國內(nèi)外蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)對比分析

摘 要：蠟樣芽胞桿菌是引起食源性疾病群體事件的一種主要致病菌，其產(chǎn)生的毒素會引起嘔吐或腹瀉。本文對比分析國內(nèi)外蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)，以期為我國蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽胞桿菌；檢測；標(biāo)準(zhǔn)

Comparative Analysis of Domestic and Foreign Testing Standards for Bacillus cereus

HAN Jiangxue

（Hebei Province Pharmaceutical Professional Inspector Corps （Southern region）， Shijiazhuang 050011， China）

Abstract： Bacillus cereus is a major pathogen causing foodborne illness in mass incidents， producing toxins that can cause vomiting or diarrhoea. In this paper， the detection standards of Bacillus cereus at home and abroad were compared and analyzed， in order to provide a reference for the further development of the detection standard system of Bacillus cereus in China.

Keywords： Bacillus cereus; detection; standard

蠟樣芽胞桿菌，桿狀，兼性需氧，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性菌，其產(chǎn)生的毒素會引起嘔吐或腹瀉，該癥狀通常較輕且持續(xù)時(shí)間很短（約24 h）。蠟樣芽胞桿菌通常存在于土壤環(huán)境以及各種食物中，其芽孢能夠在包括正常烹飪溫度在內(nèi)的惡劣環(huán)境中生存。

早餐谷物食品和嬰兒谷物食品被認(rèn)為是低水分含量的食品（Low Moisture Foods，LMF），主要特點(diǎn)是水分活度（Water Activity，Aw）低，有助于延長食品的保質(zhì)期，從微生物對食品安全影響的角度來看，這類食品并不能引起人們的重視。一般而言，微生物在低水分含量的食品中較難生長，但一旦這些食品受到污染，相關(guān)微生物便可以長期存在。針對不同的微生物物種，其生長或致病的方式不同。例如，部分微生物的輕微污染（沙門氏菌）即可導(dǎo)致疾病；不穩(wěn)定的儲存溫度可導(dǎo)致微生物致病性的產(chǎn)生（蠟樣芽胞桿菌）[1]。

蠟樣芽胞桿菌可導(dǎo)致食物中毒，引起食源性疾病群體事件，主要引發(fā)兩種癥狀，即腹瀉與嘔吐。根據(jù)“支持微生物風(fēng)險(xiǎn)管理的低水分食品排名”的報(bào)告[1]，蠟樣芽胞桿菌是谷物及其制品中由于致病率、流行性和感染病例而最常被調(diào)查的致病微生物，該報(bào)告中還強(qiáng)調(diào)，蠟樣芽胞桿菌是引起美國、澳大利亞、新西蘭等不同國家和地區(qū)44次疫情（其中31次是由大米制品引起的）的主要原因，其中一次疫情涉及嬰兒谷物食品。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）的meta-analysis報(bào)告中指出，蠟樣芽胞桿菌在谷物類制品及干谷物中的平均致病率為41.7%[1]。2015年，閆韶飛等[2]對我國市售嬰配乳粉中蠟樣芽胞桿菌的污染程度及其毒力基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在135份嬰配乳粉樣本中有57份樣本檢出蠟樣芽胞桿菌，檢出率為42.22%，其平均污染值為7.14 MPN·g-1。有學(xué)者分析2011—2019年吉林省3 173份食品樣品蠟樣芽胞桿菌污染狀況，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌總檢出率為23.6%（750/3 173），其中乳與乳制品檢出率為39.3%（114/290），嬰幼兒配方食品檢出率為31.1%（185/595）[3]。

本研究通過檢索國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）、美國細(xì)菌學(xué)分析手冊（Bacteriological Analytical Manual，BAM）、我國蠟樣芽胞桿菌檢測方法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對檢測技術(shù)和要求進(jìn)行比較分析，以期為我國蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

1 國內(nèi)外蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

1.1 ISO

ISO是一個(gè)獨(dú)立的非政府國際組織，出臺了ISO 7932：2004，并且在2020年8月發(fā)布了修訂稿1——可選實(shí)驗(yàn)。該修訂稿描述了對前期分離獲得的蠟樣芽胞桿菌菌株進(jìn)行補(bǔ)充研究（即流行病學(xué)研究），檢測細(xì)胞毒素K的cytK-1或cytK-2基因變異，對能夠產(chǎn)生嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌菌群的檢測，炭疽芽孢桿菌篩查的運(yùn)動測試，并提出了蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)結(jié)晶的鏡檢方法等[4]。該方法中明確了本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍，即用于推定在30 ℃時(shí)蠟樣芽胞桿菌菌落計(jì)數(shù)的方法，在實(shí)驗(yàn)前期僅采用了MYP瓊脂和溶血實(shí)驗(yàn)兩種，故選用了“推定”這一詞匯，表明在該驗(yàn)證階段可能不會將蠟樣芽胞桿菌與其他相關(guān)但并不常見的芽孢桿菌區(qū)分開。在此標(biāo)準(zhǔn)的修正案中，用術(shù)語“蠟樣芽胞桿菌菌群”代替了“推定的蠟樣芽胞桿菌”，如EFSA在2016年發(fā)表的科學(xué)意見中所解釋的，因?yàn)樗诳茖W(xué)上表述更為精確[5]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法應(yīng)用在蠟樣芽胞桿菌菌群分離株中檢測細(xì)胞毒素K的cytK-1或cytK-2基因變異并鑒定有細(xì)胞毒性的蠟樣芽胞桿菌。cytK-2基因位于染色體上并編碼的細(xì)胞毒素K，產(chǎn)生腸毒素，廣泛存在于蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽胞桿菌菌株[6]。cytK-1基因是cytK-2基因的變體，由于該基因存在顯著的多態(tài)性，可以編碼具有更強(qiáng)細(xì)胞毒性的細(xì)胞毒素K且僅存在于細(xì)胞毒素芽孢桿菌（B. cytotoxicus）細(xì)胞中[7]，見圖1。該補(bǔ)充方法表明，PCR測定可以檢測細(xì)胞毒素K基因（特別是其兩個(gè)變體中的一個(gè)）和鑒定B. cytotoxicus菌株，這兩個(gè)特征均與食物中毒有關(guān)。

針對含有ces基因、能夠產(chǎn)生嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌菌群的檢測，分別采用瓊脂糖凝膠電泳PCR和實(shí)時(shí)PCR兩種方法。運(yùn)動性測試可在分離出的蠟樣芽胞桿菌中區(qū)別出炭疽芽孢桿菌，但該檢測方法仍具有較強(qiáng)的局限性，不能有效區(qū)分蕈狀和炭疽兩種芽孢桿菌。

1.2 BAM

美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）制定的BAM包含其對食品和化妝品微生物分析的首選實(shí)驗(yàn)室方法。第十四章中說明了蠟樣芽胞桿菌的兩種檢測方法：平板計(jì)數(shù)法和最可能數(shù)法（Most Probable Number，MPN）法。其中增加了耐低溫測試和對嘔吐毒素進(jìn)行定量分析的方法。

BAM中指出，MYP瓊脂一直是接種蠟樣芽胞桿菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，但是選擇性極低，因此背景菌群不能被有效抑制，可能會掩蓋潛在的蠟樣芽胞桿菌。本方法同時(shí)選用了一種兼有顯色性和選擇性的瓊脂培養(yǎng)基——Bacara培養(yǎng)基，它可促進(jìn)蠟樣芽胞桿菌的生長并會抑制背景菌群[8]。

針對區(qū)分蠟樣芽胞桿菌的典型菌株與蠟樣芽胞桿菌菌群中其他菌株的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了耐低溫菌株測試。為了測定待測菌株的耐低溫性，在兩塊TSA平板上劃線。一個(gè)平板在6 ℃孵育28 d，另一個(gè)在43 ℃孵育4 d。魏登施泰芽胞桿菌（B. weihenstephanensis）菌株會在6 ℃生長，但不會在43 ℃生長。在方法的最后增加了對與某些蠟樣芽胞桿菌菌株相關(guān)的嘔吐毒素進(jìn)行定量分析的方法。

1.3 中國國家標(biāo)準(zhǔn)以及出口食品檢測方法

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14—2014）中規(guī)定了兩種檢測方法：平板計(jì)數(shù)法及MPN法[9]?！冻隹谑称分邢灅友堪麠U菌檢測方法》（SN/T 0176—2013）在平板計(jì)數(shù)法及MPN法基礎(chǔ)上增加了可替代生化實(shí)驗(yàn)的生化鑒定試劑盒或全自動生化鑒定系統(tǒng)。上述兩個(gè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，對樣品取樣量均規(guī)定為25 g，在GB 4789.14—2014中對接種量有詳細(xì)而明確的規(guī)定，根據(jù)樣品污染狀況的預(yù)估，選擇2～3個(gè)適宜、連續(xù)稀釋度的樣品勻液，分別接種MYP瓊脂平板，每個(gè)稀釋度接種量分別為0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL。

2 國內(nèi)外蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)比較

國內(nèi)外采用培養(yǎng)法檢測蠟樣芽胞桿菌的差異比較情況見表1。ISO 7932：2004中未提及MPN法且在生化實(shí)驗(yàn)部分選擇的實(shí)驗(yàn)種類較少，但要求進(jìn)行蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)、嘔吐毒素檢測和毒力基因檢測。在蘇云金芽孢桿菌的蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶油鏡檢查規(guī)程中，特別強(qiáng)調(diào)了從細(xì)菌細(xì)胞中釋放出來之后這些蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶很難與其他包含體區(qū)分開，因此應(yīng)當(dāng)在其仍與芽孢一起存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)時(shí)進(jìn)行觀察，這一方法與國標(biāo)法在操作和判定時(shí)存在一定區(qū)別。

ISO和BAM都針對嘔吐毒素檢測的詳細(xì)方法進(jìn)行了說明，而我國國家標(biāo)準(zhǔn)對該方面沒做要求。在毒力基因檢測方面僅有ISO標(biāo)準(zhǔn)中有明確規(guī)定，其他兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中均未涉及，但該結(jié)果僅表明可能存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，僅通過基因鑒別或種屬鑒定無法確認(rèn)cytK基因的表達(dá)情況。

在蠟樣芽胞桿菌不同菌株硝酸鹽還原試驗(yàn)中，國標(biāo)中標(biāo)注的“+/-”符號表示大多數(shù)的菌株陽性，而在BAM中該符號表示50%的菌株呈陽性，且在硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)方法給出了不同的判定說明。因此，依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生化結(jié)果判定時(shí)，要特別注意判定說明不同帶來的結(jié)果差異性。詳見表2。

進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0176—2013的培養(yǎng)法與國標(biāo)一致，提出了可替代的生化實(shí)驗(yàn)，選用API 50 CHB生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定[10]?！冻隹谑称分邢灅友堪麠U菌快速檢測方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中，采用了傳統(tǒng)的PCR檢測分析方法，利用蠟樣芽胞桿菌區(qū)別于其他種芽孢桿菌的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測[11]，與ISO相比較還欠缺關(guān)于菌種鑒定基因、毒力基因分析等檢測信息，缺乏針對進(jìn)出口行業(yè)快速、高效的檢測手段，如DNA提取試劑盒和蠟樣芽胞桿菌檢測PCR試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)中對PCR法的包含性和排他性也沒有進(jìn)行全面分析[12]。

3 結(jié)語

食品、化妝品等產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)方法系列標(biāo)準(zhǔn)是推動中國食品、化妝品等產(chǎn)品質(zhì)量、安全發(fā)展的重要方法和檢驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也是我國食品、化妝品等國家安全標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)的重要組成部分。蠟樣芽胞桿菌是目前引起食源性疾病暴發(fā)的主要致病菌之一，作為一種條件致病菌，其致病性主要是由兩個(gè)因素決定：①該菌是否攜帶毒力基因并能正確表達(dá)；②在被污染的食品樣品中，蠟樣芽胞桿菌的水平是否可達(dá)到105 CFU·g-1或更高水平。所以對蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)也應(yīng)圍繞這兩個(gè)條件展開。隨著國際標(biāo)準(zhǔn)先進(jìn)理念的不斷更新，檢驗(yàn)檢測技術(shù)的不斷智能化、快速化，我國也應(yīng)加強(qiáng)國際食品貿(mào)易和國內(nèi)監(jiān)管體系的科學(xué)性和有效性，促使我國食品安全微生物檢驗(yàn)水平和效率更符合經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，加快推進(jìn)我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)。

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