎn)安全。目前，潛育化稻田主要采用以下5 種方法進(jìn)行改良。（1）農(nóng)業(yè)工程法。修建排水措施，如開(kāi)挖排水溝、埋設(shè)暗溝、暗管等［3］，該方法可顯著降低地下水位和改變土壤長(zhǎng)期漬水情況，可提高水稻產(chǎn)量10.1%～13.3%［2］。農(nóng)業(yè)工程建設(shè)對(duì)治理潛育化土壤行之有效，但限于自然條件和成本等原因，在生產(chǎn)中難以大面積推廣。（2）優(yōu)化種植制度。改冬漚為冬曬，減少土壤淹水時(shí)間。改冬閑為冬種，在部分光照條件好、地下水位不高、潛育化程度較弱的農(nóng)田種植綠肥、油菜等，實(shí)行水旱輪作［4］。（3）增肥改土。增施磷鉀肥、暖性肥料和生石灰［5］，提高養(yǎng)分供給、水溫和土壤pH，減輕對(duì)禾苗根系傷害，但長(zhǎng)期大量使用生石灰易造成土壤板結(jié)。（4）實(shí)行壟作。對(duì)傳統(tǒng)的平作田做好壟溝，水不浸過(guò)壟面，使壟面泥土長(zhǎng)期保持浸潤(rùn)，壟上種稻，長(zhǎng)期自然免耕［6］，但該措施操作難度較大，不易大面積推廣。（5）化學(xué)改良法。采用釋氧劑，如過(guò)氧化鈣、過(guò)氧化尿素等作肥料［7］，釋氧劑施入稻田后，氧氣快速釋放出來(lái)，有毒有害還原物質(zhì)得以削減，水稻根系活力和產(chǎn)量得以提高［8］。然而，釋氧劑在土壤中反應(yīng)迅速、持效期短，難以在整個(gè)水稻生育期內(nèi)發(fā)揮作用［7］。目前采用微生物改良潛育化稻田的研究未見(jiàn)報(bào)道，但土壤中Fe2+受到FeRB（Fe3+ reducingbacteria）與FeOB（Fe2+ oxidiazing bacteria）的調(diào)控和轉(zhuǎn)化。其中FeRB 是一類(lèi)能將Fe3+還原為Fe2+的微生物，能降低土壤Eh、加重土壤潛育化；而微好氧FeOB 是一類(lèi)對(duì)氧氣需求量少的土壤微生物，能夠適應(yīng)稻田低氧環(huán)境，對(duì)鐵氧化作用凈反應(yīng)速率的平均貢獻(xiàn)可達(dá)44.6%，能顯著降低Fe2+半衰期，加快二價(jià)鐵氧化速率［9］。為此，應(yīng)用此類(lèi)微生物有可能改良潛育化土壤，并且微生物施用簡(jiǎn)便、環(huán)境兼容性好，能在土壤中長(zhǎng)期存活，可在相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間段發(fā)揮作用。然而，目前關(guān)于FeOB 的研究尚不多見(jiàn)，且對(duì)潛育化水稻土壤改良效果也未見(jiàn)報(bào)道。本研究從潛育化土壤中篩選獲得FeOB，通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株對(duì)潛育化土壤的改良效果，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（qPCR）和高通量測(cè)序技術(shù)探討該菌株對(duì)氮循環(huán)功能基因豐度和土壤微生物態(tài)的影響，以期為潛育化土壤高效微生物改良劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 FeOB的富集和分離

采集荊州市沙市區(qū)觀音垱鎮(zhèn)丫角村（112.25°E，30.31°N）潛育化水稻土，立即裝入?yún)捬醮? ℃條件下帶回。采用Fe（Ⅱ）-O2逆濃度梯度管法[10]富集FeOB。在滅菌的15 mL 具塞玻璃瓶底部中加入2.0 g FeS 粉末，并沿管壁加入10 mL MWMM 半固體培養(yǎng)基［11］與100 μL 的土壤1 000 倍浸提稀釋液后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 后，采用梯度稀釋法對(duì)FeS 氧化帶中的細(xì)菌進(jìn)行單菌落分離和純化，純化后的菌株采用LB 液體培養(yǎng)基于28 ℃ 、150 r/min 發(fā)酵48 h，將100 μL 濃度為106、107、108 CFU/mL 發(fā)酵菌液再次回接到加有FeS 粉末的MWMM 培養(yǎng)基中，以LB 培養(yǎng)基做對(duì)照，置于30 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，10 d 后觀測(cè)FeS 氧化情況，將有明顯氧化現(xiàn)象的菌株使用甘油管于?80 ℃保存。

1.2 菌株鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。篩選獲得的菌株經(jīng)結(jié)晶紫染色后，在BX43 光學(xué)顯微鏡［奧林巴斯（中國(guó)）有限公司］下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)。

2）生理生化鑒定。參照文獻(xiàn)［12-13］進(jìn)行生理生化鑒定，包括革蘭氏染色、H2O2酶試驗(yàn)、甘露糖利用、果糖利用、硝酸鹽還原試驗(yàn)、葡萄糖利用等。

3）16S rRNA 鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行基因組DNA 提取，采用16S rRNA 通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［14］，測(cè)序序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并利用MEGA 11.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［15］。

1.3 對(duì)潛育化水稻土的改良效果評(píng)價(jià)

1）菌液制備。將?80 ℃甘油管保藏的FeOB 于LB 培養(yǎng)基上活化24 h，挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)48 h，調(diào)整菌液濃度為106、107、108 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）試驗(yàn)處理。將荊州市沙市區(qū)觀音垱鎮(zhèn)丫角村采集的潛育化水稻土分裝至直徑20 cm、高25 cm 的塑料缽中，表面覆蓋2～3 cm 水層，保持5～7 d 后用于盆栽試驗(yàn)。分別將100 mL 濃度為106 （T1）、107（T2）、108（ T3） CFU/mL菌株WH07發(fā)酵液采用直徑2 cm 的塑料管分5 個(gè)點(diǎn)注入到距地表10～15 cm的土層中，對(duì)照（CK）使用等量LB 培養(yǎng)基，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 缽。菌液處理后，將催芽的水稻種子按每缽10 粒播入盆栽缽內(nèi)，置于溫室中培養(yǎng)：溫度30 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗。

3）土壤氧化還原電位測(cè)定。處理前和處理后每隔10 d，使用TR-901 型土壤ORP 儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）按照廠家說(shuō)明書(shū)測(cè)量土壤的氧化還原電位。

4）土壤樣本采集和保存。處理后30 d，采用五點(diǎn)法采集每缽水稻表層5～10 cm 土壤樣品，每個(gè)重復(fù)為1 組（5 缽/組），每組土壤樣品分為2 部分：一部分液氮速凍后儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱，用于土壤基因組DNA 提取，另一部分在4 ℃下保存，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

5）土壤理化性質(zhì)測(cè)定。參照文獻(xiàn)［16］中的測(cè)定方法，土壤pH 的測(cè)定采用電位法（m 水∶m 土=2.5∶1），土壤有機(jī)質(zhì)（soil organic matter，SOM）含量的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化-容量法，堿解氮（alkaline hydrolyzablenitrogen，AHN）含量的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，速效磷（available P，AP）含量的測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提法，速效鉀（available K，AK）含量的測(cè)定采用乙酸銨提取法，土壤還原性物質(zhì)總量的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法，亞鐵含量的測(cè)定采用鄰菲羅啉比色法，亞錳含量的測(cè)定采用高碘酸鉀比色法。

6）土壤細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)處理。采用FastDNA SPIN Kit 試劑盒（安諾倫生物科技有限公司）對(duì)采集的土樣進(jìn)行基因組DNA提取，使用NanoDrop 2000 和1% 瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA 濃度和質(zhì)量。首先采用通用引物338F（5′-ACTCCTACGAGAGGCAGCAG-3′ ）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）［17］對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因的V3?V4 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序如下：98 ℃變性5 min；98 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用Agencourt AMPureBeads 試劑盒（貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司）純化后，使用PicoGreen dsDNA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司）進(jìn)行定量，然后在上海派森諾生物科技有限公司Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行pairend測(cè)序（2×300 bp）。測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為PRJNA1020755。

測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)使用QIIME v1.8.0 軟件［18］DADA2 方法對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、去噪、雙端拼接、嵌合體去除，獲得擴(kuò)增序列變體（ampliconsequence variants，ASVs），代表序列與SILVA v132數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源序列比對(duì)并進(jìn)行物種分類(lèi)注釋。使用Mothur 軟件［19］計(jì)算微生物α 多樣性（Chao1和Shannon 指數(shù)），并基于Bray-curtis 算法通過(guò)相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）對(duì)不同污染條件下的土壤細(xì)菌群落差異進(jìn)行檢驗(yàn)。

7）土壤氮循環(huán)功能基因qPCR 分析。采用qPCR技術(shù)測(cè)定4 個(gè)土壤氮循環(huán)功能基因（nitrogen cyclingfunctional gene，NCFG）的豐度，包括固氮酶基因（nifH）、氨單加氧酶基因（AOA?amoA）、氧化亞氮還原酶基因（nosZ）和脲酶基因（UreC）。qPCR 反應(yīng)總體積為20 μL，體系為：10 μL SYBR Green MasterMix（Bio-Rad Laboratories Inc.， USA）、上下游引物各1 μL、ddH2O 3 μL、稀釋50 倍的DNA 模板5 μL，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 保溫3 min，PCR 反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性20 s，退火20 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃保溫2 min。以10 倍梯度稀釋質(zhì)粒DNA 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用引物見(jiàn)表1。

8）水稻生理指標(biāo)測(cè)定。施用菌劑30 d 后，在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取10 株水稻苗測(cè)定水稻株高、葉齡、白根數(shù)以及植株鮮質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用IMB SPSS Statistics 27軟件，采用Duncan’s法對(duì)土壤氧化還原電位、土壤理化性質(zhì)、水稻秧苗素質(zhì)等進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用Pearson法對(duì)土壤賴(lài)氨酸芽孢桿菌豐度、6 個(gè)FeOB（Pseudo?monas、Rheinheimera、Aquaspirillum、Comamonas、Zoogloea 和Bacillus）豐度、4 個(gè)FeRB（MBNT15、An?aeromyxobacter、Geothrix 和Ignavibacterium）豐度、土壤還原性物質(zhì)含量、土壤NCFG 豐度、土壤理化性質(zhì)、水稻秧苗生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Microsoft進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 FeOB 對(duì)Fe2+氧化能力評(píng)價(jià)

在接種WH07 菌株10 d 后，在Fe（Ⅱ）-O2梯度管內(nèi)培養(yǎng)基與硫化亞鐵交界處形成明顯的紅褐色鐵氧化物細(xì)菌混合帶（圖1），且隨著濃度的增加，含有菌株WH07 的Fe（Ⅱ）-O2梯度管中的紅褐色鐵氧化物細(xì)菌混合帶越明顯，表明該菌株對(duì)硫化亞鐵有著明顯的氧化作用。

2.2 菌株鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀測(cè)。菌株WH07 菌落呈暗白色，表面光滑，邊緣不規(guī)則（圖2A），營(yíng)養(yǎng)體形態(tài)為桿狀（圖2B），長(zhǎng)3.1～5.0 μm，芽孢形態(tài)為近圓球狀，大小為0.7～1.2 μm。

2）生理生化鑒定。由表2 可見(jiàn)，菌株WH07 革蘭

氏染色、蛋白水解、淀粉酶活性、果糖利用、半乳糖利用、H2O2酶試驗(yàn)、甘露糖利用、葡萄糖利用呈陽(yáng)性反應(yīng)，V-P 試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、甲基紅測(cè)試、明膠水解呈陰性反應(yīng)。

3）16S rRNA 基因測(cè)序。菌株WH07 的16SrRNA 長(zhǎng)度為1 000 bp （GenBank 登錄號(hào)：OR536503），該序列與Lysinibacillus sphaericus R7（Genbank 登錄號(hào)：HQ259956）相似性最高（圖3），為98.90%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA 鑒定結(jié)果，將該菌株鑒定為球形賴(lài)氨酸芽孢桿菌（ Lysini?bacillus sphaericus）WH07。

2.3 菌株WH07 對(duì)潛育化水稻土改良效果

1）菌株WH07 對(duì)土壤Eh 的影響。由表3 可見(jiàn)，菌株WH07 處理10 d 后，T1、T2、T3 處理土壤Eh 值分別為-5.00、19.00 和42.67 mV，均顯著高于CK（-31.67 mV）（Plt;0.05）。處理20 d 后，土壤Eh 分別為7.33、40.67、106.67 mV，均顯著高于CK（-26.33 mV）（Plt;0.05）。處理30 d 后，Eh 分別為10.67、48.33、115.00 mV，均顯著高于CK（-16.33mV）（Plt;0.05）。

2）菌株WH07 對(duì)土壤還原性物質(zhì)的影響。在處理30 d 后，T1、T2、T3 處理土壤還原性物質(zhì)總量分別為8.64、6.87、5.50 cmol/kg（圖4），分別較CK（11.75cmol/kg）減少26.47%、41.53%、53.19%，其中T2 和T3 處理顯著減少（Plt;0.05）。土壤還原性亞鐵含量分別為5.33、4.20、2.67 cmol/kg，分別較CK（5.35cmol/kg）減少0.37%、21.50%、50.09%，其中T2 和T3 顯著減少（Plt;0.05）。土壤還原性亞錳含量分別0.47、0.40、0.32 cmol/kg，除T1 處理外，分別較CK（0.51 cmol/kg）減少7.84%、21.57%、37.25%，其中T2 和T3 顯著減少（Plt;0.05）。

3）菌株WH07 對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響。菌株WH07 處理后土壤理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。T1、T2、T3 處理AHN 分別為95.60、105.43、124.07mg/kg，均顯著高于CK（82.77 mg/kg）（ Plt;0.05），分別較CK 增加15.50%、27.38%、49.90%。AP 含量分別為8.63、9.00、9.77 mg/kg，顯著高于CK（7.67mg/kg）（Plt;0.05），較CK 增加12.52%、17.34%、27.38%。AK 含量分別為39.57、41.57、42.33mg/kg，顯著高于CK（35.47 mg/kg） （Plt;0.05），較CK 增加11.56%、17.20%、19.34%。SOM 含量分別為23.47、26.40、31.33 mg/kg，均顯著高于CK（21.60mg/kg）（Plt;0.05），較CK 增加8.66%、22.22%、45.05%。土壤pH 分別為5.78、6.09、6.54，顯著高于CK（5.59） （Plt;0.05），較CK 增加3.40%、8.94%、16.99%。

4）菌株WH07 對(duì)土壤NCFG 豐度的影響。由圖5 可見(jiàn)，菌株WH07 處理后T1、T2、T3 處理AOA ?amoA 豐度分別為4.50×107、4.61×107、5.38×107copies/g，比CK（4.02×107 copies/g）豐度增加了11.94%、14.68%和33.83%，僅T3處理增加顯著（Plt;0.05）（圖5A）。nosZ 豐度分別為1.83×107、2.25×107、2.80×107 copies/g ，較CK（1.28×107 copies/g）豐度增加了42.97%、75.78%、118.75%，除T1 處理外均顯著增加（Plt;0.05（圖5B）。nifH 豐度分別為9.86×106、10.77×106、22.54×106 copies/g，較CK（7.13×106 copies/g）豐度增加了38.29%、51.05%、216.13%，除T1 處理外，均與CK 差異顯著（Plt;0.05）（圖5C）。UreC 豐度分別為2.72×107、3.60×107、3.75×107 copies/g ，與CK（2.33×107 copies/g）比較豐度顯著增加了16.74%、54.51%、60.94%（Plt;0.05）（圖5D）。

5）菌株WH07 對(duì)水稻秧苗生長(zhǎng)的影響。由表5可見(jiàn)，施用菌劑30 d 后，T1、T2、T3 處理水稻株高分別為10.66、11.22、13.75 cm，分別較CK（10.11 cm）增加了5.44%、10.98%、36.00%，但僅T3 處理顯著增加（Plt;0.05）。葉齡分別為3.67、4.11、4.56，較CK（3.33）分別增加了10.21%、23.42%、36.94%，僅T3處理顯著增加（Plt;0.05）。水稻鮮質(zhì)量分別為2.50、2.72、2.85 g/10 plants，較CK（2.22 g/10 plants）分別增加12.61%、22.52% 和28.38%，T2 和T3 處理顯著增加（Plt;0.05）。白根數(shù)分別為9.67、11.67、12.89，較CK（8.78）分別增加了10.14%、32.92%、46.81%，T2 和T3 處理顯著增加（Plt;0.05）。

2.4 菌株WH07 對(duì)土壤微生物的影響

1）菌株WH07 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析。T1、T2、T3 與CK 處理分別獲得7 375、6 241、8 043、10 437 條擴(kuò)增子測(cè)序變體（amplicon sequence variants，ASVs）（圖6），合并為24 511 個(gè)ASVs，其中4 個(gè)處理共有的ASVs 數(shù)為679（2.77%），T1、T2、T3 與CK 處理特有的ASVs 數(shù)分別為4 765（19.44%）、3 124（12.75%）、4 039（16.48%）、7 653（31.22%）。

2）菌株WH07 對(duì)土壤細(xì)菌α 多樣性影響。T1、T2、T3 處理Chao1 指數(shù)分別為4 031.11、3 340.89、3 635.57（圖7A），均顯著低于CK（4 747.70）（Plt;0.05）。Shannon 指數(shù)分別為9.25、8.47、9.23（圖7B），均顯著低于CK（11.03）（Plt;0.05）。

3）菌株WH07 對(duì)土壤細(xì)菌β 多樣性的影響。PCoA 分析（圖8）結(jié)果顯示，第一主成分和第二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為49.2% 和12.9%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為62.1%，主成分1（PCo1）是最主要的變量，占總變異的49.2%。ANOSIM 分析結(jié)果顯示，CK 與T1（R=1，P=0.091）、T2（R=1，P=0.106）、T3（R=1，P=0.097）處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間沒(méi)有顯著差異。

4）菌株WH07 對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響。門(mén)水平相對(duì)豐度前10 的土壤細(xì)菌組成見(jiàn)圖9A，相比于CK，其中8 個(gè)門(mén)在3 個(gè)處理中均顯著下調(diào)（Plt;0.05），包括Proteobacteria、Acidobacteria 等，倍數(shù)變化（ln offold changes）范圍為-2.00～ -0.14；2 個(gè)門(mén)（Bacteroidetes和Firmicutes）在3 個(gè)處理中均顯著上調(diào)（Plt;0.05），倍數(shù)變化分別為1.29、2.90。

在屬水平相對(duì)豐度前50 的土壤細(xì)菌中，T1、T2、T3 處理分別有20、19、22 個(gè)屬豐度顯著上調(diào)（圖9B），其中3 個(gè)處理共有14 個(gè)屬豐度上調(diào)，包括6 個(gè)FeOB （Pseudomonas、Rheinheimera、Aquaspirillum、Comamonas、Zoogloea 和Bacillus），倍數(shù)變化范圍為0.59～9.57。25 個(gè)屬在3 個(gè)處理中均顯著下調(diào)（圖8C），包括4個(gè)FeRB（ MBNT15、Anaeromyxobacter、Geothrix 和Ignavibacterium），倍數(shù)變化范圍為-1.56～-1.04。

2.5 WH07 改良潛育化水稻土壤的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

菌株WH07 改良潛育化水稻土壤的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖10。菌株WH07 處理顯著增加了FeOB 豐度（rgt;0.963，Plt;0.002），但顯著降低了FeRB 豐度（rlt;-0.988，Plt;0.001）。在與FeOB 和FeRB 的協(xié)同作用下，顯著降低了土壤還原性物質(zhì)含量（Plt;0.05），同時(shí)增加了土壤nifH、nosZ 和UreC 基因豐度（Plt;0.05）與AOA-amoA 基因豐度（Pgt;0.05），最終改善了土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)了水稻生長(zhǎng)。

3 討論

土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控者，在氮、碳等物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化以及Fe2+和Mn2+的氧化還原中扮演重要角色［24］。土壤長(zhǎng)期處在淹水嫌氣條件下，土壤有毒還原性物質(zhì)累積，土溫與水溫低，土壤微生物活性降低，物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化緩慢，土壤有效養(yǎng)分供應(yīng)不足，導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)遲緩和產(chǎn)量減少［1］。因此，有效減少土壤有毒還原性物質(zhì)含量和提高土壤生物活性是潛育化土壤改良的關(guān)鍵。本研究通過(guò)Fe（Ⅱ）-O2 梯度管試驗(yàn)證明賴(lài)氨酸芽孢桿菌WH07 對(duì)亞鐵離子具有較好的氧化能力，可形成明顯的氧化帶。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株WH07 處理潛育化土壤10 d 后，土壤Eh 顯著提高且該菌株有效作用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20 d（表3）；同時(shí)，菌液濃度越大，土壤Eh上升幅度越大。在土壤Eh 提升的同時(shí)，土壤還原性物質(zhì)總量、亞鐵與亞錳離子含量顯著降低（圖4），表明土壤Eh 值與土壤中還原物質(zhì)密切相關(guān)，且受到土壤FeOB、FeRB 等微生物的調(diào)控［25］。菌株WH07 的加入導(dǎo)致土壤pH 顯著增加，當(dāng)土壤pH 升至6.0 以上時(shí)，土壤還原性物質(zhì)顯著降低，F(xiàn)e2+被大量氧化成Fe3+。據(jù)報(bào)道賴(lài)氨酸芽孢桿菌可通過(guò)結(jié)合銨態(tài)氮和硝酸鹽來(lái)調(diào)節(jié)pH［26］，而不同pH 值對(duì)不同類(lèi)型土壤的Fe2+氧化還原過(guò)程有著不同的影響，pH 的升高有利于土壤還原性物質(zhì)的氧化［27］。WH07 處理增加了土壤中AOA-amoA、nosZ、UreC、nifH 基因豐度，其中nosZ 是反硝化作用過(guò)程相關(guān)功能基因，而反硝化過(guò)程與Fe2+氧化之間存在偶聯(lián)關(guān)系［28］，另外nifH 的固氮作用與UreC 脲酶對(duì)有機(jī)氮的降解作用可能是導(dǎo)致AHN 增加從而促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的主要原因。

除菌株WH07 自身對(duì)土壤還原性物質(zhì)具有較好氧化能力之外，菌株WH07 處理還可通過(guò)減少土壤還原性物質(zhì)含量，導(dǎo)致土壤細(xì)菌微生物群落組成與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、土壤微生物多樣性降低，增加土壤FeOB 豐度、降低FeRB 豐度、協(xié)同改善潛育化土壤環(huán)境。Proteobacteria 是土壤細(xì)菌在門(mén)分類(lèi)水平上豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌，大多數(shù)FeOB 屬于該分類(lèi)單元［24］，包括α 門(mén)、β 門(mén)、γ 門(mén)、δ 門(mén)和ζ 門(mén)。在屬水平上，Pseudo?monas 是優(yōu)勢(shì)菌屬之一，該菌具有較高的Mn2+耐受能力與Mn2+ 氧化能力［29］，本研究結(jié)果表明菌株WH07 與土壤還原性物質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)，另外Pseu?domonas 還是一種反硝化細(xì)菌（nosZ），能將硝態(tài)氮還原為N2O［30］，在促進(jìn)土壤氮循環(huán)的同時(shí)，也潛在地促進(jìn)了Fe2+ 的氧化。Rheinheimera、Zoogloea、Bacil?lus、Comamonas、Lysinibacillus、Aquaspirillum 豐度也顯著增加，其中Rheinheimera、Comamonas、Aquaspirillum 被報(bào)道是一種FeOB［31-33］，可在厭氧條件下利用Fe2+ 生成Fe3+ 化合物，Lysinibacillus、Zoogloea、Bacillus 被報(bào)道具有錳氧化能力［34-36］，可將亞錳離子轉(zhuǎn)化為錳離子，且Lysinibacillus 與土壤還原性物質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這可推測(cè)Lysinibacillus潛在地參與還原性物質(zhì)的氧化，菌株WH07 處理富集了大量FeOB，從而降低了土壤還原性物質(zhì)含量。另外Thiobacillus 也是一種氧化菌，具有將Fe2+氧化生成Fe3+的能力［37］，同時(shí)與Thioalkalispira 屬于硫氧化細(xì)菌［38-39］，本研究發(fā)現(xiàn)，WH07 處理后，Thioba?cillus 與Thioalkalispira 豐度顯著減少，可能是WH07與Thiobacillus、Thioalkalispira 存在著代謝競(jìng)爭(zhēng)，抑制了Thiobacillus 與Thioalkalispira 的增殖。MBNT15、Geothrix、Ignavibacterium、Anaeromyxo?bacter 被報(bào)道具有鐵還原能力［40-43］，能將Fe3+還原為Fe2+，本研究發(fā)現(xiàn)它們的豐度與土壤還原性物質(zhì)含量呈正相關(guān)，且在處理組中其豐度顯著降低，說(shuō)明WH07 處理能顯著抑制FeRB 的增殖，減少Fe2+的累積。因此，菌株WH07 的應(yīng)用改變了土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能，增加了FeOB 豐度但減少了FeRB 的豐度，導(dǎo)致土壤中還原性物質(zhì)減少，并改善了土壤理化性質(zhì)，從而促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)。

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（責(zé)任編輯：張志鈺）