香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌的抑制作用

摘 要：以惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）為對(duì)象，通過(guò)測(cè)定惡臭假單胞菌生長(zhǎng)曲線、群集性、泳動(dòng)性、核酸泄漏情況及產(chǎn)胞外蛋白酶和生物被膜能力等指標(biāo)，考察不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌的抑菌效果。結(jié)果表明：當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)≥0.015%時(shí)，對(duì)惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)胞外蛋白酶和生物被膜能力具有極顯著抑制作用（P＜0.01）；當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí)，惡臭假單胞菌所產(chǎn)生物被膜含量比空白組極顯著減少86.35%（P＜0.01）。香芹酚可通過(guò)抑制生長(zhǎng)、產(chǎn)生物被膜能力及運(yùn)動(dòng)能力破環(huán)細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致大量細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而對(duì)惡臭假單胞菌產(chǎn)生抑菌作用。

關(guān)鍵詞：惡臭假單胞菌；香芹酚；鮮肉保鮮；泳動(dòng)性；群集性

Inhibitory Effect of Carvacrol on Pseudomonas putina

Li Jiawen1， Wu Xuan1， PAN Yajie1， Xiao Longquan1，2， Liu Dayu1， Wang Xinhui1， Xu Gang2， Zhou Chuang1，*

（1. School of Food and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China;

2. Yibin E-Tiange Foods Co. Ltd.， Yibin 644100， China）

Abstract： The inhibitory effect of different volume fractions （V/V） of carvacrol on Pseudomonas putida was investigated through the determination of the growth curve， swarming motility， swimming motility， nucleic acid leakage， the ability to produce extracellular protease and biofilm of P. putida. The results showed that carvacrol at a volume fraction equal to or greater than 0.015% had a significant inhibitory effect on the growth， motility， extracellular protease production and biofilm formation of P. putida （P lt; 0.01）. When the volume fraction of carvacrol was 0.025%， the biofilm production of P. putida was reduced by 86.35% compared with the blank group （P lt; 0.01）. Carvacrol can exert an inhibitory effect on P. putida by inhibiting its growth， biofilm-producing ability and motility， and destroying the permeability of the cell membrane， and thereby resulting in the leakage of a large amount of cellular contents.

Keywords： Pseudomonas putida; carvacrol; meat perseveration; swimming mobility; swarming mobility

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090

中圖分類號(hào)：TS251.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）06-0071-05

引文格式：

李佳玟， 吳軒， 潘雅潔， 等. 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌的抑制作用[J]. 肉類研究， 2024， 38（6）： 71-75. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090. " "http：//www.rlyj.net.cn

LI Jiawen， WU Xuan， PAN Yajie， et al. Inhibitory effect of carvacrol on Pseudomonas putina[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 71-75. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090. " "http：//www.rlyj.net.cn

假單胞菌是導(dǎo)致肉類腐敗變質(zhì)的主要微生物之一，多種假單胞菌作為肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌常被檢出，如惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、莓實(shí)假單胞菌、熒光假單胞菌等[1]，假單胞菌可致高蛋白質(zhì)食品腐敗，如肉及肉制品、乳制品、水產(chǎn)品等，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量，縮短貨架期，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失甚至導(dǎo)致人群食物中毒[2-4]，有效抑制假單胞菌是鮮肉保鮮的關(guān)鍵手段之一。惡臭假單胞菌是一種條件致病菌，廣泛分布于泥土和水體環(huán)境中，有研究表明，在70余批常規(guī)送檢的冷凍肉類中均檢出惡臭假單胞菌[5]。

香芹酚是一種天然的酚類化合物，是百里香和牛至精油的主要成分[6]，香芹酚應(yīng)用較為廣泛，常作為食品防腐劑或香料[7]。香芹酚作為一種天然、安全防腐劑，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局列為公認(rèn)安全的食品成分[8]。研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚具有抗菌活性[9-10]，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等食品中常見(jiàn)的食源性致病菌均具有抑制作用[11-12]。與其他抑菌劑相比，香芹酚具有無(wú)毒、安全性高、抗菌性強(qiáng)等

優(yōu)點(diǎn)[13-14]。Xiao Longquan等[15]以香芹酚、殼聚糖等為原料制備的抗菌膜可將羊肉的保鮮期延長(zhǎng)15 d以上。

目前，對(duì)于惡臭假單胞菌的研究限于藥敏分析、生物學(xué)功能研究等，用天然精油抑制惡臭假單胞菌的研究較少，因此，研究香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌抑制作用十分有意義。本研究以惡臭假單胞菌為研究對(duì)象，對(duì)比不同體積分?jǐn)?shù)的香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌的抑菌效果，并探究香芹酚的抑菌機(jī)制，為香芹酚在肉及肉制品、乳制品、水產(chǎn)品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

惡臭假單胞菌（ATCC 49128） 上海魯微科技有限

公司；香芹酚（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司；Luria-Bertani（LB）營(yíng)養(yǎng)瓊脂、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂粉（生物試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溶菌肉湯（LB肉湯）、乙醇、結(jié)晶紫、脫脂奶粉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）

（分析純） 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2700i紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器蘇州有限

公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

THZ-82水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；

LDZX-75L立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械

公司；TGL-22S高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限

公司；1550酶標(biāo)儀 上海賽默飛世爾儀器有限公司；

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

微生物生長(zhǎng)曲線是描述微生物生長(zhǎng)狀況的基本指標(biāo)[16-17]。將惡臭假單胞菌接種至LB肉湯，放置于水浴恒溫振蕩器中，溫度調(diào)至30 ℃，過(guò)夜培養(yǎng)活化后取出，將OD600 nm調(diào)至約為1.00，置于錐形瓶中，用LB肉湯以1∶100比例稀釋，加入香芹酚，使其最終體積分?jǐn)?shù)分別為0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，各梯度均用體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO助溶，同時(shí)做空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。將樣品置于30 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、26 h時(shí)取樣，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD600 nm。

1.3.2 泳動(dòng)性和群集性測(cè)定

參照丁婷[18]的方法并稍作修改。培養(yǎng)基配制好后，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。搖勻后，各接種3 μL樣品溶液至泳動(dòng)性和群集性平板中央。將平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量菌株蔓延分散距離。

1.3.3 嗜鐵素產(chǎn)生情況測(cè)定

按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。嗜鐵素平板按丁婷[18]的方法配制。培養(yǎng)基凝固后，每孔加入100 μL稀釋的惡臭假單胞菌樣液。將平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量嗜鐵素平板中黃色暈圈的直徑[19]。

1.3.4 胞外蛋白酶的測(cè)定

參照Vijayaraghavan等[20]的方法并稍作修改。LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂滅菌冷卻至約50 ℃后，將LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂與單獨(dú)滅菌的脫脂奶粉混勻，使脫脂奶粉的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，倒平板，并用牛津杯打孔，備用。將惡臭假單胞菌過(guò)夜培養(yǎng)活化，并調(diào)節(jié)OD600 nm約為1.00，按1∶1 000的比例加入到LB肉湯中，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。搖勻后，分別向打孔平板中加入100 μL樣液，將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量3 組脫脂奶粉瓊脂平板中透明圈的直徑。

1.3.5 生物被膜形成能力的測(cè)定

參考Ma Maomao[21]、朱耀磊[22]等的方法并進(jìn)行修改，將惡臭假單胞菌過(guò)夜活化至OD600 nm約為1.00，用LB肉湯以1∶100的比例稀釋，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的菌懸液，同時(shí)做空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。取200 μL上述菌液于96 孔板中，將96 孔板置于30 ℃培養(yǎng)箱下靜置培養(yǎng)24 h，吸去孔中的菌液，殘留生物被膜用200 μL去離子水洗滌3 次。向每個(gè)生物被膜孔添加200 μL 0.1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液，28 ℃染色20 min。染色后的生物被膜用200 μL去離子水沖洗3 次，吸干，最后加入等體積95%乙醇洗脫5 min后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm，以此表征惡臭假單胞菌的生物被膜形成能力。

1.3.6 核酸泄漏量的測(cè)定

參考Ashrafudoulla等[23]的方法并稍作修改。將惡臭假單胞菌接種至肉湯培養(yǎng)基，于28 ℃水浴振蕩器中活化24 h，吸取菌懸液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min后收集沉淀，并用磷酸鹽緩沖溶液洗滌、重懸并調(diào)整菌懸液至OD600 nm約為1.00，按1.3.1節(jié)方法配制含有不同體積分?jǐn)?shù)香芹酚的菌懸液并設(shè)置空白對(duì)照和DMSO對(duì)照。將樣品置于28 ℃水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng)活化，分別于15、30、45、60 min取菌懸液，4 ℃、8 000 r/min離心5 min[24]，使用移液器吸取上清液，并用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD260 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做3 次以上平行重復(fù)，采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.01表示差異極顯著；采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知，空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組惡臭假單胞菌生長(zhǎng)曲線十分相似，在0～6 h生長(zhǎng)迅速。采用香芹酚處理后，惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)速率變緩，且隨著香芹酚含量升高，其生長(zhǎng)受到的抑制愈加明顯。與2 個(gè)對(duì)照組相比，香芹酚體積分?jǐn)?shù)為0.005%時(shí)，惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)受到輕微抑制，香芹酚體積分?jǐn)?shù)為0.010%時(shí)，惡臭假單胞菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)≥0.015%時(shí)，其延遲期延長(zhǎng)至16 h以上，且在16 h以后，其生長(zhǎng)也十分緩慢。結(jié)果表明，當(dāng)香芹酚在體積分?jǐn)?shù)≥0.015%時(shí)對(duì)惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)具有良好的抑制作用。

2.2 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌泳動(dòng)性和群集性的影響

由圖2A可知，空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組的泳動(dòng)性菌落較大，表明惡臭假單胞菌具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動(dòng)距離呈現(xiàn)明顯減小趨勢(shì)，當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)≥0.010%時(shí)，對(duì)惡臭假單胞菌的泳動(dòng)性有明顯的抑制作用。由圖2B可知，隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動(dòng)距離呈現(xiàn)明顯減小趨勢(shì)，當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)≥0.015%時(shí)，對(duì)惡臭假單胞菌的群集性有明顯的抑制作用。結(jié)果表明，香芹酚可明顯削弱惡臭假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力，且體積分?jǐn)?shù)越大，效果越好。Wang Yaying等[25]研究香芹酚對(duì)熒光假單胞菌泳動(dòng)性和群集性的影響發(fā)現(xiàn)，香芹酚對(duì)熒光假單胞菌的運(yùn)動(dòng)有很強(qiáng)的抑制作用，與本研究結(jié)果較為一致。

2.3 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌產(chǎn)嗜鐵素和胞外蛋白酶的影響

由于嗜鐵素平板由鉻天青、十六烷基三甲基溴化銨和鐵離子組成，故呈藍(lán)色（圖3A）。當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生嗜鐵素時(shí)，嗜鐵素平板會(huì)出現(xiàn)淡黃色暈圈，這是由于嗜鐵素對(duì)Fe3＋選擇性黏著，對(duì)Fe3＋具有一定的親和性[26]。由圖3A可知，空白對(duì)照組、DMSO對(duì)照組、0.005%和0.010%組均出現(xiàn)黃色暈圈，且呈逐漸減小趨勢(shì)，0.015%、0.020%、0.025%組均未見(jiàn)黃色暈圈，表明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌產(chǎn)嗜鐵素的能力，且香芹酚含量越高，抑制效果越明顯。

由圖3B可知，平板上的空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組出現(xiàn)較大的白色透明圈，說(shuō)明惡臭假單胞菌分泌的蛋白酶分解了平板中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致白色透明圈的產(chǎn)生。而香芹酚處理后，白色透明圈直徑減小，且香芹酚含量越高，白色透明圈直徑越小，表明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生。由圖3C可知，香芹酚體積分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí)，透明圈直徑比空白對(duì)照組減小31.15%。0.015%、0.020%、0.025%組的透明圈直徑極顯著小于空白對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。由此可知，香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶產(chǎn)生，可有效阻止其對(duì)蛋白質(zhì)的利用，減緩食品腐敗變質(zhì)，在肉及肉制品等高蛋白食品保鮮中具有巨大的應(yīng)用潛力。

2.4 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌產(chǎn)生物被膜的影響

細(xì)菌生物被膜有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌黏著在接觸表面后分泌的多糖類物質(zhì)、脂質(zhì)蛋白、脫氧核糖核酸等組成的復(fù)合物，其包裹方式可有效保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的抵抗力，有利于其在惡劣環(huán)境中生

存[27-30]。由圖4可知，香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌生物被膜的產(chǎn)生呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用。香芹酚含量越高，生物被膜抑制作用越明顯。與空白對(duì)照組相比，當(dāng)用0.015%～0.025%香芹酚處理惡臭假單胞菌后，其產(chǎn)生的生物被膜減少50.9%～86.35%。0.025%組惡臭假單胞菌生物被膜產(chǎn)量極顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌產(chǎn)生物被膜，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。Addo等[31]研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚和桉樹腦可通過(guò)干擾細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力分別抑制金黃色葡萄球菌和陰溝桿菌的生物被膜形成；劉楠[32]也發(fā)現(xiàn)，香芹酚對(duì)熒光假單胞菌的生物被膜有破壞作用。與本研究結(jié)果一致。綜上，香芹酚可以有效抑制惡臭假單胞菌生物被膜的產(chǎn)生能力。

2.5 香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌核酸泄漏的影響

細(xì)胞膜是具有彈性的半透性膜，可選擇性地交換物質(zhì)，菌液中大分子含量變化是反映細(xì)胞膜滲透性變化的重要指標(biāo)，如果大分子含量變化顯著，說(shuō)明細(xì)胞膜可能受到了嚴(yán)重?fù)p壞[33]。由圖5可知，隨著香芹酚含量增加，核酸泄漏量增多；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，惡臭假單胞菌核酸泄漏量增多。經(jīng)香芹酚處理15 min后，0.005%～0.025%組核酸泄漏量比空白對(duì)照組增加41.32%～77.84%；處理45 min后，0.005%～0.025%組核酸泄漏量比空白對(duì)照組增加60.43%～82.97%。香芹酚處理15、30、45、60 min，0.005%～0.025%組核酸泄漏量均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。Zhang Junshun等[34]

研究表明，香芹酚會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，改變其細(xì)胞膜滲透性，導(dǎo)致核酸泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果中，核酸泄漏物變化趨勢(shì)與Ma Maomao等[21]在研究香芹酚和獨(dú)活素對(duì)大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的協(xié)同作用中的變化趨勢(shì)相似，Abdelhamid等[35]研究中也發(fā)現(xiàn)香芹酚能夠抑制沙門氏菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)核酸泄漏，且具有濃度依賴性，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

本研究采用不同體積分?jǐn)?shù)的香芹酚處理惡臭假單胞菌，觀察香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌的抑菌效果。結(jié)果表明，當(dāng)香芹酚體積分?jǐn)?shù)≥0.015%時(shí)，對(duì)惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)胞外蛋白酶和生物被膜能力具有顯著的抑制作用。此外，核酸泄漏結(jié)果表明，香芹酚能夠引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，破壞惡臭假單胞菌的細(xì)胞完整性。綜上所述，香芹酚對(duì)惡臭假單胞菌具有良好的抑制作用，在高蛋白食品如肉及肉制品保鮮中具有巨大的應(yīng)用潛力。

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收稿日期：2024-04-21

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023YFN00140）；宜賓市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022NY021）；

四川省肉羊創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（SCCXTD-2024-14）；達(dá)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（22DWHZ0005）

第一作者簡(jiǎn)介：李佳玟（1999—）（ORCID： 0009-0001-4717-0352），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称放c生物技術(shù)。

E-mail： 1342778969@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：周闖（1968—）（ORCID： 0000-0001-9639-1111），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称放c生物技術(shù)。

E-mail： zhouchuang@cdu.edu.cn