高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中的甲硝唑和地美硝唑

摘 要：目的：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中甲硝唑和地美硝唑殘留的方法。方法：樣品依次用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，使用Shimadzu VP-ODS C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描，外標(biāo)法定量。結(jié)果：甲硝唑和地美硝唑的質(zhì)量濃度在0～400 μg·L-1時(shí)線性關(guān)系良好，檢出限和定量限分別為0.5 μg·kg-1和1.0 μg·kg-1。在0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1 3個(gè)加標(biāo)水平下，精密度和加標(biāo)回收率均符合要求。結(jié)論：該方法前處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、回收率高，適用于大批量雞蛋中甲硝唑、地美硝唑殘留的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；雞蛋；甲硝唑；地美硝唑

Determination of Metronidazole and Dimenidazole in Eggs"by High-Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry

LU Wei， ZUO Wenjing， DING Shihua

（Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center， Baoji 721000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of metronidazole and dimenidazole in eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The samples were extracted with ethyl acetate， degreased with n-hexane， and cleaned up with a mixed cation exchange solid phase extraction column. The samples were separated on a Shimadzu VP-ODS C18 column with 0.1% formic acid water and 0.1% formic acid acetonitrile as the mobile phases. Multiple reaction monitoring positive ion scanning and external standard method were used for quantification. Result： The linear relationship between metronidazole and dimenidazole was good in the range of 0～400 μg·L-1， and the limits of detection and quantification were 0.5 μg·kg-1 and 1.0 μg·kg-1， respectively. At the three spiked levels of 0.5 μg·kg-1， 1.0 μg·kg-1， and 5.0 μg·kg-1， the precision and spiked recovery rates met the requirements. Conclusion： This method has simple pretreatment， good reproducibility， and high recovery rate， and is suitable for the determination of metronidazole and dimenidazole in large quantities of eggs.

Keywords： high-performance liquid chromatography mass spectrometry; eggs; metronidazole; dimenidazole

甲硝唑、地美硝唑?qū)儆谌斯ず铣傻南趸溥蝾愃幬?，?duì)雞生殖系統(tǒng)疾病、腸道和組織的厭氧菌感染、家禽的滴蟲(chóng)病感染等有較好的療效[1]。同時(shí)，此類藥物可作為牛、豬、禽的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，能提高飼料轉(zhuǎn)化率[2]。硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)有不同程度的殘留，而這些動(dòng)物性食品進(jìn)入人體后，可能引起細(xì)胞誘變和遺傳毒性作用，從而影響人體健康[3]。歐盟和美國(guó)將二者列為禁用獸藥，而日本規(guī)定二者不得在食品中檢出[4]。我國(guó)制定的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定允許二者作治療用獸藥，但在動(dòng)物源性食品中不得檢出[5]。

雞蛋含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、卵磷脂等營(yíng)養(yǎng)成分，因此一直以來(lái)都是居民日常飲食中的重要組成部分。我國(guó)目前制定和發(fā)布的硝基咪唑類藥物檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中只有《動(dòng)物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 2624—2010）有針對(duì)雞蛋的前處理方法，但提取過(guò)程需要反復(fù)轉(zhuǎn)移樣液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并且使用兩種固相萃取柱凈化，步驟較復(fù)雜，回收率低。本實(shí)驗(yàn)旨在確?；厥章实那疤嵯?，尋找一種簡(jiǎn)便的前處理方式，使其適于檢測(cè)大批量樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售雞蛋，去殼后均質(zhì)，-18 ℃以下保存。

甲醇、正己烷、乙腈（色譜純），DIKMA；甲酸（色譜純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯（色譜純），Knowles諾爾施；濃鹽酸，四川西隴科學(xué)有限公司；氨水，天津北聯(lián)；甲硝唑有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度99.3%，TM Standard；地美硝唑有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度99.9%，TM Standard；實(shí)驗(yàn)用一級(jí)水；Agela混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱，60 mg，3 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：ESI源，美國(guó)賽默飛科技有限公司；SQP Practum224-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；VG3渦旋混勻器，IKA；TG16-WS離心機(jī)，湖南滬康離心機(jī)有限公司；MTN-2800D氮吹儀，天津奧特塞思斯儀器有限公司。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

（1）液相色譜條件。LC-30AD系統(tǒng)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈溶液；色譜柱：Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，4.6 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.30 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL；洗脫方式：梯度洗脫，時(shí)間程序見(jiàn)表1。

（2）質(zhì)譜條件。LCMS-8030系統(tǒng)；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源：ESI+；離子源接口電壓：4.5 kV；干燥氣：N2（流量15 L·min-1）；霧化氣：N2（流量3.0 L·min-1）；碰撞氣：Ar；加熱模塊溫度：400 ℃；脫溶劑管溫度：200 ℃；駐留時(shí)間：100 ms；延遲時(shí)間：3 ms。

1.4 樣品前處理

稱取2 g（準(zhǔn)確至0.1 mg）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，旋渦混勻2 min，10 000 r·min-1離心5 min。取上清液于另一50 mL離心管中，殘?jiān)屑尤?5 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次，將兩次提取液合并于25 ℃氮吹干。殘余物中加0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL，旋渦1 min充分溶解，加入正己烷5 mL，振搖1 min，5 000 r·min-1離心5 min，棄正己烷層。下層再加5 mL正己烷重復(fù)除脂一次，棄正己烷層，備用。

依次用甲醇2 mL和0.1 mol·L-1鹽酸溶液2 mL活化固相萃取柱，取備用液過(guò)柱，依次用0.1 mol·L-1鹽酸溶液2 mL、甲醇1 mL和2%氨水1 mL淋洗，2 mL洗脫液洗脫。收集洗脫液，35 ℃氮吹干，加水1 mL，渦旋1 min，濾膜過(guò)濾，供測(cè)定。取空白試料，除不加藥物外，同上步驟處理。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取甲硝唑和地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并稀釋定容，分別配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取上述儲(chǔ)備液各10 μL，用甲醇分別定容至10 mL，配制成1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。取經(jīng)上述提取和凈化的空白試料溶液，分別加入適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，35 ℃氮吹干，加水1 mL，渦旋1 min，配制成濃度為0 μg·L-1、2 μg·L-1、4 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、200 μg·L-1和400 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)曲溶液并上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正離子掃描和MRM模式下，多次測(cè)定100 ng·mL-1的甲硝唑和地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。選擇穩(wěn)定性好、干擾小、相對(duì)離子豐度高的碎片離子作為定量離子和定性離子，并以響應(yīng)值最高、豐度最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。定量離子的MRM圖見(jiàn)圖1，特征離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

試驗(yàn)對(duì)比了以下3組流動(dòng)相組合：①甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨溶液；②0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸2 mmol·L-1乙酸銨水溶液+甲醇（95+5）；③0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈。其中，第3組流動(dòng)相組合響應(yīng)值最好，且出峰效果最佳，因此選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

甲硝唑和地美硝唑在乙酸乙酯和乙腈中具有較好的溶解性。雞蛋中加入乙腈后，易形成果凍狀物質(zhì)，影響提取效果。而加入乙酸乙酯后可較好地提取目標(biāo)物質(zhì)，離心后正己烷除脂，通過(guò)混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化去除雜質(zhì)干擾。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系

用空白基質(zhì)按照上述方法處理，配制相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)曲溶液上機(jī)測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，甲硝唑的線性回歸方程為f（x）=0.498 004x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3；地美硝唑的線性回歸方程為f（x）=360.416x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。結(jié)果表明，二者在0～400 μg·L-1都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 檢出限和定量限

準(zhǔn)確稱取11份陰性樣品，加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法處理，檢出限為信噪比≥3時(shí)的濃度，定量限為信噪比≥10時(shí)的濃度，得到甲硝唑和地美硝唑的檢出限均為0.5 μg·kg-1，定量限均為1.0 μg·kg-1。

2.3.3 精密度和回收率

稱取陰性樣品，按照0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1和5.0 μg·kg-1 3個(gè)水平分別加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，按照上述方法處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，精密度和加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，甲硝唑和地美硝唑的精密度和加標(biāo)回收率均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）的要求。

2.3.4 實(shí)際樣品測(cè)定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的有效性，選擇市售的多批雞蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定回收率在82.1%～103.2%，相比于SN/T 2624—2010的前處理方法，此方法前處理高效簡(jiǎn)便，提高了提取效率，適用于檢測(cè)大批量樣品。

3 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)雞蛋中甲硝唑和地美硝唑的方法。本方法線性良好，前處理方法較SN/T 2624—2010中的方法簡(jiǎn)單，回收率高，可應(yīng)用于大批量食品檢測(cè)。后續(xù)還將繼續(xù)研究，將此方法應(yīng)用于其他基質(zhì)中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)。

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