Cx43對(duì)膽總管結(jié)扎大鼠心肌損傷的負(fù)向調(diào)控作用及其機(jī)制

［摘要］ 目的

探討縫隙連接蛋白43（Cx43）在膽總管結(jié)扎（CBDL）引起的大鼠心肌損傷中的作用及其分子機(jī)制。

方法 將18只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CBDL組及Cx43抑制劑組，每組6只。假手術(shù)組大鼠行膽總管游離術(shù)，CBDL組大鼠游離、結(jié)扎并切斷膽總管，Cx43抑制劑組大鼠術(shù)前24 h通過尾靜脈單次注射25 mg/kg的Gap 26后，游離、結(jié)扎并切斷膽總管。三組大鼠飼養(yǎng)至術(shù)后第14天時(shí)采用心臟超聲檢查評(píng)估心臟射血分?jǐn)?shù)（EF）、縮短分?jǐn)?shù)（FS）和心率（HR）；隨后測(cè)定三組大鼠血清總膽紅素（TBil）、苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶-MB（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性及丙二醛（MDA）水平；取三組大鼠心臟組織行HE染色和Masson染色；采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心臟組織中Cx43、Wnt 3α、β-catenin蛋白的水平。

結(jié)果 心臟超聲檢查結(jié)果顯示，CBDL組、Cx43抑制劑組大鼠心臟EF、FS、HR均顯著低于假手術(shù)組（F=22.95～43.55，t=5.10～9.32，Plt;0.05）。血生化及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CBDL組、Cx43抑制劑組大鼠血清中TBil、AST、ALT、LDH、CK-MB、MDA、GSH-PX水平顯著升高，SOD的水平顯著降低（F=19.29～100.60，t=3.67～13.72，Plt;0.05）。HE染色及Masson染色結(jié)果顯示，CBDL組和Cx43抑制劑組大鼠發(fā)生心肌損傷及心肌間質(zhì)纖維化。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CBDL組和Cx43抑制劑組大鼠心臟組織中Cx43水平顯著下降，Wnt 3α、β-catenin水平顯著升高（F=28.50～70.07，t=4.32～11.79，Plt;0.05）；與CBDL組相比，Cx43抑制劑組大鼠心臟組織中Cx43水平顯著下降，Wnt 3α、β-catenin水平顯著升高（t=4.95～5.20，Plt;0.05）。

結(jié)論 CBDL大鼠心臟組織中Cx43下調(diào)可負(fù)向調(diào)控激活Wnt 3α/β-catenin通路，導(dǎo)致大鼠心肌組織損傷加劇及心臟功能下降。

［關(guān)鍵詞］ 心臟損傷；膽道疾?。荒懣偣埽唤Y(jié)扎術(shù)；纖維化；連接蛋白43；Wnt信號(hào)通路；β連環(huán)素

［中圖分類號(hào)］ R541;R575

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

The negative regulatory effect of connexin 43 on myocardial injury in rats with common bile duct ligation and its mechanism

WANG Xiaoyu， LYU Lin， YANG Han， ZHU Lin， DONG Shengnan， DONG He

（Department of Anesthesiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266075， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the role and molecular mechanism of connexin 43 （Cx43） in rats with myocardial injury induced by common bile duct ligation （CBDL）.

Methods A total of 18 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group， CBDL group， and Cx43 inhibitor group， with 6 rats in each group. The rats in the sham-operation group were given isolation of the common bile duct， those in the CBDL group were given isolation， ligation， and cutting of the common bile duct， and those in the Cx43 inhibitor group were given a single injection of 25 mg/kg Gap 26 via the caudal vein at 24 h before surgery， followed by the isolation， ligation， and cutting of the common bile duct. The rats in all three groups were reared to day 14 after surgery， and echocardiography was used to evaluate ejection fraction （EF）， fractional shortening （FS）， and heart rate （HR）; the three groups were measured in terms of serum total bilirubin （TBil）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase-MB （CK-MB）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-PX） activity， and malondialdehyde （MDA）; HE staining and Masson staining were performed for heart tissues samples collected from the three groups; Western blotting was used to measure the levels of Cx43， Wnt 3α， and β-catenin in heart tissue.

Results Echocardiography showed that the CBDL group and the Cx43 inhibitor group had significantly lower cardiac EF， FS， and HR than the sham-operation group （F=22.95-43.55，t=5.10-9.32，Plt;0.05）. Measurement of blood biochemical parameters and oxidative stress indicators showed that compared with the sham-operation group， the CBDL group and the Cx43 inhibitor group had significant increases in serum TBil， AST， ALT， LDH， CK-MB， MDA， and GSH-PX and a significant reduction in SOD （F=19.29-100.60，t=3.67-13.72，Plt;0.05）. HE staining and Masson staining showed myocardial injury and myocardial interstitial fibrosis in the CBDL group and the Cx43 inhibitor group. Western blotting showed that compared with the sham-operation group， the CBDL group and the Cx43 inhibitor group had a significant reduction in the level of Cx43 and significant increases in the levels of Wnt 3α and β-catenin in heart tissue （F=28.50-70.07，t=4.32-11.79，Plt;0.05）; compared with the CBDL group， the Cx43 inhibitor group had a significant reduction in Cx43 and significant increases in Wnt 3α and β-catenin in heart tissue （t=4.95-5.20，Plt;0.05）.

Conclusion Downregulation of Cx43 in the heart tissue of rats with CBDL can negatively regulate activation of the Wnt 3α/β-catenin pathway， thereby leading to the aggravation of myocardial injury and the reduction in cardiac function.

［KEY WORDS］ Heart injuries; Biliary tract diseases; Common bile duct; Ligation; Fibrosis; Connexin 43; Wnt signaling pathway; Beta catenin

因肝外膽道梗阻而出現(xiàn)黃疸的患者通常伴發(fā)多器官功能障礙［1］，且常伴有血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定［2］。GREEN［3］報(bào)道了高膽汁酸血癥患者左心室功能受損，并提出“黃疸型心臟”。黃疸型心臟表現(xiàn)為心肌收縮功能受抑制［4］，但目前黃疸引起的心臟損傷機(jī)制尚不清楚?？p隙連接蛋白43（Cx43）參與心肌損傷的病理生理過程［5］，心肌損傷會(huì)引起心肌細(xì)胞膜上Cx43發(fā)生重構(gòu)及表達(dá)量下降，導(dǎo)致心律失常［6］。研究發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白及Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌纖維化發(fā)展過程當(dāng)中發(fā)揮重要作用，兩者間存在串?dāng)_功能［7-8］。以往研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌組織Cx43水平調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［9］，但也有研究顯示Cx43作為上游調(diào)控因子，負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt 3α/β-catenin通路的通道非依賴性作用［8］。盡管已有研究證明Cx43影響Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但在膽總管結(jié)扎（CBDL）大鼠心臟損傷過程中其具體作用機(jī)制尚未明確。本研究通過建立CBDL大鼠模型，探究Cx43調(diào)控Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起大鼠心臟損傷的作用及其機(jī)制，以便為臨床治療黃疸型心臟損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)健康雄性成年SD大鼠18只，體質(zhì)量約（200±20）g，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CBDL組和Cx43抑制劑組，每組6只，均飼養(yǎng)14 d。使用異氟烷麻醉三組大鼠，假手術(shù)組大鼠經(jīng)上腹正中切口開腹，游離顯露膽總管后不進(jìn)行膽總管結(jié)扎，逐層關(guān)腹；CBDL組大鼠開腹后游離暴露膽總管，用4-0號(hào)線雙重結(jié)扎膽總管，結(jié)扎中間處切斷膽總管后逐層關(guān)腹；Cx43抑制劑組大鼠術(shù)前24 h通過尾靜脈單次注射25 mg/kg的Gap 26，游離、結(jié)扎并切斷膽總管步驟同CBDL組。術(shù)后三組大鼠均飼養(yǎng)14 d。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)三組大鼠心功能指標(biāo)

術(shù)后飼養(yǎng)至第14天時(shí)，使用異氟烷麻醉三組大鼠，用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（VINNO 6 LAB）對(duì)大鼠行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查，通過胸骨旁短軸和長(zhǎng)軸視圖獲得二維及M型超聲心動(dòng)圖圖像，測(cè)量大鼠心臟縮短分?jǐn)?shù)（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）和心率（HR）。

1.3 三組大鼠血清生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

心臟超聲檢查后按照常規(guī)方式頸椎脫臼處死三組大鼠，取下腔靜脈血約5 mL，以3 000 r/min離心10 min分離血清，使用全自動(dòng)動(dòng)物生化分析儀（BS-240VET）測(cè)定大鼠血清當(dāng)中總膽紅素（TBil）、苯丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）及肌酸激酶-MB（CK-MB）水平；使用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）及丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）分別測(cè)定大鼠血清中SOD、GSH-PX及MDA水平。

1.4 三組大鼠心肌組織HE及Masson染色

將三組大鼠下腔靜脈取血后，迅速打開胸腔摘取心臟。使用PBS沖洗后，取部分心肌組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE和Masson染色，觀察心肌組織病理變化。剩余心臟組織保存于－80 ℃冰箱中備用。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)三組大鼠心肌組織中Cx43、Wnt 3α、β-catenin蛋白水平

稱取三組大鼠心肌組織各30 mg，分別使用3 00 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，利用超聲波儀將組織完全溶解至超細(xì)胞裂解產(chǎn)物，靜置10 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。取30 μg蛋白樣品用10% SDS-PAGE電泳后，移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，將膜分別與一抗Cx43（1∶1 000）、Wnt 3α（1∶1 000）、β-catenin（1∶2 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體在4 ℃下孵育過夜，隨后再與二級(jí)HRP偶聯(lián)抗體（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。以GAPDH作為內(nèi)參，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，并用Image J軟件分析條帶的灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值之比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism 8軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 三組大鼠心臟功能指標(biāo)比較

三組大鼠心臟EF、FS、HR比較差異有顯著性（F=22.95～43.55，Plt;0.05）；其中與假手術(shù)組相比，CBDL組、Cx43抑制劑組大鼠心臟EF、FS、HR均顯著下降（t=5.10～9.32，Plt;0.05）；與CBDL組相比，Cx43抑制劑組大鼠心臟HR顯著下降（t=4.22，Plt;0.05）。見表1。

2.2 三組大鼠血清生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

三組大鼠血清中TBil、AST、ALT、LDH、CK-MB、MDA、GSH-PX、SOD水平比較差異均有顯著性（F=19.29～100.60，Plt;0.05）；其中與假手術(shù)組相比，CBDL、Cx43抑制劑組大鼠血清TBil、AST、ALT、LDH、CK-MB、MDA、GSH-PX水平均顯著升高，血清SOD的水平顯著降低（t=3.67～13.72，Plt;0.05）；與CBDL組相比，Cx43抑制劑組大鼠血清TBil、ALT、LDH、CK-MB、MDA、GSH-PX水平均顯著升高，血清SOD水平顯著降低（t=3.76～6.24，Plt;0.05）。見表2。

2.3 三組大鼠心肌組織HE染色和Msaaon染色結(jié)果比較

HE及Msaaon染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)有序，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，無異常；CBDL組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)部分萎縮，細(xì)胞間隙增大，心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)小血管輕度擴(kuò)張并少量充血，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列混亂，部分纖維斷裂及膠原纖維增加；Cx43抑制劑組大鼠心肌組織萎縮較重，細(xì)胞間隙增大更明顯，細(xì)胞腫脹加重，間質(zhì)血管擴(kuò)張及充血更明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，且心肌纖維化面積范圍更廣。見圖1。

2.4 三組大鼠心肌組織中Cx43、Wnt 3α、β-catenin蛋白表達(dá)水平比較

免疫印跡法結(jié)果顯示，三組大鼠心肌組織中Cx43、Wnt 3α、β-catenin蛋白表達(dá)水平差異均有顯著性（F=28.50～70.07，Plt;0.05）；其中與假手術(shù)組相比，CBDL、Cx43抑制劑組大鼠心肌組織中Wnt 3α和β-catenin水平顯著升高，Cx43水平顯著下降（t=4.32～11.79，Plt;0.05）；與CBDL組相比，Cx43抑制劑組大鼠心肌組織中Cx43進(jìn)一步下降，Wnt 3α、β-catenin則進(jìn)一步升高（t=4.95～5.20，Plt;0.05）。見圖2、表3。

3 討" 論

相關(guān)研究結(jié)果表明CBDL會(huì)導(dǎo)致心肌損傷［3］。1986年GREEN等［3］通過結(jié)扎狗的膽總管，發(fā)現(xiàn)狗的左心室功能受損，提出“黃疸型心臟”的概念。近年來研究顯示黃疸與心臟功能受損直接相關(guān)［2-4］。有研究表明，Cx43蛋白及Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌纖維化的發(fā)展中起重要作用［7-8］，但上述蛋白及通路在黃疸型心臟的病理機(jī)制中研究較少。本研究通過建立CBDL大鼠模型，探究心肌組織Cx43表達(dá)水平變化在大鼠心臟損傷中的作用及其機(jī)制。

既往研究表明，心肌組織中Cx43蛋白表達(dá)水平上升可改善心肌纖維化［7］。其機(jī)制可能為，心肌組織中Cx43水平上升可使卷曲相關(guān)蛋白（Sfrp2）表達(dá)增加［10-11］，而Sfrp2與Wnt蛋白配體能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而阻止Wnt相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用，從而減少心臟纖維化的發(fā)生［12-13］。Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心肌細(xì)胞中的Cx43在表達(dá)和功能上存在著相互關(guān)系，Cx43被認(rèn)為是Wnt 3α和β-catenin蛋白轉(zhuǎn)錄的靶點(diǎn)，Cx43可與β-catenin發(fā)生螯合作用，導(dǎo)致β-catenin的降解，從而抑制Wnt 3α/β-catenin信號(hào)通路的作用［14-15］。為探討Cx43對(duì)Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響在黃疸型心臟心肌損傷中的作用機(jī)制，本研究設(shè)置了Cx43抑制劑組對(duì)Cx43蛋白的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)。

血清堿性磷酸酶（AST、ALT）和肝臟代謝指標(biāo)

（TBil）是臨床梗阻性膽汁淤積的典型標(biāo)志物，可用

于評(píng)估肝細(xì)胞損傷情況［16］。CK-MB是診斷心肌組織損傷靈敏度較高的心肌酶指標(biāo)之一［17］。LDH主要來自心肌組織，其診斷心肌組織損傷的特異度較高［18］。本研究中CBDL及Cx43抑制劑組大鼠血清中TBil、AST、ALT水平均顯著高于假手術(shù)組，而假手術(shù)組、CBDL組、Cx43抑制劑組大鼠血清中心肌酶指標(biāo)LDH、CK-MB以及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-PX水平依次上升，SOD水平依次下降，表明CBDL大鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷所致的肝功能障礙，其原因?yàn)榇笫竽懣偣芙Y(jié)扎后膽管阻塞，導(dǎo)致TBil急劇上升，心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)致使心肌受損［19］，而Cx43蛋白表達(dá)被抑制后更加劇了心肌損傷。

黃疸型心臟心肌損傷可導(dǎo)致心功能降低，本研究超聲心動(dòng)圖顯示，CBDL組大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)較假手術(shù)組下降，Cx43抑制劑組較CBDL組HR進(jìn)一步下降，即CBDL組及Cx43抑制劑組大鼠心肌收縮力下降。隨后的HE及Masson染色結(jié)果顯示，CBDL及Cx43抑制劑組大鼠出現(xiàn)了心肌損傷及心肌間質(zhì)纖維化，且Cx43抑制劑組上述情況更加嚴(yán)重。

本研究免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cx43抑制劑組大鼠心肌組織中Cx43水平低于CBDL組，Wnt 3α和β-catenin水平高于CBDL組；而CBDL組大鼠心肌組織中Cx43水平低于假手術(shù)組，Wnt 3α以及β-catenin的水平高于假手術(shù)組。這說明心肌組織中Cx43表達(dá)被抑制后，可能激活Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與黃疸型心臟的心肌損傷進(jìn)程。心肌細(xì)胞中Cx43蛋白過表達(dá)后會(huì)負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［20］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。此外，Cx43蛋白可能是心肌細(xì)胞中GSK-3β蛋白的輔助因子［21］，推測(cè)Cx43也可能通過GSK-3β的作用間接抑制Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活［22］。

綜上所述，心肌組織中Cx43蛋白表達(dá)被抑制可激活Wnt 3α/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與CBDL大鼠心肌損傷的病理過程，該結(jié)論為黃疸型心臟導(dǎo)致的心肌損傷提供了有效干預(yù)靶點(diǎn)。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已經(jīng)通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)AHQU-MAL20220729）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理守則》的條例進(jìn)行。

作者聲明：董河、呂琳和王曉玉參與了研究設(shè)計(jì)；王曉玉、楊瀚、呂琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）