基于表型性狀和SSR標(biāo)記的青梗不結(jié)球白菜遺傳多樣性分析

摘" "要" "為探討作物的起源和演化，研究種質(zhì)間的親緣和系統(tǒng)分類關(guān)系，為青梗不結(jié)球白菜分類及種質(zhì)資源利用提供基本的參考依據(jù)，對青梗不結(jié)球白菜的主要表型性狀進(jìn)行分析，并進(jìn)行SSR標(biāo)記鑒定和聚類分析。結(jié)果表明，117份青梗不結(jié)球白菜的表型性狀變異系數(shù)和多樣性指數(shù)差異較大，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)各性狀之間都存在1～4個(gè)極顯著或顯著相關(guān)關(guān)系。通過16個(gè)數(shù)量性狀的降維處理，提取了5個(gè)主成分因子，累積貢獻(xiàn)率為71.594%。5個(gè)主成分充分說明了16個(gè)數(shù)量性狀在117份材料變異中的作用，其中株高、株幅、葉片相關(guān)性狀及長角果性狀占主要部分。對117份青梗不結(jié)球白菜進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，遺傳相似系數(shù)0.8可分成四大類。

關(guān)鍵詞" "青梗不結(jié)球白菜；遺傳多樣性；聚類分析

不結(jié)球白菜（Brassica campestris L. ssp．chinensis Makino）又稱小白菜，十字花科蕓臺屬，源于長江中下游地區(qū)，全國各地均有栽培，主要集中在南方地區(qū)，是我國廣泛栽培的大宗蔬菜之一，種質(zhì)資源豐富。青梗不結(jié)球白菜作為不結(jié)球白菜的一種，其口感清爽，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可提高人體免疫力，深受消費(fèi)者的青睞。植物遺傳多樣性的研究是品種改良創(chuàng)新的基礎(chǔ)，也是種質(zhì)收集、保存和更新的方法途徑。近年來，隨著植物遺傳學(xué)研究的發(fā)展和進(jìn)步，植物遺傳多樣性的研究先后經(jīng)歷了多個(gè)研究階段，逐步成熟完善，形態(tài)學(xué)標(biāo)記（Morphological Markers）是研究植物種質(zhì)資源最基本的方法。形態(tài)學(xué)標(biāo)記有利有弊，其具備簡單易行、直觀的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也受生長環(huán)境、生長周期及人為主觀因素等的影響。分子標(biāo)記（Molecular Markers）基于DNA水平，通過個(gè)體間核苷酸序列差異進(jìn)行標(biāo)記，是遺傳多樣性研究中一種新型研究方法。利用DNA為研究對象，通過DNA直接表現(xiàn)出植物種質(zhì)資源的差異，結(jié)果迅速清晰，且高效穩(wěn)定。

在前人的研究中，遺傳多樣性的研究已涉及各個(gè)領(lǐng)域，盡管有許多關(guān)于蔬菜種質(zhì)資源多樣性的研究，但利用形態(tài)和分子兩種及兩種以上標(biāo)記方法，可進(jìn)一步全面地分析種質(zhì)資源多樣性，提高分析結(jié)果的可靠性。本研究對117份青梗不結(jié)球白菜材料的主要的29個(gè)質(zhì)量性狀和16個(gè)數(shù)量性狀利用遺傳多樣性、相關(guān)性、主成分等方法進(jìn)行分析，并進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，根據(jù)標(biāo)記結(jié)果聚類分析，旨在為青梗不結(jié)球白菜分類及利用提供理論參考。

1" "材料與方法

1.1" "試驗(yàn)材料" "試驗(yàn)材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)十字花科課題組提供的117份青梗不結(jié)球白菜（表1），2022年在楊凌曹新莊試驗(yàn)農(nóng)場播種栽培。將試驗(yàn)材料直播于田間，每畦7.5 m，每畦栽種4個(gè)品種，每個(gè)品種栽4行，株距10 cm，每個(gè)品種約80株，管理按一般不結(jié)球白菜種植的常規(guī)方法進(jìn)行田間管理，水肥一致。

1.2" "試驗(yàn)方法

1.2.1" "采收期對各試驗(yàn)材料進(jìn)行性狀調(diào)查和分析" 在青梗不結(jié)球白菜成熟期時(shí)，根據(jù)《不結(jié)球白菜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，各小區(qū)去除邊株后，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取10株青梗不結(jié)球白菜對16個(gè)數(shù)量性狀調(diào)查記錄，同時(shí)對29個(gè)質(zhì)量性狀按照分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行賦值。

1.2.2" "基因組DNA提取" "從田間采集材料，每份材料取3株，每株取新鮮嫩葉片，置于-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用改良CTAB法對供試青梗不結(jié)球白菜葉片中的DNA進(jìn)行提取，檢測DNA質(zhì)量，即濃度與純度，并根據(jù)結(jié)果稀釋到50～100 ng/μL，置于-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。根?jù)相應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并保存在4 ℃下備用，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "青梗不結(jié)球白菜數(shù)量性狀遺傳多樣性分析" "變異系數(shù)是分析評價(jià)植物農(nóng)藝性狀變異程度的重要指標(biāo)。16個(gè)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2所示，其變異系數(shù)在12.93%～53.51%之間，平均為27.77%，多樣性指數(shù)變幅為1.41～1.89，平均值為1.59。菜頭粗、葉柄長、單株質(zhì)量、長角果寬度和喙長這5個(gè)數(shù)量性狀的變異系數(shù)較大，說明這5個(gè)數(shù)量性狀的多態(tài)性優(yōu)于其他性狀，改良潛力較大。相反，開花植株高度和長角果長度的變異系數(shù)均低于15%，表明供試材料在花期中，開花植株高度和長角果長度這兩個(gè)變異程度最小，性狀較穩(wěn)定，相對而言研究潛力較低。

2.2" "青梗不結(jié)球白菜質(zhì)量性狀遺傳多樣性分析" "青梗不結(jié)球白菜的29個(gè)質(zhì)量性狀按照賦值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)材料的質(zhì)量性狀有明顯差異。如表3所示，多樣性指數(shù)在0.14～1.51范圍內(nèi)，平均多樣性指數(shù)為0.86，數(shù)值較高說明遺傳多樣性豐富。葉形、葉柄顏色、葉柄形狀多樣性指數(shù)較大，但總體來說低于數(shù)量性狀的多樣性。

2.3" "青梗不結(jié)球白菜數(shù)量性狀相關(guān)性分析" "為充分評價(jià)117份青梗不結(jié)球白菜資源的主要數(shù)量性狀，進(jìn)一步分析其數(shù)量數(shù)量性狀的相關(guān)性。結(jié)果如圖1所示，紅色表示呈正相關(guān)關(guān)系，藍(lán)色表示呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，顏色深淺代表不同的相關(guān)性系數(shù)，通過圖觀察發(fā)現(xiàn)，各數(shù)量性狀之間幾乎都存在極顯著或顯著相關(guān)關(guān)系。彩圖見封三。

2.4" "青梗不結(jié)球白菜數(shù)量性狀主成分分析" "16個(gè)數(shù)量性狀的主成分分析、主成分因子、特征值及貢獻(xiàn)率如表4所示，按照特征值大于1的標(biāo)準(zhǔn)提出前5個(gè)主成分因子，貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)71.594%。在青梗不結(jié)球白菜遺傳改良的研究中，要充分考慮株高、株幅、葉片相關(guān)性狀及長角果性狀。

2.5" " SSR引物篩選" "在供試材料中選取8份形態(tài)學(xué)差異較大的青梗不結(jié)球白菜材料，對100對引物進(jìn)行篩選，最終選擇12對擴(kuò)增多態(tài)性豐富的引物對所有材料進(jìn)行擴(kuò)增。在標(biāo)記條帶時(shí)，若一個(gè)引物中最少有2份試驗(yàn)材料出現(xiàn)了不同位置的條帶，則說明該引物可用于遺傳多樣性的分析。

2.6" "青梗不結(jié)球白菜基于SSR聚類分析" "117份材料的遺傳相似系數(shù)變幅在0～1.2范圍內(nèi)，平均變異相似系數(shù)為0.6。如圖2所示，117份青梗不結(jié)球材料在遺傳相似系數(shù)0.8時(shí)，所有材料被分成四大類。其中前三個(gè)類群包含的材料數(shù)目較大，根據(jù)不同的遺傳相似系數(shù)也被劃成不同亞類。

3" "討論

在植物遺傳多樣性的研究中，形態(tài)學(xué)標(biāo)記通過分析表型性狀來評價(jià)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，從而對群體進(jìn)行簡單的分類，多樣性的數(shù)據(jù)還能論述種質(zhì)資源的變異程度。研究發(fā)現(xiàn)，植物的基因型和生長環(huán)境決定了其形態(tài)學(xué)性狀的穩(wěn)定性和變異性，是植物發(fā)生變異的表現(xiàn)，同時(shí)證明了當(dāng)植物所處環(huán)境不利時(shí)，會自發(fā)改變其基因型，由此改變其形態(tài)學(xué)性狀以適應(yīng)環(huán)境。大量研究表明，植物的形態(tài)學(xué)標(biāo)記中，各性狀之間均有不同程度的相關(guān)性，但也存在一些差異，可能受栽培環(huán)境的影響。

從調(diào)查研究結(jié)果看，青梗不結(jié)球白菜不同性狀的變異系數(shù)存在很大差異，低者僅為12.93%，高者則達(dá)53.51%，這一結(jié)果表明青梗不結(jié)球白菜不同性狀的變異頻率和進(jìn)化速度是不同的，不同性狀都具有豐富的遺傳多樣性，在資源改良和選育新品種方面有很大潛力。因此，在青梗不結(jié)球白菜遺傳改良的研究中，要充分考慮株高、株幅、葉片相關(guān)性狀及長角果性狀對青梗不結(jié)球白菜產(chǎn)量和品質(zhì)的作用。

目前對青梗不結(jié)球白菜遺傳多樣性的研究仍有很多問題，由于國內(nèi)引進(jìn)的品種親緣關(guān)系模糊不確定，不了解它們的遺傳背景，限制了青梗不結(jié)球白菜種質(zhì)資源的選育和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。SSR標(biāo)記法作為目前分析遺傳多樣性的新型標(biāo)記方法，標(biāo)記快速精準(zhǔn)，可有力分析植物遺傳變異，由于其分析結(jié)果科學(xué)準(zhǔn)確，在植物遺傳起源與演變的研究領(lǐng)域的地位至關(guān)重要。本研究基于SSR分子標(biāo)記將117份青梗不結(jié)球白菜劃分成四大類，其第一類有35份材料，占整體比重29.66%，該類材料葉面平整且具有光澤度，大多為深綠色；第二類有37份材料，占整體比重31.35%，該類材料具有束腰性，葉色綠或淺綠，葉片大多上卷且無光澤，葉柄為白綠色；第三類有33份材料，占整體比重27.97%，該類材料葉數(shù)較多，葉色大多為深綠色，葉面皺縮；第四類有12份材料，占整體比重11.02%，該類材料形似大白菜，長勢較大，抱合，株型直立。其中前三個(gè)類群包含的材料數(shù)目較大，根據(jù)不同的遺傳相似系數(shù)也被劃成不同亞類。試驗(yàn)表明SSR標(biāo)記對材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，同樣可以按不同類型將材料區(qū)分，因此在未來植株遺傳多樣性分析及分類中，將分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相結(jié)合，結(jié)果具有全面性和科學(xué)性。

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【項(xiàng)目基金】：西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（23NYGG026）；西北農(nóng)林科技大學(xué)推廣專項(xiàng)（TGZX2023-39，TGZX2024-15）。

岳嘉欣，李翠萍，惠麥俠，西北農(nóng)林科技大學(xué)，郵編712100；宇軍，陜西省興平市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心。

收稿日期：2024-05-31

*通訊作者：惠麥俠（E-mail：maixiahui@163.com）