食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法應(yīng)用分析

摘 要：目的：對熟肉制品、速凍調(diào)理肉、速凍水產(chǎn)制品、即食果蔬制品、冷凍飲品和乳制品6類食品開展單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測，總結(jié)試驗(yàn)注意事項(xiàng)，評估病原菌污染風(fēng)險(xiǎn)，為食品質(zhì)量監(jiān)控提供依據(jù)。方法：依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對樣品進(jìn)行增菌、分離、初篩、鑒定，計(jì)算檢出率。結(jié)果：速凍調(diào)理肉、速凍水產(chǎn)制品、冷凍飲品3類食品均檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，其中冷凍飲品檢出率最高。結(jié)論：冷凍食品有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)；選擇合適的檢測方法監(jiān)控病原菌，可降低單核細(xì)胞增生李斯特氏菌食品污染發(fā)生概率，保障食品安全。

關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；培養(yǎng)；檢測；檢出率

Application Analysis of Detection Methods for Listeria monocytogenes in Food

ZHU Shiyu， REN Guanda， GUO Xu， ZHAO Ziyi

（Shenyang Market Regulatory Affairs Service Center （Shenyang Product Quality Supervision and Inspection Institute）， Shenyang 110022， China）

Abstract： Objective： To detect Listeria monocytogenes in cooked meat products， quick-frozen prepared meat， quick-frozen aquatic products， ready-to-eat fruit and vegetable products， frozen drinks and dairy products. Summarize the precautions of the test， assess the risk of pathogen contamination， to provide the basis for food quality control. Method： According to the national standard， the samples were increased， separated， screened， identified and calculate the detection rate. Result： Listeria monocytogenes were detected in frozen prepared meat， frozen aquatic products and frozen drinks. The detection rate of frozen drinks was the highest. Conclusion： Frozen food has the risk of Listeria monocytogenes contamination. Select the appropriate test method to monitor the pathogen， reduce the probability of Listeria monocytogenes contaminating food， ensure food safety.

Keywords： Listeria monocytogenes; cultivate; detection; detection rate

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）在自然界普遍存在，如土壤、植物、地表水等。該菌屬于一種人畜共患病的病原菌，動物和人攝入受污染的水或食物感染該細(xì)菌后會引發(fā)疾病。通常情況下，LM是革蘭氏陽性嗜冷桿菌，具有較強(qiáng)的生長繁殖能力，在4～45 ℃環(huán)境中均可以生長繁殖，污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)較高[1]。生活環(huán)境中存在LM污染會大幅提升人類感染患病風(fēng)險(xiǎn)，免疫力低下的人群如老人、嬰幼兒是該菌的易感染人群。LM可突破腸道、血腦和胎盤屏障，引發(fā)機(jī)體腸道炎、腦膜炎，甚至導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，現(xiàn)已被列為食品主要致病菌之一[2]。因此，重視對LM污染的監(jiān)控，借助快速檢驗(yàn)方法對食品中LM開展檢驗(yàn)，對于保護(hù)消費(fèi)者生命健康、保障公共衛(wèi)生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)選取不同區(qū)域的食品消費(fèi)場所的熟肉制品、速凍調(diào)理肉、速凍水產(chǎn)制品、即食果蔬制品、冷凍飲品、乳制品6類食品產(chǎn)品。菌種：單增李斯特氏菌（編號ATCC 19111）、伊氏李斯特氏菌（編號ATCC 19119）、斯氏李斯特氏菌（編號ATCC 35967）、英諾克李斯特氏菌（編號ATCC 33090）、馬紅球菌（編號ATCC 6939）和金黃色葡萄球菌（編號ATCC 25923）。

酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯、酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基、李氏增菌肉湯、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、SIM動力培養(yǎng)基和生化鑒定試劑盒，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LE2002E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UBM-400拍擊式均質(zhì)器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；BF-115生化培養(yǎng)箱，德國賓得科技公司；CI-L生物顯微鏡，日本尼康科技公司；A2-1379生物安全柜，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 檢驗(yàn)方法

（1）增菌。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）對樣品進(jìn)行增菌，以無菌操作選擇25 g（mL）待檢測樣品和25 mL李斯特質(zhì)控菌種菌液分別將其置于225 mL LB1培養(yǎng)液中，混勻，將其置于（30±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，取培養(yǎng)液0.1 mL置于10 mL LB2培養(yǎng)液中，混勻，置于（30±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

（2）分離。依據(jù)GB 4789.30—2016分離污染菌，取上述樣品和質(zhì)控菌種培養(yǎng)液，接種于PALCAM培養(yǎng)基和LM顯色瓊脂培養(yǎng)基。將其置于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。

（3）初篩。依據(jù)GB 4789.30—2016純培養(yǎng)可疑目標(biāo)菌，將可疑目標(biāo)菌和質(zhì)控菌種接種到酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)接種鼠李糖發(fā)酵培養(yǎng)基和木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

（4）鑒定。依據(jù)GB 4789.30—2016對可疑目標(biāo)菌和質(zhì)控菌種開展鑒定試驗(yàn)，將上述培養(yǎng)物接種到SIM動力培養(yǎng)基中于（25±1）℃培養(yǎng)24～48 h。同時(shí)接種到生化試劑培養(yǎng)基（MR、VP、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷）中，將其放置在（36±1）℃環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。將上述培養(yǎng)物接種到血瓊脂平板上，在平板的底部位置分隔出多個(gè)小格，在各個(gè)小格中引入一種菌落，置于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

陽性樣品和LM質(zhì)控菌種鏡檢為革蘭氏陽性菌，有動力生長現(xiàn)象，鑒定結(jié)果如表1所示。其中鼠李糖黃色為陽性，綠色為陰性；木糖黃色為陽性，綠色為陰性；MR紅色為陽性，無色為陰性；VP紅色為陽性，無色為陰性；葡萄糖黃色為陽性，綠色為陰性；麥芽糖黃色為陽性，綠色為陰性；甘露醇黃色為陽性，綠色為陰性；七葉苷黑色為陽性，無色為陰性。通過反應(yīng)顏色判定陽性樣品和LM質(zhì)控菌種顯示出鼠李糖陽性、木糖陰性、MR陽性、VP陽性、葡萄糖陽性、麥芽糖陽性、甘露醇陰性及七葉苷陽性，且溶血試驗(yàn)未出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，將符合此鑒定結(jié)果的樣品判定為陽性檢出。在鑒定檢測中為了獲得良好鑒定效果，選擇應(yīng)用商品化生化試劑盒開展檢驗(yàn)，操作方便，可減少檢驗(yàn)時(shí)間。在試驗(yàn)過程中與質(zhì)控菌種鑒定對比，防止非目標(biāo)菌的干擾。

2.2 樣品檢出率

通過以上鑒定方法對2021—2023年抽取的472份

食品樣品進(jìn)行LM檢驗(yàn)，結(jié)果顯示陽性樣品共5份，檢出率為1.06%。各年份檢出情況如表2所示。

472份樣品分為熟肉制品、速凍調(diào)理肉、速凍水產(chǎn)制品、即食果蔬制品、冷凍飲品和乳制品，各類別檢驗(yàn)出情況如表3所示。冷凍飲品檢出率最高，達(dá)到1.82%，其余依次為速凍水產(chǎn)制品（1.72%）、速凍調(diào)理肉（1.64%），熟肉制品、即食果蔬制品和乳制品未檢出LM。

3 結(jié)論與討論

LM在食品致病菌檢驗(yàn)中屬于較為常見的指標(biāo)，2021—2023年隨機(jī)選取的472份6類食品樣品中，LM平均檢出率為1.06%，說明食品產(chǎn)品存在LM污染風(fēng)險(xiǎn)。其中，冷凍飲品檢出率為1.82%，在6類食品中檢出率最高，其次為速凍水產(chǎn)制品和速凍調(diào)理肉，檢出率分別為1.72%和1.64%。LM病原菌即便在低溫、高滲環(huán)境下也能夠生長繁殖，所以冷凍不能抑制LM生長，LM在冷凍食品中檢出率較高。因此，食品冷凍儲存方式存在病原菌污染風(fēng)險(xiǎn)，在食品流通領(lǐng)域不能過度依賴食品的冷凍儲存方式，應(yīng)定期對冷凍設(shè)備進(jìn)行清洗消毒，監(jiān)控冷凍設(shè)備病原菌污染情況，在冷凍食品檢驗(yàn)中要更加關(guān)注LM污染情況。

在對樣品開展LM檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)增菌環(huán)節(jié)有混濁現(xiàn)象，說明樣品中有污染菌。食品樣品往往受多種細(xì)菌污染，為有效檢出目標(biāo)菌，在增菌環(huán)節(jié)要注意選擇適合的培養(yǎng)基排除干擾菌。LB培養(yǎng)液中加入吖啶黃以及萘啶酮酸2種試劑，對細(xì)菌脫氧核苷酸有一定抑制作用，可減少革蘭氏陰性菌的增殖[3]，LM在此營養(yǎng)條件下低溫培養(yǎng)可有效繁殖，有良好增菌效果。在增菌檢驗(yàn)時(shí)，要注意培養(yǎng)基配制，防止過度熱處理影響培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，添加上述2種試劑時(shí)要注意避光操作，添加時(shí)防止液體濺出，防止出現(xiàn)氣溶膠對環(huán)境和人員造成污染和傷害。在二次增菌時(shí)，取0.1 mL增菌液，注意增菌液完全混勻，確保增菌液培養(yǎng)的均勻性，防止出現(xiàn)漏檢問題。在分離環(huán)節(jié)，典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈；在顯色瓊脂培養(yǎng)基上為藍(lán)綠顏色菌落，周邊存在白色暈圈。應(yīng)用顯色瓊脂培養(yǎng)基分離目標(biāo)菌種，較普通培養(yǎng)基更加便捷有效。在分離檢驗(yàn)時(shí)，分離瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，確保培養(yǎng)時(shí)間足夠滿足細(xì)菌生長要求，注重分離單個(gè)菌落，辨別菌落形態(tài)顏色，與質(zhì)控菌種做對照，防止帶入雜菌和出現(xiàn)漏檢的情況。根據(jù)菌體抗原類型可將LM分為多個(gè)血清型，不同血清型的毒力、致病性不同，LM致病性強(qiáng)的血清型與其他細(xì)菌有重合抗原，因此鑒定血清型對分辨LM致病性沒有意義，反而通過生化反應(yīng)鑒定LM更準(zhǔn)確。在生化鑒定環(huán)節(jié)，鼠李糖發(fā)酵和木糖發(fā)酵是初篩生化反應(yīng)，要注意辨別發(fā)酵反應(yīng)的顏色，在鑒定檢驗(yàn)時(shí)要應(yīng)用生化試劑盒，注意接種菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫确乐钩霈F(xiàn)假陽性。應(yīng)用生化試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)可節(jié)省配制培養(yǎng)基的時(shí)間，更加快速地鑒別細(xì)菌。此外，隨著科技的發(fā)展，目前利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定LM病原菌已得到普及。通過分析病原菌的actA基因序列，進(jìn)行引物和RPA探針設(shè)計(jì)，進(jìn)而應(yīng)用PCR分子生物學(xué)技術(shù)開展病原菌檢測[4]。此方法鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，但操作過程有分子生物污染風(fēng)險(xiǎn)，并且步驟煩瑣，不便于常規(guī)篩查食品中LM污染情況，而應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)可規(guī)避分子生物學(xué)污染問題，并實(shí)現(xiàn)LM的定量分析[5]。

綜上所述，相關(guān)監(jiān)管部門和食品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)選擇高效、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)開展食品和環(huán)境中LM檢測工作，關(guān)注冷凍食品LM的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，對食品污染情況進(jìn)行評估，及時(shí)找出影響食品安全的因素，保證食品市場健康發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]余琪，吳忠紅，譚慧林.食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)探討[J].現(xiàn)代食品，2020（10）：146-147.

[2]王福.單核細(xì)胞增生李斯特菌研究進(jìn)展[J].口岸衛(wèi)生控制，2011，16（5）：50-53.

[3]王海艷，劉中學(xué)，劉虹，等.干奶粉中單增李斯特氏菌的生存評估[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2008（4）：19-22.

[4]郭正洋，陳晶，劉小青，等.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌熒光RPA快速檢測方法的建立[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2020，39（12）：5599-5605.

[5]王小紅.熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)（分子生物學(xué)分冊），2001（1）：42-45.