不同pH值對肌紅蛋白構(gòu)象及熱穩(wěn)定性的影響

摘 要：為探究不同pH值對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響，采用體外實驗，以正常pH值（5.6）和高pH值（6.4）肌紅蛋白溶液為研究對象，利用多光譜分析技術(shù)探究冷藏（4 ℃）和加熱（72 ℃）條件下不同pH值對肌紅蛋白分子結(jié)構(gòu)、表面疏水性和熱變性程度的影響。結(jié)果表明：4 ℃孵育條件下，2 種pH值對肌紅蛋白構(gòu)象無明顯影響，而72 ℃加熱條件下，pH 5.6肌紅蛋白溶液的內(nèi)源熒光強度、蛋白質(zhì)表面疏水性和熱變性程度顯著高于pH 6.4；相比于pH 6.4時，pH 5.6時的肌紅蛋白分子的三級結(jié)構(gòu)受到更嚴(yán)重的破壞，熱穩(wěn)定性降低。因此，環(huán)境pH值可以通過改變肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進而改變肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性，高pH值可以增加肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性，是導(dǎo)致DFD（dark， firm， dry）牛肉熟制時持續(xù)粉紅現(xiàn)象的重要原因。

關(guān)鍵詞：肌紅蛋白；pH值；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；熱穩(wěn)定性；熱變性

Effect of Different pH on the Structure and Thermal Stability of Myoglobin

YAO Meijie1， QI Jiajing1， YANG Xiaoyin1， MAO Yanwei1， XU Baochen1， HAO Jiangang2， GU Yue3，

ZHANG Yimin1，*， LIANG Rongrong1，*

（1. College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai’an 271000， China;

2. National Beef Cattle Industrial Technology System， Wulagai Comprehensive Experimental Station， Wulagai 026321， China;

3. National Beef Cattle Industrial Technology System， Baicheng Comprehensive Experimental Station， Baicheng 137314， China）

Abstract： In order to explore the effect of pH on the structure and thermal stability of myoglobin， the molecular structure and surface hydrophobicity of myoglobin at normal pH （5.6） and high pH （6.4） under refrigerated （4 ℃） and heating （72 ℃） conditions as well as its thermal denaturation degree were characterized by various spectroscopic techniques. The results showed that pH had no significant effect on the conformation of myoglobin at 4 ℃. However， the endogenous fluorescence intensity， protein surface hydrophobicity and thermal denaturation of myoglobin at 72 ℃ were significantly higher at pH 5.6 than at pH 6.4. The tertiary structure of myoglobin was more severely destroyed at pH 5.6 than pH 6.4， resulting in reduced thermal stability. Therefore， environmental pH can affect the thermal stability of myoglobin by altering its structural stability. High pH can increase the thermal stability of myoglobin， which is an important cause for the persistent pink color of dark， firm， dry （DFD） beef during cooking.

Keywords： myoglobin; pH; protein structure; thermal stability; thermal denaturation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-060

中圖分類號：TS251.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）06-0001-08

引文格式：

姚美杰， 齊家靜， 楊嘯吟， 等. 不同pH值對肌紅蛋白構(gòu)象及熱穩(wěn)定性的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（6）： 1-8. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-060. " "http：//www.rlyj.net.cn

YAO Meijie， QI Jiajing， YANG Xiaoyin， et al. Effect of different pH on the structure and thermal stability of myoglobin[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 1-8. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-060. " "http：//www.rlyj.net.cn

加熱熟制是人們食用肉類前的重要環(huán)節(jié)，可以殺滅微生物和病原菌。在熟制過程中，大部分消費者通過觀察中心肉色來判斷牛肉的熟制程度，然而利用感官判斷并不完全準(zhǔn)確。高pH值的黑切（dark， firm， dry，DFD）牛肉加熱至中心溫度71.1 ℃甚至更高時，牛肉的中心肉色仍為粉紅色，呈現(xiàn)熟制不充分的假象，導(dǎo)致消費者繼續(xù)對其加熱[1-2]，這種現(xiàn)象稱為持續(xù)粉紅（persistent pinking，PP）現(xiàn)象。該現(xiàn)象容易使肉類熟制過度，造成嫩度下降、汁液流失過多等品質(zhì)下降問題。

原料肉中3 種狀態(tài)的肌紅蛋白熱穩(wěn)定性有所不同，其熱穩(wěn)定性順序為：高鐵肌紅蛋白＜氧合肌紅蛋白＜脫氧肌紅蛋白[3]。DFD牛肉中含有更高比例的脫氧肌紅蛋白[4]，

這是導(dǎo)致其熟制時肌紅蛋白熱變性慢、呈現(xiàn)PP現(xiàn)象的原因之一。然而，除了肌紅蛋白本身的化學(xué)狀態(tài)外，肉的pH值也是影響肌紅蛋白熱穩(wěn)定性的一個重要因素，進而成為影響熟制肉色的重要因素[5]。許多研究發(fā)現(xiàn)，這3 種肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性均隨著pH值的升高而升高[6-7]。在pH 7.0時，高鐵肌紅蛋白直到60 ℃時才發(fā)生變性，而在pH≤5.6時，其變性溫度則降至50 ℃[7]，同樣，其他狀態(tài)的肌紅蛋白熱穩(wěn)定性也呈現(xiàn)相同的規(guī)律。因此，原料肉pH值高于正常范圍也是導(dǎo)致DFD牛肉熟制肉色呈現(xiàn)紅色或粉色的一個重要原因。

然而，截至目前，大部分關(guān)于DFD牛肉肉色的研究均集中在其生鮮肉色的形成機制和調(diào)控方面[8-10]，而關(guān)于其熟制時存在的PP現(xiàn)象研究尚不多。且關(guān)于該現(xiàn)象的有限研究也集中在對該現(xiàn)象的改善方面，而對于其形成機制研究還很少。Moiseev等[11]發(fā)現(xiàn)，DFD牛肉餅中添加微膠囊化的乳酸能顯著提高肌紅蛋白的變性程度，形成可接受的肉色，但是產(chǎn)生了強烈的異味；而添加CaO2雖然提高了肌紅蛋白的變性程度，但是造成了過度氧化，添加焦糖色素亦不能改善DFD牛肉熟制后的肉色。同時，Apple[12]、Nair[13]等的研究也再次證實添加乳酸可以降低DFD牛肉的pH值，從而改善生鮮肉色和熟肉肉色，由此可見，添加乳酸是改善DFD牛肉PP現(xiàn)象的可行措施之一。這些研究進一步證實了原料肉的高pH值是影響DFD牛肉熟制肉色的重要因素。

目前，高pH值影響肌紅蛋白熱穩(wěn)定性的機制研究報道較少。肌紅蛋白分子是一種較穩(wěn)定的球狀水溶性蛋白，由153 個氨基酸組成的多肽鏈和1 個血紅素輔基構(gòu)成。多肽鏈為血紅素基團提供了一個疏水空腔，能夠有效避免2 價鐵被氧化，其三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對肉色穩(wěn)定性具有重要影響[14]?；诖耍狙芯客茰y，在DFD牛肉加熱過程中，高pH值通過影響加熱過程中肌紅蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響其熱穩(wěn)定性，進而對熟制肉色產(chǎn)生影響。針對該推測，本研究擬通過體外實驗配制正常牛肉pH值（5.6）和DFD牛肉pH值（6.4）的肌紅蛋白溶液，在冷藏（4 ℃）（生鮮牛肉狀態(tài)）和加熱（72 ℃）（牛肉完全熟制時的狀態(tài)）條件下孵育，研究其在不同條件下的分子結(jié)構(gòu)變化和熱變性程度，探究不同pH值對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的影響，進而探討其影響熟制肉色的機制，以期進一步豐富肉色理論，為熟制肉色控制技術(shù)開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬骨骼肌肌紅蛋白（分子質(zhì)量17 000 Da）

美國Sigma Aldrich公司；MD44透析袋（截留分子質(zhì)量7 000 Da） 北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、連二亞硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU 1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Lumina熒光磷光分光光度計 德國Fisher公司；BCD-610W西門子冰箱 博西華家用電器有限公司；Raman Pro便攜式拉曼儀 美國Bamp;W Tek LLC公司；Epoch2酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 肌紅蛋白溶液配制與處理

稱取30 mg馬骨骼肌肌紅蛋白，分別溶于10 mL pH 5.6（模擬正常牛肉的pH值）和pH 6.4（模擬DFD牛肉的pH值）的50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，配制成質(zhì)量濃度為3 mg/mL的肌紅蛋白原液，向其中加入3 mg連二亞硫酸鈉還原肌紅蛋白，并將溶液轉(zhuǎn)入透析袋（截留分子質(zhì)量為7 000 Da），在4 ℃條件下透析過夜（期間更換3 次透析液），除去過量未反應(yīng)的連二亞硫酸鈉，備用。將肌紅蛋白原液稀釋至目標(biāo)濃度后轉(zhuǎn)移至離心管中，在4 ℃（模擬生鮮牛肉狀態(tài)）和72 ℃（模擬牛肉完全熟制時的狀態(tài)）條件下孵育0、2、4、6 h后，分別測定后續(xù)指標(biāo)。

1.3.2 熱變性程度測定

參考Nurilmala等[15]的方法并稍作修改。將肌紅蛋白原液稀釋至0.3 mg/mL，將孵育后的肌紅蛋白溶液于16 000×g離心2 min，取上清液在525 nm處測定吸光度（A525 nm）。參考Tang等[16]方法，按照式（1）計算溶液中肌紅蛋白濃度，并采用式（2）計算肌紅蛋白熱變

性程度：

（1）

（2）

式中：cMb為肌紅蛋白濃度/（mmol/L）；ε525 nm為

肌紅蛋白在525 nm處的摩爾消光系數(shù)（7.6 L/（mol·cm））。

1.3.3 拉曼光譜測定

參考Yang Hongbo等[17]的方法并稍作改動。將肌紅蛋白原液稀釋至0.3 mg/mL，到達(dá)孵育時間后，將肌紅蛋白溶液加入到1 cm石英比色皿中，使用便攜式拉曼儀進行測量，拉曼位移設(shè)置為500～2 500 cm－1。該儀器配備了一個785 nm的二極管激光器，通過BWSpec軟件設(shè)置激光功率為100 mW，樣品在此功率下測量30 s（掃描時間10 s，共掃描3 次）。

1.3.4 紫外-可見光譜測定

將肌紅蛋白原液稀釋至0.3 mg/mL，孵育相應(yīng)時間后，將樣品轉(zhuǎn)移至1 cm石英比色皿中，使用紫外-可見分光光度計進行測量。磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照，測試參數(shù)為：紫外-可見吸收光譜波長范圍240～700 nm，掃描間距1.0 nm。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測定

將肌紅蛋白原液稀釋至0.3 mg/mL，到達(dá)孵育時間后，將肌紅蛋白樣品轉(zhuǎn)移至1 cm石英比色皿中，使用熒光-磷光分光光度計進行測量。內(nèi)源熒光光譜測定條件：以280 nm為激發(fā)波長，測量290～400 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為5 nm，掃描間隔1.0 nm，掃描速率1 200 nm/min。

1.3.6 表面疏水性測定

參考Chelh等[18]的方法并稍作改動。將肌紅蛋白原液稀釋至0.5 mg/mL，在孵育時間結(jié)束后，取1 mL肌紅蛋白溶液于離心管中，加入100 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，混勻，室溫下反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，離心（5 000×g、15 min、4 ℃），取上清液，在595 nm處測定吸光度

（A樣品），取相同pH值的1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照，吸光度為A對照，重復(fù)上述操作。以溴酚藍(lán)的結(jié)合量表征表面疏水性，按式（3）計算：

（3）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所有實驗獨立重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SAS 9.0軟件中的混合模型（MIXED procedure）對肌紅蛋白變性程度、二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性進行方差分析，溶液pH值、孵育溫度和孵育時間及其交互作用為固定因子，實驗重復(fù)為隨機因子。P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2017和SigmaPlot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液pH值和孵育時間對肌紅蛋白熱變性程度的影響

溶液pH值和孵育時間不存在顯著交互作用

（P＞0.05），但2 個主效應(yīng)分別對肌紅蛋白熱變性程度影響顯著（P＜0.05）。由圖1A可知，2 種pH值條件下肌紅蛋白熱變性程度存在顯著差異，pH 5.6條件下肌紅蛋白變性程度顯著高于pH 6.4（P＜0.05），表明高pH值條件下肌紅蛋白變性程度降低，pH 6.4組約為pH 5.6組的50%。肉類在加熱過程中，肌紅蛋白變性程度的增大會促進其肉色向棕褐色轉(zhuǎn)變，而熱變性程度的減少則會延遲熟制肉色的褐變。因此，圖1A的結(jié)果可以解釋DFD牛肉熟制至72 ℃時依舊呈現(xiàn)粉色特征的現(xiàn)象[2]。這進一步表明除了肌紅蛋白化學(xué)狀態(tài)等影響因素外，pH值也是影響肌紅蛋白熱穩(wěn)定性和熟制肉色的重要因素。Nurilmala等[15]

在研究金槍魚肌紅蛋白和馬肌紅蛋白在不同pH值和熱處理溫度條件下的變性曲線時也發(fā)現(xiàn)，高pH值的馬肌紅蛋白熱穩(wěn)定性較強。由圖1B可知，不同孵育時間肌紅蛋白熱變性程度也存在顯著性差異（P＜0.05），隨著孵育時間的延長，肌紅蛋白變性程度逐漸增加，延長加熱時間可以促使肌紅蛋白變性。

2.2 溶液pH值、孵育溫度和孵育時間對肌紅蛋白二級

結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜可用于分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化情況，水的拉曼光譜信號較弱，因此對分析溶液中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)無影響[19]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性會影響肌紅蛋白作為色素蛋白的功能[20]，因此，肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對肉色的穩(wěn)定性具有一定影響。同時二級結(jié)構(gòu)對于其空間構(gòu)象也具有重要影響，多肽鏈中氨基酸殘基之間的相互作用力對空間構(gòu)象起決定作用[21]。肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受多種因素影響，例如紫外照射[22]、超高壓CO2處理[23]、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[24]和加熱處理[25]等。蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)主要有4 種，分別為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。常將拉曼光譜范圍內(nèi)的1 645～1 660、1 665～1 680、1 680～1 690、1 660～1 670 cm－1用于α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的計算[26]。

由圖2A可知，未加熱處理組的2 種pH值條件下，肌紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量之間無明顯差異，且不同孵育時間內(nèi)也無明顯變化，這表明在4 ℃條件下2 種pH值對肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響較小。在72 ℃條件下（圖2B），前2 h孵育期內(nèi)，2 種pH值之間未出現(xiàn)明顯差異，但是孵育4 h后，pH 5.6的肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊相對含量明顯減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)無序性增加，蛋白質(zhì)受熱變性，二級結(jié)構(gòu)被破壞。而pH 6.4的肌紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)在6 h孵育期內(nèi)始終未發(fā)生明顯變化。這說明高pH值條件下的肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性，可以抵御熱處理造成的結(jié)構(gòu)破壞。Moriyama等[27]研究也指出，pH 7.0的肌紅蛋白在加熱至溫度低于75 ℃后再冷卻至室溫，α-螺旋相對含量會完全恢復(fù)至初始值，肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)變化具有可逆性，而在相同的加熱溫度下，延長加熱時間，低pH值的熱逆性喪失，其二級結(jié)構(gòu)改變。因此，高pH值條件下蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更高。

2.3 溶液pH值、孵育溫度和孵育時間對肌紅蛋白紫外-可見光譜的影響

紫外光譜是一種用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的光譜方法。由圖3A～D可知，4 ℃條件下的肌紅蛋白紫外-可見光譜在280 nm處存在紫外吸收峰，主要是由芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）在近紫外區(qū)吸收能量發(fā)生電子躍遷所致[28]。肌紅蛋白中心血紅素鐵的特征峰位于409 nm處，此處峰值變化可直接表示卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的變化情況[29]。

而525～600 nm之間存在2 個吸收峰值，為氧合肌紅蛋白的特征峰[15]。4 ℃條件下，2 種pH值條件下肌紅蛋白的紫外-可見光譜基本重合，且隨孵育時間延長并未出現(xiàn)明顯變化，表明4 ℃條件下溶液pH值對肌紅蛋白的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生明顯影響。除此之外，肌紅蛋白也主要以氧合肌紅蛋白狀態(tài)存在，在孵育期間并未產(chǎn)生特殊變化。因此，在4 ℃孵育6 h過程中，pH值對肌紅蛋白卟啉環(huán)的結(jié)構(gòu)沒有特殊影響。Qian Yingdan等[30]研究pH值對肌紅蛋白血紅素基團結(jié)構(gòu)變化時也發(fā)現(xiàn)，4 ℃孵育時間延長至7 d后才檢測到血紅素基團的氧化還原峰。因此，4 ℃條件下短時間內(nèi)肌紅蛋白的氧化還原反應(yīng)變化不顯著，只有強酸性或強堿性條件才會影響肌紅蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血紅素基團從肌紅蛋白中游離出來[30]。

在加熱條件下，由圖3F可知，經(jīng)過72 ℃孵育2 h后，相對4 ℃條件下，2 種pH值肌紅蛋白溶液在409 nm處的卟啉環(huán)吸收峰值均上升，這可能是因為熱處理增加了肌紅蛋白分子中卟啉環(huán)的暴露程度，改變了血紅素周圍疏水微環(huán)境，使血紅素中的2 價鐵被氧化成高價鐵[31]。但隨著孵育時間的延長，卟啉環(huán)吸收峰值并未發(fā)生明顯變化。而朱姝冉等[32]研究加熱溫度對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)，加熱溫度達(dá)到80 ℃后，卟啉環(huán)特征峰值降低。這與本研究結(jié)果不同，可能是該研究中熱處理溫度較高，導(dǎo)致卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過72 ℃孵育后，原本在525～600 nm的2 個氧合肌紅蛋白的特征峰轉(zhuǎn)變?yōu)?03 nm處的吸收峰，此處為高鐵肌紅蛋白特征峰[15]，表明經(jīng)過加熱孵育，肌紅蛋白逐漸被氧化為高鐵肌紅蛋白，但是2 個pH值組間差異不明顯。

2.4 溶液pH值、孵育溫度和孵育時間對肌紅蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

熒光光譜可反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究[32]。蛋白質(zhì)的熒光主要是由其芳香族氨基酸側(cè)鏈所引發(fā)，其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是蛋白質(zhì)熒光的主要來源，熒光強度的變化反映了熒光氨基酸的微環(huán)境極性變化[33]。如圖4A～D所示，在4 ℃條件下分別孵育0、2、4、6 h后，肌紅蛋白內(nèi)源熒光光譜峰值均位于320～340 nm之間，主要來源于色氨酸和酪氨酸[34]。2 種pH值溶液之間的光譜強度不同。pH 6.4條件下的肌紅蛋白內(nèi)源熒光強度明顯高于pH 5.6。pH 5.6條件下熒光強度較低可能是因為蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)相對稀疏，芳香族氨基酸殘基間的共振能量傳遞降低，熒光強度下降[35]。有研究表明，芳香族氨基酸殘基之間距離為7～10 nm時，氨基酸殘基間的共振能量傳遞會使酪氨酸發(fā)生熒光猝滅[22，36]，

內(nèi)源熒光強度受到影響。而pH 6.4接近肌紅蛋白等電點[37]，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)相對緊密，由酪氨酸殘基向色氨酸殘基的能量轉(zhuǎn)移十分有效[36]，所以熒光強度高于pH 5.6條件下的肌紅蛋白。而酪氨酸作為親水基團分布于肌紅蛋白結(jié)構(gòu)外層，色氨酸作為疏水基團分布于肌紅蛋白內(nèi)側(cè)[25]，內(nèi)源熒光強度差異反映了肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，特別是疏水腔的構(gòu)象變化。疏水腔對血紅素與配體的親和力具有重要影響[23]。從圖4E～H可以明顯看出，經(jīng)72 ℃孵育后，肌紅蛋白在pH 5.6條件下的內(nèi)源熒光強度隨孵育時間的延長逐漸增加。這可能是由于高溫孵育后，肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)展開，熒光氨基酸暴露程度增

加[32]，從而導(dǎo)致其內(nèi)源熒光強度增加。而在pH 6.4條件下，內(nèi)源熒光強度變化并不明顯，且有略微下降的趨勢。這表明高pH值條件下肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)具有更高的熱穩(wěn)定性，而低pH值條件下肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性較低，分子結(jié)構(gòu)更容易受到破壞。這與圖1中肌紅蛋白熱變性程度結(jié)果一致，也可以在一定程度上解釋DFD牛肉熟制過程中的PP現(xiàn)象。

2.5 溶液pH值、孵育溫度和孵育時間對肌紅蛋白表面疏水性的影響

在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中，疏水作用是維持空間結(jié)構(gòu)的重要作用力，同時在蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用中也具有重要影響[38]。因此，蛋白質(zhì)表面疏水性可用于評價蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)的表面疏水程度取決于蛋白質(zhì)表面所暴露出的疏水氨基酸殘基數(shù)量。因疏水氨基酸一般集中在蛋白質(zhì)內(nèi)部，所以表面疏水程度越高，代表蛋白質(zhì)中的疏水氨基酸殘基暴露越多[39]，三級結(jié)構(gòu)越松散。由表1可知，溶液pH值（A）、孵育溫度（B）和孵育時間（C）三因素交互作用對肌紅蛋白疏水性存在顯著影響（P＜0.05）。在4 ℃條件下，2 種pH值肌紅蛋白疏水程度僅在4 h時出現(xiàn)顯著差異，其他孵育時間無顯著差異，而經(jīng)過72 ℃孵育后pH 5.6肌紅蛋白的疏水程度顯著升高（P＜0.05），且隨著孵育時間的延長，疏水程度也逐漸增加（P＜0.05），而pH 6.4肌紅蛋白的疏水程度受溫度影響不顯著（P＞0.05），隨孵育時間的延長，未出現(xiàn)顯著上升。這表明加熱條件下pH 5.6肌紅蛋白的疏水肽段和疏水氨基酸暴露更多[32]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)松散，三級結(jié)構(gòu)展開，疏水程度增大，而高pH值的肌紅蛋白在加熱條件下結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，疏水程度改變較小。

2 種pH值肌紅蛋白隨著高溫孵育時間延長，蛋白質(zhì)表面疏水程度逐漸增加。2 種pH值肌紅蛋白的疏水性變化趨勢與內(nèi)源熒光和肌紅蛋白變性程度結(jié)果一致，表明在加熱條件下低pH值肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)更容易展開，從而導(dǎo)致肌紅蛋白的表面疏水性增加，熱變性程度增大。三級結(jié)構(gòu)的展開使外界環(huán)境對于疏水腔中的血紅素接觸程度增加，肌紅蛋白更容易發(fā)生氧化反應(yīng)，這進一步降低了肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

不同pH值對肌紅蛋白熱穩(wěn)定性和熱變性程度影響顯著。熱處理顯著增加了pH 5.6肌紅蛋白的內(nèi)源熒光強度和蛋白質(zhì)表面疏水性，破壞了其分子的三級結(jié)構(gòu)，從而降低了其熱穩(wěn)定性；且pH 5.6肌紅蛋白α-螺旋和β-折疊相對含量降低，無規(guī)卷曲相對含量增加，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的無序性增加，而pH 6.4 肌紅蛋白結(jié)構(gòu)在熱處理過程中比較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化，受熱處理影響程度較小。因此，環(huán)境pH值可以通過改變肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和血紅素暴露程度，進而改變肌紅蛋白的熱穩(wěn)定性。本研究基于肌紅蛋白結(jié)構(gòu)闡釋了不同pH值對肌紅蛋白熱穩(wěn)定性的影響和DFD牛肉的PP現(xiàn)象，為改善DFD牛肉的PP現(xiàn)象提供了新的研究思路。

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收稿日期：2024-03-20

基金項目：山東省自然科學(xué)基金面上項目（ZR2023MC165）；國家自然科學(xué)基金面上項目（32372384）；

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（肉牛牦牛）建設(shè)專項（CARS-37）；

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項資金項目（YDZX2022135）

第一作者簡介：姚美杰（1997—）（ORCID： 0009-0002-8583-7709），女，碩士，研究方向為肉品科學(xué)與肉類加工。

E-mail： Yaoyuanyuan24@126.com

*通信作者簡介：張一敏（1985—）（ORCID： 0000-0001-5240-7126），女，教授，博士，研究方向為肉品科學(xué)與肉類加工。E-mail： ymzhang@sdau.edu.cn

梁榮蓉（1979—）（ORCID： 0000-0002-8536-1520），女，教授，博士，研究方向為肉品科學(xué)與肉類加工。E-mail： lrr327@126.com