綜合肥料管理對水稻根際微生物群落功能的影響

摘要 為考察綜合肥料管理（integrated fertilization management，IFM）策略和農(nóng)民常規(guī)處理（farmer’s practice，F(xiàn)P）對微生物群落和土壤功能的影響差異，本研究利用2013-2014 年設(shè)立的雙季稻田間試驗包括綜合肥料管理（IFM）和農(nóng)民實踐（FP）2 種處理，通過在晚稻生長季節(jié)的3 個時間點采集根際和非根際土壤，調(diào)查土壤化學(xué)性質(zhì)和酶活性，使用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFA）鑒定微生物生物量和群落組成。結(jié)果顯示：與FP 處理相比，IFM 處理降低了根際土壤的革蘭氏陽性（Gram-positive bacteria，GP）和陰性細菌（Gram-negativebacteria，GN）的比值（GP/GN）和微生物脅迫指數(shù)。IFM 處理促進了幼穗分化期和齊穗期根際土壤中蔗糖酶、酸性磷酸酶、芳基硫酸酯酶活性，抑制了成熟期脲酶活性。冗余分析表明，有效氮和總氮可分別解釋微生物群落和酶活性變異的15.9% 和12.5%，這表明氮的有效性和氮水平分別是影響稻田環(huán)境微生物群落和酶功能的關(guān)鍵因素。此外，革蘭氏陰性細菌、真菌和叢枝菌根真菌對土壤酶活性改變的解釋率分別達到5.39%、3.88% 和3.09%。微生物脅迫指數(shù)與磷酸酶和蔗糖酶活性呈負相關(guān)，這表明細菌和真菌都參與土壤酶功能調(diào)節(jié)。研究表明，IFM 主要通過調(diào)控稻田氮投入節(jié)奏改變微生物群落組成從而提升成熟期前的土壤酶活性，促進水稻生長過程中的養(yǎng)分循環(huán)。

關(guān)鍵詞 綜合肥料管理； 微生物群落； 微生物脅迫指數(shù)； 酶活性； 水稻土

中圖分類號 S511.42；S154.36 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0159-10

作物管理與施肥策略在提升作物生產(chǎn)力及優(yōu)化稻田生態(tài)系統(tǒng)功能中起舉足輕重的作用［1］。這些人為因素會改變土壤性質(zhì)，并引發(fā)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化［2］。鑒于微生物群落在調(diào)控土壤功能中的核心地位，理解其如何響應(yīng)環(huán)境變化顯得尤為重要。研究表明，微生物在適應(yīng)環(huán)境變遷時展現(xiàn)出多樣的策略，包括高產(chǎn)（Y）、資源獲取（A）以及脅迫耐受（S）［3］。例如當(dāng)土壤中營養(yǎng)過剩時，部分微生物通過快速生長來充分利用資源；而另一部分則通過分泌胞外酶來分解復(fù)雜底物，從而獲取必要的養(yǎng)分。微生物胞外酶不僅在微生物資源獲取發(fā)揮作用還能為植物提供養(yǎng)分。在面臨環(huán)境壓力時，一些微生物還能夠合成特定的脂質(zhì)，以增強細胞膜的穩(wěn)定性與完整性［4］。然而，作物管理與施肥策略如何影響與Y-A-S策略相關(guān)的微生物群落特征，目前相關(guān)研究較少。

無機肥料管理作為提升水稻產(chǎn)量的主要策略，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。長期施用化肥會引發(fā)細菌群落的顯著變化，進而提升光合作用、氮循環(huán)和硫呼吸的功能潛力［5］。然而，不恰當(dāng)?shù)臒o機肥料使用也可能對土壤健康產(chǎn)生負面影響。長期施用礦物肥料會改變腐殖酸的結(jié)構(gòu)，削弱其抑制植物病原真菌的能力，從而給水稻土帶來潛在的生態(tài)風(fēng)險［6］。此外，過量施氮會降低固氮菌的多樣性，因此，抑制了土壤本身的固氮作用［7］。因此，合理的施肥策略對于維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和促進水稻土健康發(fā)展至關(guān)重要。與常規(guī)施肥處理（施用273 kg/hm2氮、59 kg/hm2磷和112 kg/hm2g 鉀）相比，長期（10 a）采用240kg/hm2 氮、52 kg/hm2g 磷和198 kg/hm2 鉀的淺間歇灌溉施肥，能夠顯著減少氮損失，提高土壤氮素利用率和水稻產(chǎn)量，促進放線菌、藍細菌、疣微菌、毛霉的增殖［8］。事實上，長期且平衡的施肥方案可以在不顯著改變微生物多樣性的前提下，有效改善紅壤性水稻土的養(yǎng)分狀況，進而提升水稻產(chǎn)量［9］。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，根際對土壤微生物的選擇性過程降低了微生物多樣性［10］。全球范圍內(nèi)的植物根際細菌群落分析顯示，富營養(yǎng)菌的富集顯著增強了有機化合物轉(zhuǎn)化、固氮和反硝化等功能，但削弱了硝化作用，而裸土中的微生物群落則呈現(xiàn)出更高的寡營養(yǎng)型特征，這些微生物能夠消耗頑固碳源并產(chǎn)生更多的孢子［11］。這些結(jié)果表明，富營養(yǎng)生物的增加可能有助于活化與植物生長關(guān)系密切的養(yǎng)分循環(huán)過程。

近年來，為提高江漢平原的生產(chǎn)力，農(nóng)民開始將新技術(shù)與以往的常規(guī)處理（farmer’s practice，F(xiàn)P）相結(jié)合，形成了一種新的管理模式：綜合肥料管理（integratedfertilization management，IFM）或稱最佳管理實踐。目前尚不清楚IFM 是否能夠更有效地維護微生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能。IFM 與FP 的主要差異在于前者施用了更高水平的氮、磷和鉀肥，且其施用節(jié)奏更貼合水稻的生長需求；此外，IFM 還采用了更大的種植密度。IFM 通過增加穗數(shù)、提高輻射利用效率和總氮吸收量，增強了養(yǎng)分的可利用性并刺激了水稻生產(chǎn)［12］。因此，本研究假設(shè)IFM 可能通過改變根際微生物群落特征來激活某些土壤功能，如增強土壤酶活性以提高養(yǎng)分可用性，改變微生物群落組成（由磷脂脂肪酸分析指示）或資源獲取能力的提升（土壤酶活性可能反映微生物對資源獲取的需求）。為驗證這一假設(shè)，本研究對FP 和IFM 處理下的微生物群落結(jié)構(gòu)、脅迫指數(shù)以及4 種關(guān)鍵的土壤酶活性進行比較分析，旨在全面評估IFM 對微生物生態(tài)的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 場地描述與土壤取樣

本田間試驗選址于湖北省武穴縣大金鎮(zhèn)，氣候類型屬亞熱帶季風(fēng)氣候。2013 年至2014 年間，此地實施了雙季稻種植制度。試驗設(shè)計采用隨機區(qū)組布局，包括綜合肥料管理（IFM）和傳統(tǒng)農(nóng)民習(xí)慣（FP）2種處理，其中，F(xiàn)P 處理作為本研究的對照組。每個處理均設(shè)有3 個重復(fù)，確保結(jié)果的可靠性。每個重復(fù)的地塊大小為13 m×9.5 m，總面積為123.5 m2。

在FP 處理中，整個水稻生長周期（一年兩季）內(nèi)，總施肥量為氮195.0 kg/hm2、磷40.0 kg/hm2和鉀75 kg/hm2。其中，磷肥、鉀肥、鋅肥（ZnSO?·7H2O）以及65% 的氮肥作為基肥一次性施入，剩余的35%氮肥則在分蘗期分階段施入田間。FP 處理的種植密度為基本苗29.4 cm/株。對于IFM 處理，早稻階段，每個重復(fù)地塊施用的氮肥總量為245 kg/hm2、磷肥為75 kg/hm2、鉀肥為180 kg/hm2。晚稻階段則調(diào)整為氮肥260.0 kg/hm2、磷肥50.0 kg/hm2、鉀肥205.0kg/hm2。磷肥和鋅肥作為基肥施入，與免耕處理保持一致。晚稻的氮肥施用策略為：50% 作為基肥，30% 在分蘗中期施入，剩余的20% 則在幼穗分化期施入。鉀肥的施用節(jié)奏與氮肥保持一致。IFM 處理的種植密度為基本苗24.1 cm/株。

在2014 年晚稻生長期間，于穗分化、齊穗期和成熟期，采集0～20 cm 的土壤樣品。在每個處理的地塊中，圍繞作物均勻收集5 個土壤芯樣，并將這些芯樣混合成1 個復(fù)合樣本，以代表該地塊的土壤［4］。將每個土壤樣品分成3 份，第1 份樣本經(jīng)過冷凍干燥處理后，儲存在?80 ℃的低溫環(huán)境中，用于進行磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFA）分析。第2 份樣本則儲存在4 ℃，并立即進行酶活性分析。最后一份樣本風(fēng)干后，通過2 mm 的篩，用于測試土壤性質(zhì)。所有數(shù)據(jù)采集均在2014-2015 年完成。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)和酶活性的測量

土壤濕度（moisture，MOI）通過傳統(tǒng)的干燥法進行測量，其pH 值在土/水比為1∶5（m/V）時測定。其他土壤特性，諸如土壤總碳（total C，TC）、土壤總氮（total N，TN）、有效氮（available N，AN）、銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）、總磷（total P，TP）、有效磷（available P，AP）、總鉀（total K，TK）和有效鉀（available K，AK）的測定方法，均參照文獻［13］進行。

蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性均采用分光光度法（北京東訊天地儀器有限公司）進行測定。蔗糖酶在8% 的蔗糖磷酸緩沖液體系中37 ℃反應(yīng)24 h 于508 nm 波長測定；脲酶在10% 的尿素磷酸-檸檬酸緩沖液（pH 6.7）體系中38 ℃反應(yīng)3 h于578 nm 波長下測定；酸性磷酸酶在5 mL 0.5% 苯基磷酸二鈉硼酸緩沖液（pH 5.0）中37 ℃反應(yīng)12 h 于570 nm 波長測定；芳基硫酸酯酶在含0.005 mol/L 硝基苯酚硫酸鉀的0.5 mol/L 乙酸緩沖液中37 ℃反應(yīng)1 h，并于400 nm 波長測定［14］。

1.3 PLFA分析

采用單相氯仿-甲醇-水（體積比為1∶2∶0.8）體系提取凍干土壤樣品中的磷脂。隨后，磷脂經(jīng)水解和甲醇化處理后，利用安捷倫6850 系列毛細管氣相色譜儀（Agilent Technologies，Wilmington，DE）對所得脂肪酸甲酯進行鑒定和定量。采用MIDI 軟件，以19：0 作為內(nèi)標(biāo)進行PLFA 的鑒定和定量。PLFA 分組后被用作特定微生物群體的生物標(biāo)志物［15］，包括真菌（Fun，以18：2ω6c 和18：3ω6c 為代表）、叢枝菌根真菌（AMF，以16：1ω5c 為特征）、厭氧細菌（Ana，包括15：0-3OH、16：0-OH 和18：0-OH）、放線菌（Act，以10-甲基脂肪酸為標(biāo)記）［16］、真核生物（Euk，以20：4ω6c 和20：4ω9c 為指示）、革蘭氏陽性細菌（GP，特征為異和反異飽和支鏈脂肪酸）以及革蘭氏陰性細菌（GN，包括cy17：0、cy19：0 和單不飽和脂肪酸）［16］。細菌應(yīng)激指數(shù)通過cy17：0/16：1ω7c、cy19：0/18：1ω7c 和環(huán)丙基脂肪酸/單烯酸前體（cy17：0+cy19：0/16：1ω7c+18：1ω7c）的比率評估［17］。

1.4 統(tǒng)計分析

研究數(shù)據(jù)分析使用R 語言版本4.0.2。柱狀圖通過GraphPad Prism 9.0.0 軟件繪制。檢驗處理、生長階段和土壤類型之間的差異性，采用三因素方差分析。此外，圖中的HSD（honest significant difference）方法被用作事后檢驗。為探究土壤微生物結(jié)構(gòu)、酶活性和微生物脅迫指數(shù)之間的潛在關(guān)系，采用Spearman相關(guān)檢驗。為深入探索2 種處理之間磷脂脂肪酸的差異，運用R 語言進行STAMP（statistical analysisof metagenomic profiles）分析和冗余分析［18］，以探究群落結(jié)構(gòu)、環(huán)境因素和酶活性之間的潛在聯(lián)系。在冗余分析中，解釋變量的選擇首先基于方差膨脹系數(shù)，隨后通過Akaike 信息標(biāo)準(zhǔn)模型進行優(yōu)化。最后，為確保冗余分析結(jié)果的可靠性，采用重復(fù)1 999次的置換檢驗進行驗證。在數(shù)據(jù)處理過程中，必要時采用歸一化處理后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對土壤特性的影響

對根際、非根際土壤理化性質(zhì)的測定結(jié)果顯示，較于FP 處理，IFM 處理顯著影響總磷（F=17.315，Plt;0.001）、有效鉀（F=32.918，Plt;0.001）、總碳（F=8.393，Plt;0.01）和pH（F=3.248，Plt;0.001）。除C/N 外，其他土壤性質(zhì)均受生育期與施肥措施交互作用影響。此外，非根際土壤的有效鉀明顯高于根際土壤（表1）。

2.2 對微生物群落結(jié)構(gòu)和脅迫指數(shù)的影響

在幼穗分化期，IFM 處理顯著提升了微生物生物量。但在齊穗期和成熟期，IFM 處理則導(dǎo)致總磷脂脂肪酸（tPLFA）下降（圖1A）。革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之比（GP/GN）在齊穗期呈現(xiàn)上升趨勢，而在成熟期則有所下降（圖1B）。IFM 處理導(dǎo)致根際土壤的GP/GN 比例降低，幼穗分化期真菌與細菌比率（F/B）增加、放線菌與細菌比率（Act/B）下降，成熟期F/B 增加（圖1C，圖1D）。STAMP 分析結(jié)果顯示，IFM 處理組的土壤中革蘭氏陰性菌指標(biāo)（17：1ω8c）和厭氧菌指標(biāo)（2OH 16：0）的水平較高。相反，F(xiàn)P 處理組中可作為放線菌指標(biāo)的10Me 18：0 和真菌指標(biāo)的18：3ω6c 更為豐富（圖2）。此外，根際土壤中的細菌應(yīng)激指數(shù)在FP 處理下高于IFM 處理。冗余分析顯示（圖3），環(huán)境變量解釋了62.53% 的微生物組成。其中，AN 和MOI 對微生物群落變異的貢獻最大，分別為15.91% 和10.57%；pH、總鉀和有效磷也對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響（圖4）。

2.3 酶活性及其驅(qū)動因素

蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性被用于評估與大量養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的土壤微生物功能。結(jié)果顯示，隨著生長階段改變，這4 種酶的活性出現(xiàn)顯著變化（圖5）。例如，在幼穗分化期，IFM 處理提高了蔗糖酶的活性，還使得根際酸性磷酸酶活性略有上升（圖5A）。蔗糖酶活性在齊穗期下降，在成熟期上升（圖5B）。幼穗分化期在非根際土壤中的脲酶，其活性明顯高于根際土壤中的。齊穗期在非根際土壤中的脲酶活性在IFM 處理下降低（圖5C）。而在幼穗分化期，芳基硫酸酯酶的活性較低（圖5D）。

冗余分析顯示，前2 個軸共同解釋了由土壤性質(zhì)引起的土壤酶活性變化的86.65%（圖4B）。土壤理化性質(zhì)中的TN、AN、AK、pH 和TP 顯著解釋了土壤酶活性的變化，解釋率分別為12.15%、5.95%、5.17%、5.00% 和4.14%。此外革蘭氏陰性細菌、真菌和叢枝菌根真菌對土壤酶活性改變的解釋率分別為5.39%、3.88% 和3.09%。這表明革蘭氏陰性細菌和真菌在調(diào)節(jié)土壤酶功能方面起重要作用。相關(guān)分析進一步支持了微生物群落與土壤酶活性之間的關(guān)系。Pho 與革蘭氏陰性細菌（Plt;0.01）和真菌（Plt;0.01）呈正相關(guān)，而與革蘭氏陽性細菌呈負相關(guān)（Plt;0.001）。蔗糖酶呈現(xiàn)出類似的趨勢。此外，芳基硫酸酯酶與放線菌、叢枝菌根真菌和真菌呈正相關(guān)，而與革蘭氏陰性細菌和厭氧細菌呈負相關(guān)。脅迫指數(shù)與磷酸酶和蔗糖酶活性呈負相關(guān)（圖6）。

3 討論

化肥的施用為土壤微生物提供了直接養(yǎng)分來源。除養(yǎng)分供應(yīng)，不同的管理過程也許也對養(yǎng)分化學(xué)計量和土壤微生物群落的時間變化產(chǎn)生影響［19］。在穗分化期，IFM 處理的根際土壤中，總PLFA 含量高于FP 處理。這表明IFM 在水稻生育期早期采用的高劑量施肥促進了微生物生長，然而這一趨勢在齊穗期和成熟期出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)（圖1A），這暗示IFM 處理可能促進植物生長［12］而強化了植物對養(yǎng)分的吸收從而抑制了微生物生物量的增加。

根據(jù)先前的研究，革蘭氏陰性細菌對有效碳的響應(yīng)更為敏銳，而真菌、放線菌以及革蘭氏陽性細菌可分解一些難降解的底物［20］。值得注意的是，GP/GN 的上升與生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的降低有著密切的關(guān)聯(lián)［21］。研究發(fā)現(xiàn)，IFM 處理降低了根際土壤中GP/GN 值（圖1B）。此外，高施肥量和多次施肥可能促進根際沉積，從而吸引更多的富營養(yǎng)生物。研究表明，真菌與細菌的比率（F/B）與土壤的碳儲存潛力緊密相關(guān)［22］，并且真菌群落對化肥的響應(yīng)尤為敏感［23］。本研究中，F(xiàn)/B 在成熟期達到峰值，且IFM 處理進一步提高了這一比率（圖1C）。這一發(fā)現(xiàn)暗示，在IFM 處理下，水稻成熟時，植物地下部生物量或殘體的積累可能會有利于真菌的繁殖。冗余分析結(jié)果表明，有效氮、含水率、pH、總鉀、有效磷是影響微生物群落的主要因素，其中有效氮對群落變異的解釋度最高。氮在調(diào)節(jié)水稻養(yǎng)分、根系生長和微生物群落中的作用至關(guān)重要［24］。此外，有效磷也是被認為影響稻田微生物群落的關(guān)鍵因素之一［25-26］。

一般認為，有環(huán)脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率可用于評估微生物群落的生理營養(yǎng)壓力［27］。對于細菌來說，cy19：0/18：1ω7 的比率可以指示來自高溫或低氧和酸性的環(huán)境壓力［28］。此外，（cy19：0+cy17：0）/（16：1ω7c+18：1ω7c）是細菌群落營養(yǎng)脅迫的指標(biāo)［17］，但微生物群落組成變化也可能引起壓力指數(shù)的變化［27］。 研究發(fā)現(xiàn)，在根際土壤中，與FP 處理相比，IFM 處理降低了cy19：0/18：1ω7c 和（cy19：0+cy17：0）/（16：1ω7c+18：1ω7c）（圖3），意味著IFM 處理可能會減少對微生物的外部壓力，或影響產(chǎn)生相應(yīng)脂肪酸的微生物數(shù)量。

IFM 引起的土壤性質(zhì)TN、AN、AK、pH 和TP 的變化顯著地解釋了土壤酶活性的變化。除了化學(xué)性質(zhì)之外，革蘭氏陰性細菌、真菌和叢枝菌根真菌解釋了蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的大部分變化（圖4C），表明革蘭氏陰性細菌和真菌在調(diào)節(jié)土壤酶活性方面發(fā)揮了很大作用。在未施氮的稻田中發(fā)現(xiàn)影響相同酶類的關(guān)鍵因素是放線菌和革蘭氏陽性細菌［29］。一般認為，在水稻土中，細菌群落比真菌在調(diào)節(jié)土壤酶功能方面更為重要［14］。長期施肥條件下，稻田生態(tài)酶化學(xué)計量與微生物群落結(jié)構(gòu)高度相關(guān)［30］。本研究中，革蘭氏陽性細菌的比例與蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性呈負相關(guān)，相反，革蘭氏陰性細菌與這些酶呈正相關(guān)，這些結(jié)果表明在本研究中革蘭氏陰性細菌可能表達更多的蔗糖酶、酸性磷酸酶。芳基硫酸酯酶活性與放線菌和真菌PLFA 顯著相關(guān)。這一結(jié)果不同于在油菜-水稻輪作系統(tǒng)中所報道的磷酸酶和硫酸酯酶與土壤粒徑組分中革蘭氏陽性細菌的相關(guān)性更強［31］。

考慮到PLFA 譜可以指示外部壓力或產(chǎn)生特定脂肪酸的微生物，而生產(chǎn)酶和表達基因以承受環(huán)境壓力都需要能量成本［4］，因此微生物脅迫指數(shù)和群落水平功能之間可能存在相關(guān)性。較高的脅迫水平可能會削弱生態(tài)系統(tǒng)功能，例如微生物產(chǎn)酶的能力［32］。研究發(fā)現(xiàn)，微生物脅迫指數(shù)與酸性磷酸酶和蔗糖酶呈負相關(guān)。這暗示，酸性磷酸酶和蔗糖酶可能比脲酶和芳基硫酸酯酶更容易受到環(huán)境脅迫的負面影響。還有一種合理的推測是，產(chǎn)生相關(guān)脂肪酸的微生物可能存在產(chǎn)生或不產(chǎn)生相關(guān)酶的偏好。

IFM 和FP 處理之間的主要區(qū)別在于種植密度、總磷投入、氮水平和施肥節(jié)奏。適當(dāng)?shù)牡剌斎肟梢跃徑馔寥赖牡叵拗?，降低氮素降解酶的活性?3］。這一假設(shè)與IFM 處理中脲酶活性下降具有一致性。均衡施肥可以提高水稻土的微生物功能［34］。本研究發(fā)現(xiàn)不同（IFM 與FP）處理下，微生物群落與養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的酶功能表達存在差異，這是因為IFM 處理下，在穗分化期和抽穗期可能招募了特定的微生物從而在根際產(chǎn)生更多的酶（脲酶除外）。然而，IFM對水稻土微生物群落和功能的長期影響仍有待探索。

綜上所述，IFM 可以在穗分化階段增加微生物PLFA，但在分化后期降低微生物數(shù)量，這可能有利于植株生長初期的生長，減少生長過程中微生物與植株之間的營養(yǎng)競爭；通過降低根際土壤的GP/GN比率影響微生物群落；降低微生物脅迫指數(shù)，調(diào)節(jié)植物不同發(fā)育階段蔗糖酶、酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性，從而將微生物群落總體特征從脅迫耐受型轉(zhuǎn)為資源獲取型，進而產(chǎn)生有利于養(yǎng)分循環(huán)、促進植物生長的微生物區(qū)系。然而，IFM 需要更多的成本和勞動力投入。未來的施肥研究還應(yīng)考慮納入節(jié)省勞動力成本、更加精準(zhǔn)高效地實現(xiàn)養(yǎng)分管理。

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（責(zé)任編輯：陸文昌）