液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測中的應(yīng)用

摘 要：β-受體激動劑類藥物在畜牧業(yè)中仍存在非法使用的風(fēng)險，對消費者健康造成潛在威脅。本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）建立了一種檢測豬肉中β-受體激動劑類藥物殘留的方法。樣品經(jīng)酶解、凈化、濃縮后，采用LC-MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下進行定性定量分析。優(yōu)化后的前處理條件為甲醇-水（70∶30，v/v）作為提取溶劑，37 ℃β-葡萄糖醛酸苷酶水浴酶解12 h，固相萃取凈化。優(yōu)化后的儀器條件為采用C18色譜柱，0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫。4種β-受體激動劑在給定濃度范圍內(nèi)與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；日內(nèi)和日間相對標準偏差均小于10%，回收率為87.9%～92.5%，基質(zhì)效應(yīng)值在90.4%～109.7%。該方法滿足肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測的要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；β-受體激動劑；殘留；肉制品

Application of Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry in the Detection of β-Receptor Agonist Drug Residues in Meat Products

LI Kuaqiao1， XIAO Zhiguo2， LUO Xiaozhen1*

（1.Luoping County Inspection and Testing Institute Yunnan Province， Luoping 655800， China;"2.Qujing Inspection and Testing Research Institute， Qujing 655000， China）

Abstract： β-receptor agonist drugs still pose a risk of illegal use in animal husbandry， posing a potential threat to consumer health. We used liquid chromatography - tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） to detect β- receptor agonist drugs in pork. After enzymatic digestion， purification and concentration， the samples were subjected to qualitative and quantitative analysis using LC-MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） mode. The optimized pretreatment conditions were methanol-water （70∶30， v/v） as the extraction solvent， enzymatic hydrolysis of β-glucuronidase water bath at 37 ℃ for 12 h， and solid-phase extraction and purification. The optimized instrument conditions were gradient elution using a C18 column with 0.1% formic acid in water and acetonitrile as mobile phases. The four β-receptor agonists had a good linear relationship with the response value in the given concentration range， and the correlation coefficient was greater than 0.99， the intra-day and inter-day relative standard deviation was less than 10%， the recovery rate was 87.9% to 92.5%， and the matrix effect value was 90.4% to 109.7%. Methodological validation shows that the method meets the requirements for detecting β -receptor agonist drug residues in meat products.

Keywords： liquid chromatography - tandem mass spectrometry technology; β-receptor agonist; residue; meat products

β-受體激動劑是一類高效肉品促生長藥物，但β-受體激動劑在動物體內(nèi)很難被代謝，殘留物通過食物鏈富集，可能危害消費者健康。我國明令禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用β-受體激動劑類藥物，但養(yǎng)殖戶受到經(jīng)濟利益驅(qū)動，非法使用時有發(fā)生。開發(fā)靈敏、準確、快速的檢測方法對控制β-受體激動劑類藥物非法使用、保障肉制品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀、三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀以及配套使用的制水系統(tǒng)。液相色譜采用的色譜柱為C18反相柱。有機溶劑甲醇、乙腈等為色譜純試劑，水為新鮮制備的超純水[1]。β-受體激動劑類藥物純度均高于98%。β-葡萄糖醛酸苷酶等輔助試劑選用分析純級別。樣品前處理過程中使用聚合物基質(zhì)固相萃取小柱凈化目標物。

1.2 樣品前處理

實驗樣品選用購自市場的新鮮豬肉，去除脂肪和結(jié)締組織，攪碎均質(zhì)后置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。? g肉樣于50 mL離心管中，加入10 mL pH值為5.2的醋酸緩沖液，渦旋振蕩2 min，超聲20 min。加入β-葡萄糖醛酸苷酶，37 ℃水浴過夜，水解樣品中的藥物結(jié)合物，提高游離態(tài)藥物的提取效率。酶解后樣品經(jīng)C18固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，氮氣吹干后定容，供液相色譜-質(zhì)譜分析。

為了優(yōu)化提取條件，本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮等常用有機溶劑與水的不同比例（70∶30、50∶50，v/v）混合溶液對β-受體激動劑類藥物提取效率的影響。將處理后的肉樣分別用不同溶劑組合提取，提取液經(jīng)凈化、濃縮后，采用優(yōu)化的LC-MS/MS條件進行分析，比較不同提取溶劑組合下目標物的回收率，篩選最佳提取溶劑。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，洗脫程序如下：0 min 10% B，3 min 50% B，8 min 90% B，10 min 90% B，10.1 min 10% B，12 min 10% B。流速0.3 mL·min-1，進樣量為5 μL。質(zhì)譜采用電噴霧電離正離子模式（ESI+），噴霧電壓3 500 V，離子源溫度350 ℃，去溶劑氣流量1 000 L·h-1，霧化氣壓力35 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 母離子和子離子的選擇

通過優(yōu)化質(zhì)譜條件，選定各目標物的母離子均為[M+H]+準分子離子。母離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生多個子離子，從中挑選出豐度較高、重現(xiàn)性好、受基質(zhì)干擾小的1個定量離子和1～2個定性離子，構(gòu)建多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）通道[2]。

2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化

碰撞能量過低，母離子裂解不完全，子離子豐度偏低；碰撞能量過高，子離子過度裂解，靈敏度下降。為獲得最佳檢測靈敏度，需要優(yōu)化每個特征離子的碰撞能量。通過調(diào)整碰撞能量，考察子離子豐度變化，繪制碰撞能量-離子豐度曲線，選擇子離子響應(yīng)最強時的碰撞能量值作為最佳值。各目標物的定量離子和定性離子經(jīng)優(yōu)化后的碰撞能量見表1。

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用反相C18色譜柱，考察了流動相組成、梯度洗脫程序、柱溫等因素對分離效果的影響[3]。結(jié)果表明，以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃時，各目標物得到良好的分離。優(yōu)化后的液相色譜條件能在12 min內(nèi)完成所有待測物的分離分析，色譜峰型對稱，基線平穩(wěn)，無明顯拖尾現(xiàn)象，為準確定量提供了良好的基礎(chǔ)。

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮等常用有機溶劑和水的不同比例混合溶液對目標物提取效果的影響。由表2可知，甲醇-水（70∶30，v/v）作為提取溶劑時，各目標物的提取效率最高，重復(fù)性最好。這可能是因為甲醇-水混合溶劑的極性適中，易于溶解和釋放肉樣中的極性和非極性藥物分子，同時促進了肉樣基質(zhì)的膨脹，有利于目標物的提取。

2.2.2 酶解條件的優(yōu)化

為準確測定總殘留量，需采用β-葡萄糖醛酸苷酶水解樣品，釋放結(jié)合態(tài)藥物。本研究優(yōu)化了酶解溫度和時間。結(jié)果表明，在37 ℃條件下酶解過夜（12 h），藥物結(jié)合代謝物可完全水解為游離型，酶解效率最高。延長酶解時間至24 h，各目標物的檢測量沒有明顯增加。因此，選擇37 ℃水浴酶解12 h作為最佳酶解條件。優(yōu)化的酶解條件可有效提高β-受體激動劑類藥物的檢出率，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

2.2.3 凈化條件的優(yōu)化

采用固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）方式凈化樣品，考察了不同SPE柱、淋洗液和洗脫液的凈化效果。結(jié)果顯示，使用C18反相SPE柱，以5%甲醇水溶液淋洗，甲醇-水（90∶10，v/v）洗脫，可獲得最佳凈化效果。與HLB、SCX等其他SPE柱相比，C18柱能更有效地去除肉樣基質(zhì)中的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，同時減少目標藥物的損失。優(yōu)化的SPE凈化條件能最大限度地消除基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度和準確性。

2.3 分析方法的評價

2.3.1 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

配制一系列不同濃度（1 μg·kg-1、2 μg·kg-1、5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1）的藥物標準溶液，按建立的樣品前處理方法和儀器分析方法測定，以藥物濃度為橫坐標，響應(yīng)值（峰面積）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析[4]。結(jié)果顯示，4種β-受體激動劑在給定濃度范圍內(nèi)與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。線性范圍覆蓋了動物源性食品中β-受體激動劑最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）的數(shù)值，可滿足實際樣品檢測的需求。各藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

2.3.2 精密度與準確度

為了評價方法的精密度和準確度，進行了日內(nèi)和日間重復(fù)性試驗。精密度通過計算相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）來衡量。在3個添加水平（1 μg·kg-1、10 μg·kg-1、100 μg·kg-1）下，每個水平重復(fù)6次，連續(xù)測定3天，計算日內(nèi)和日間RSD。準確度采用加標回收率考察。

結(jié)果表明，4種β-受體激動劑日內(nèi)和日間RSD均小于10%，日內(nèi)RSD為3.5%～4.5%，日間RSD為5.9%～7.2%，表明方法精密度良好。在3個添加水平下，平均回收率為87.9%～92.5%，說明該方法準確度高。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線法評估方法的基質(zhì)效應(yīng)[5]。配制純?nèi)軇藴嗜芤汉突|(zhì)匹配標準溶液（空白基質(zhì)提取液+標準工作液），比較不同基質(zhì)中目標物的響應(yīng)值與純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值之比，即為基質(zhì)效應(yīng)值?；|(zhì)效應(yīng)在90%～110%時，表明基質(zhì)效應(yīng)小，不影響定量結(jié)果的準確性。

本方法測定的4種β-受體激動劑的基質(zhì)效應(yīng)值均在90.4%～109.7%，表明經(jīng)優(yōu)化的樣品前處理和儀器分析條件，可有效減少豬肉樣品基質(zhì)的干擾，保證分析結(jié)果的可靠性。

2.4 實際樣品檢測與分析

為了驗證建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的實際應(yīng)用效果，對市售豬肉樣品中β-受體激動劑類藥物殘留進行了檢測分析[6]。從超市、農(nóng)貿(mào)市場等不同銷售渠道采集了50個豬肉樣品，按照優(yōu)化的樣品前處理方法提取凈化后，采用建立的LC-MS/MS方法進行定性定量分析。結(jié)果如表4所示，在檢測的50個樣品中，有8個樣品檢出了β-受體激動劑類藥物殘留，檢出率為16%。其中，克侖特羅和沙丁胺醇為主要檢出藥物，殘留濃度分別在2.1～15.6 μg·kg-1和1.8～10.2 μg·kg-1。檢出樣品的殘留量均低于我國和國際上相關(guān)法規(guī)標準規(guī)定的MRL值。

實際樣品檢測結(jié)果表明，建立的方法靈敏度高、選擇性強，能有效檢測出豬肉中低水平的β-受體激動劑類藥物殘留，為豬肉質(zhì)量安全控制提供有力的分析手段。

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定豬肉中β-受體激動劑類藥物殘留的方法，對實際樣品進行檢測，證實了該方法的可行性和實用性。該方法靈敏度和選擇性高，定量準確，為肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測提供了一種可供選擇的新方法。

參考文獻

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