類枯草桿菌蛋白酶基因GmSBT1在大豆共生固氮中的功能

摘要 為研究SBT（subtilases）家族蛋白在豆科植物共生固氮中的作用機(jī)制，分別利用生物信息學(xué)分析、時(shí)空表達(dá)定位、GUS 染色定位和基因沉默等方法來(lái)研究GmSBT1 在大豆-根瘤菌共生中的作用。結(jié)果顯示：GmSBT1 受根瘤菌特異性誘導(dǎo)，在成熟根瘤中高量表達(dá)，且在根瘤皮層以及含菌細(xì)胞中發(fā)揮功能。GmSBT1-RNAi 植株地上鮮質(zhì)量、瘤質(zhì)量、固氮酶活顯著降低。結(jié)果表明 ，GmSBT1 蛋白對(duì)根瘤的形成和發(fā)育以及根瘤的固氮具有重要的作用。

關(guān)鍵詞 蛋白酶； 類枯草桿菌蛋白酶； 根瘤菌； 共生固氮； 大豆

中圖分類號(hào) S154.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）04-0133-07

根瘤菌能與豆科植物建立共生關(guān)系，將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨和氨基酸，以供植物生長(zhǎng)，既節(jié)省成本又能提高大豆產(chǎn)量［1］。研究根瘤菌與豆科植物的共生機(jī)制，有效利用豆科植物與根瘤菌共生固氮，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。

類枯草桿菌蛋白酶（subtilases，SBT）是一類絲氨酸蛋白酶，具有特殊排列的催化三聯(lián)體天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸殘基以及夾在2 層 α-螺旋之間高度扭曲的七鏈β-折疊組成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，廣泛存在各種植物中。SBT 蛋白具有廣泛的生理學(xué)功能，包括從非特異性的降解蛋白功能到特異性的參與多肽類激素的形成；同時(shí)它也參與降解前體蛋白（proprotein），形成有活性的成熟蛋白。在植物中，SBT 基因家族是一類大家族，在植物生命周期的漫長(zhǎng)階段，從種子萌發(fā)［2］、生長(zhǎng)［3］、發(fā)育［4］到植物對(duì)環(huán)境變化的許多逆境反應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制，SBT 家族成員都參與其中。

研究表明，植物SBT 蛋白也在植物-病原微生物的互作中發(fā)揮著重要功能。例如，番茄半胱氨酸蛋白酶Rcr3 參與抗性蛋白 Cf-2 對(duì)植物病原真菌（Cladosporium fulvum）分泌的效應(yīng)因子Avr2 的識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)植物的超敏反應(yīng)（HR）。Rcr3 蛋白前體proRcr3 可由番茄質(zhì)外體類枯草桿菌蛋白酶P69B 加工激活，從而導(dǎo)致植物中免疫蛋白酶的激活［2，5］。百脈根中SBT 家族SbtM1 基因在含有叢枝的細(xì)胞中大量表達(dá)，該基因的沉默能抑制叢枝菌根真菌共生結(jié)構(gòu)的發(fā)育［6］。在大豆與根瘤菌的共生過(guò)程中，豆科植物感知根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子后，根皮層細(xì)胞內(nèi)陷形成預(yù)侵染線引導(dǎo)根瘤菌向新的皮層細(xì)胞進(jìn)發(fā)［7］，隨后根瘤菌被釋放至皮層細(xì)胞中分化為類菌體，植物細(xì)胞周膜將類菌體包裹形成共生體，產(chǎn)生豆血紅蛋白開(kāi)始共生固氮［8］。在這一共生過(guò)程中，SBT 蛋白是否參與尚無(wú)定論。

前期在大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)1 個(gè)受根瘤菌特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因 Glyma05g03760，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)此基因表達(dá)蛋白為 SBT 家族成員，命名為 GmSBT1。本研究以GmSBT1 為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)、時(shí)空表達(dá)、組織表達(dá)定位和基因沉默等方法來(lái)研究GmSBT1 蛋白在大豆與大豆根瘤菌共生中的功能， 以期為深入研究SBT 家族蛋白在豆科植物共生固氮中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株、載體和主要試劑

大豆（Glycine max）種子William 82，由河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王學(xué)路教授提供；本氏煙草（Nicotianabenthamiana）種子由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的大豆慢生型根瘤Bradyrhizo?bium japonicum USDA110、大腸桿菌E. coli DH5α、農(nóng)桿菌GV1301 和農(nóng)桿菌K599。質(zhì)粒載體有TA 克隆載體pMD19-T、RNAi 干擾載體pG2RNAi2、亞細(xì)胞定位載體pUB-GFP-mcherry 和啟動(dòng)子組織表達(dá)定位載體1391Z-GUS。

RNA 抽提試劑 Trizol reagent 購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶均為Fermentas 公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶、Ex TaqDNA聚合酶、dNTPs 購(gòu)自東勝科技公司；核酸電泳Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司；氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素均為Duchefa 公司產(chǎn)品。引物（表1）合成和 DNA 測(cè)序均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 GmSBT1 基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，獲得 GmSBT1 基因的基因組、CDS（sequence coding for amino acids）和蛋白質(zhì)序列及大豆 SBT 在擬南芥和百脈根中同源蛋白序列，使用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化分析樹(shù)。通過(guò)NCBI 進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.3 GmSBT1 在Williams 82 大豆中的時(shí)空表達(dá)特征檢測(cè)

大豆盆栽試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。分別在接種大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110后 8、14、21 和28 d，收取大豆根樣和根瘤樣品，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。

1.4 GmSBT1 的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)

將去除終止密碼子的GmSBT1 編碼區(qū)插入亞細(xì)胞定位載體 pUB-GFP-mcherry 的 GFP 序列的N端。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)正確后，將載體轉(zhuǎn)化到本氏煙草中，煙草盆栽及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。培養(yǎng)2～3 d 后使用激光共聚焦顯微鏡觀察GmSBT1 的亞細(xì)胞定位。

1.5 GmSBT1 的啟動(dòng)子共生表達(dá)定位

將GmSBT1 起始密碼子上游 2 340 bp DNA 序列插入啟動(dòng)子定位載體 1391Z-GUS 的 GUS 序列的 N 端。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)正確后，將載體轉(zhuǎn)化到大豆根中。接種大豆慢生根瘤菌B. japonicum USDA110，分別在接種后9、14、21 和28 d 收取根瘤與根樣，用 GUS 染液染色，在顯微鏡下觀察 GmSBT1 表達(dá)情況。大豆毛根轉(zhuǎn)化和GUS 染色參照文獻(xiàn)［12］和［13］進(jìn)行。因所轉(zhuǎn)化載體帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽，可直接在熒光下檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性根。

1.6 GmSBT1 基因干擾表達(dá)盆栽試驗(yàn)

克隆 GmSBT1 3′UTR 區(qū) 226 bp 片段，分別正向、反向插入 pG2RNAi2 載體中構(gòu)建干擾表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)正確后，將載體轉(zhuǎn)化到大豆根中。接種B. japonicum USDA110 28 d 后，收取植物統(tǒng)計(jì)共生固氮表型，檢測(cè)固氮酶活［9］。大豆毛根轉(zhuǎn)化方法同本文“1.5”。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmSBT1 基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)在NCBI 和phytozom 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索GmS?BT1 基因的序列，發(fā)現(xiàn)GmSBT1 基因無(wú)內(nèi)含子，全長(zhǎng)2 680 bp， 編碼 771 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為8.28 ku，PI 值為 6.48。通過(guò) NCBI 網(wǎng)站對(duì)GmSBT1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行域分析，顯示該蛋白含有S8 肽酶結(jié)構(gòu)域，其特征是催化三聯(lián)體的天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸殘基特殊的排列；PA（protease-associated）結(jié)構(gòu)域可能參與底物結(jié)合和（或）促進(jìn)構(gòu)象變化，從而影響位點(diǎn)對(duì)底物的穩(wěn)定性和可及性；AprE 結(jié)構(gòu)域則起到翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)以及類似分子伴侶的作用。蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示GmSBT1 可能作為某個(gè)前體蛋白的加工劑，通過(guò)PA 結(jié)構(gòu)域與底物進(jìn)行結(jié)合，并對(duì)其進(jìn)行修飾。

將GmSBT1 基因與大豆、擬南芥、百脈根中部分SBT 蛋白基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1），結(jié)果顯示，大豆SBT 家族76 個(gè)成員可分為6 個(gè)亞家族。GmSBT1屬于亞家族Ⅴ成員，與大豆Glyma17g133500.1 同源性最高，與百脈根中菌根誘導(dǎo)基因LjSbtM1 處于同一個(gè)亞家族中（圖1）。

2.2 GmSBT1 在大豆Williams 82 中的時(shí)空表達(dá)特征

慢生根瘤菌B. japonicum USDA110 接種大豆Williams 82 后，對(duì)不同時(shí)間根及根瘤樣品進(jìn)行GmS?BT1 基因表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果顯示，GmSBT1 在不接根瘤菌的根中不表達(dá)，僅在接種根瘤菌后14 d 的根中有表達(dá)。GmSBT1 在根瘤發(fā)育的各個(gè)時(shí)期表達(dá)量均較高，其中在 14～21 d 相對(duì)表達(dá)量最高（圖2）。上述結(jié)果表明，GmSBT1 受根瘤菌誘導(dǎo)高量表達(dá)，可能參與根瘤的形成和發(fā)育。

2.3 GmSBT1 的亞細(xì)胞定位

將含有pUB-GmSBT1-GFP-mcherry 質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌K599 注射進(jìn)幼嫩煙草葉片中，共培養(yǎng)2～3d 后在激光共聚焦顯微鏡中觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，對(duì)照組（35S： GFP）在煙草葉片細(xì)胞中的細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)（圖 3A、B、C），而實(shí)驗(yàn)組（35S： GmSBT1-GFP） GmSBT1 定位在細(xì)胞膜上（圖 3D-F）。

無(wú)菌蛭石中接種根瘤菌B. japonicum USDA110后進(jìn)行培養(yǎng)，收取接種后9、14、21、28 d 的根瘤與根樣， GUS 染色后顯微觀察GmSBT1 的表達(dá)。結(jié)果顯示GmSBT1 在整個(gè)結(jié)瘤時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)部位、強(qiáng)度有所不同。在結(jié)瘤早期（接種后9 d）， GmSBT1在根瘤皮層中表達(dá)（圖 4A-C）；在接種后14 、21 d 發(fā)育成熟根瘤中，GmSBT1 在根瘤皮層以及固氮區(qū)的含菌細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度最高；在衰老根瘤中（接種后28 d），根瘤皮層以及固氮區(qū)的含菌細(xì)胞中GmS?BT1 的表達(dá)減弱。

2.4 GmSBT1 基因?qū)Ω霭l(fā)育的影響

為了驗(yàn)證 GmSBT1 在大豆結(jié)瘤和固氮中的功能，構(gòu)建GmSBT1-RNAi 載體，對(duì)轉(zhuǎn)化植株的結(jié)瘤固氮表型進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，接種 B. japonicum USDA110后28 d 的RNAi 植株地上部分較對(duì)照組長(zhǎng)勢(shì)差、葉片發(fā)黃、植株矮?。▓D5A），地下部分主根細(xì)小、側(cè)根稀疏，且地下部分整體上更細(xì)?。▓D5B-D）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，GmSBT1-RNAi 植株的地上鮮質(zhì)量、單株酶活、單株瘤數(shù)和平均瘤質(zhì)量均顯著低于試驗(yàn)組（圖5E-H），表明GmSBT1 在大豆根瘤的形成發(fā)育以及根瘤固氮中具有重要功能。

3 討論

SBT 蛋白是一類在植物發(fā)育和信號(hào)級(jí)聯(lián)中具有高度特異性功能的絲氨酸蛋白酶，能以細(xì)胞壁為靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的性質(zhì)和細(xì)胞外信號(hào)分子的活性來(lái)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育［14］，也能夠在微生物識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。研究表明，SBT 蛋白酶能將無(wú)活性的前體蛋白轉(zhuǎn)化為具有生物活性的蛋白肽激素或切割特定的靶點(diǎn)使其失活［15-16］，這種選擇性蛋白酶成為細(xì)胞發(fā)育以及對(duì)環(huán)境做出反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［17-19］ 。

Takeda 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，受叢枝菌根真菌特異性誘導(dǎo)的百脈根基因 SbtM1 啟動(dòng)子區(qū)定位在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而LjSbtM1 編碼區(qū)、信號(hào)肽區(qū)定位在細(xì)胞間隙以及環(huán)叢枝膜上，可能是信號(hào)肽引導(dǎo)LjSbtM1蛋白從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間隙和環(huán)叢枝膜內(nèi)，并且LjSbtM1 的沉默會(huì)抑制植物細(xì)胞內(nèi)的叢枝菌根真菌的發(fā)育，因此，推測(cè)LjSbtM1 可能裂解植物細(xì)胞壁內(nèi)和細(xì)胞壁之間的結(jié)構(gòu)蛋白，以延長(zhǎng)菌絲在細(xì)胞間隙中的長(zhǎng)度，并穿透到寄主細(xì)胞中。

本研究結(jié)果顯示，大豆GmSBT1 基因受根瘤菌特異誘導(dǎo)表達(dá)，在成熟根瘤固氮區(qū)的皮層及含菌細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示 GmSBT1 蛋白定位在細(xì)胞膜上，結(jié)合對(duì)GmSBT1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，推測(cè)GmSBT1 蛋白跟隨著底物蛋白一起從根瘤皮層細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至含菌細(xì)胞膜上發(fā)揮作用。GmS?BT1-RNAi 結(jié)果顯示根瘤的發(fā)育及固氮活性被顯著抑制，表明GmSBT1 在大豆與根瘤菌的共生固氮過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，推測(cè)與含菌共生體的形成有關(guān)，GmSBT1 通過(guò)裂解植物細(xì)胞壁蛋白，利于共生互作界面（symbiotic interface）的形成。對(duì)于GmSBT1基因在大豆與根瘤菌共生中發(fā)揮功能的分子機(jī)制和基因調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

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（責(zé)任編輯：張志鈺）