基于遺傳算法-反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白工藝

摘 要：采用高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，對比遺傳算法-反向傳播（genetic algorithm-back propagation，GA-BP）神經(jīng)網(wǎng)絡模型和響應面模型的優(yōu)化效果，確定最佳工藝參數(shù)。結果表明：GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡在模型擬合和預測方面表現(xiàn)優(yōu)于響應面模型；最佳提取參數(shù)為高壓時間23 min、超聲時間22 min、酶添加量3.2%、酶解時間222 min，羊皮膠原蛋白提取率達到（80.5±1.6）%，較傳統(tǒng)的木瓜蛋白酶法提高40%；紫外-可見吸收光譜和傅里葉變換紅外光譜結果顯示，此條件下提取的羊皮膠原蛋白結構完整，高壓-超聲-酶解法對膠原蛋白的破壞較小。

關鍵詞：羊皮；羊皮膠原蛋白；高壓-超聲-酶解法；遺傳算法-反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡；響應面法

Optimization of High-Pressure Ultrasound-Assisted Enzymatic Extraction of Collagen from Sheep Skin Using Genetic Algorithm-Back Propagation Neural Network

ZHU Ming1，2， ZHANG Dequan2， LI Shaobo2， CHEN Li2， HOU Chengli2， CHENG Chengpeng2， YU Jiangying2， GUAN Wenqiang1，*

（1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， School of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce，

Tianjin 300134; 2. Key Laboratory of Agricultural Product Quality， Safety， Storage， Transportation and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Agricultural Product Processing， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

Abstract： This study compared the effectiveness of genetic algorithm-back propagation neural network （GA-BPNN） and response surface methodology （RSM） in optimizing the high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen from sheep skin to determine the optimal process parameters. The results showed that GA-BPNN had superior performance in model fitting and prediction compared to RSM. The optimal extraction parameters were as follows： high pressure holding time of 23 min， ultrasound time of 22 min， enzyme dosage of 3.2%， and hydrolysis time of 222 min. Under these conditions， the extraction rate of collagen from sheep skin was （80.5 ± 1.6）%， which is 40% higher than that of the traditional papain method. The results of ultraviolet-visible （UV-Vis） spectroscopy and Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy demonstrated that the structure of the extract collagen was complete.

Keywords： sheep skin; sheep skin collagen; high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction; genetic algorithm-back propagation neural network; response surface methodology

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111

中圖分類號：TS251.92 " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）06-0042-09

引文格式：

朱明， 張德權， 李少博， 等. 基于遺傳算法-反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白工藝[J]. 肉類研究，

2024， 38（6）： 42-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111. " "http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Ming， ZHANG Dequan， LI Shaobo， et al. Optimization of high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen from sheep skin using genetic algorithm-back propagation neural network[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 42-50.

（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111. " "http：//www.rlyj.net.cn

我國作為全球最大的羊肉生產(chǎn)和消費國，2023年羊肉產(chǎn)量達到531萬 t，比2013年增加30.12%，高于同期世界羊肉平均增長水平。伴隨著羊肉產(chǎn)量的增加，羊皮等加工副產(chǎn)物也隨之增加。據(jù)統(tǒng)計，我國每年約產(chǎn)出3億 張羊皮，但羊皮加工率不足10%，造成極大的資源浪費[1]。羊皮主要成分為水、蛋白質(zhì)、少量脂肪和礦物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量超過30%，且以膠原蛋白為主[2]。膠原蛋白具有較高的營養(yǎng)價值及良好的親水性、生物相容性和生物降解性等，還具有保護細胞、促進傷口愈合、抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性等功效[3]，可作為肉凍、糖果的增稠劑、改善冰淇淋口感的發(fā)泡劑，也可加工成可降解薄膜材料等[4]，在食品領域具有廣闊的應用前景。

目前，膠原蛋白提取方法主要包括酸法、堿法、熱水法和酶法等[5]。傳統(tǒng)的酸、堿法提取方式存在破壞膠原蛋白結構、影響其生物活性和功能性，提取過程中產(chǎn)生的廢液污染環(huán)境等問題；酶解法因具有良好的反應選擇性、對膠原蛋白破壞較小、提取產(chǎn)品純度高而被廣泛采用。單一酶解法存在提取率低、提取時間長、成本高等缺點，常與化學方法相結合，以彌補傳統(tǒng)提取方法的不足[6-7]。高壓可通過破壞細胞結構促進膠原蛋白展開，從而提高提取率。已有較多高壓提取蛋白方法的報道，如高壓提取鯰魚肌原纖維蛋白、高壓輔助超聲提取紅巨藻藻紅蛋白等[8]。超聲波通過在液體中產(chǎn)生強烈的湍流，從而增強傳質(zhì)，提高化學反應速率，進而提高提取率，縮短提取時間[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，堿可能會削弱膠原中的氫鍵并破壞部分共價鍵，因此在堿處理過程中，超聲輔助會破壞膠原結構[9]。傳統(tǒng)酶法獲得的膠原蛋白產(chǎn)量較低，但木瓜蛋白酶可以裂解端肽區(qū)域的肽，可在一定程度上提高膠原蛋白產(chǎn)量[5]。超聲輔助酶法可有效提高膠原蛋白產(chǎn)量和純度，縮短提取時間。在超聲輔助胃蛋白酶提取牛肌腱膠原時，與僅使用酶法相比，超聲輔助提取效率和所得膠原質(zhì)量均有所提高[9]。

反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡是應用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡模型之一，但其運行具有一定的隨機性，每次運行結果存在差異。遺傳算法（genetic algorithm，GA）是一種模擬生物進化過程的優(yōu)化算法，通過模擬自然選擇、交叉和變異過程搜索最優(yōu)解[10-11]。為進一步提升BP神經(jīng)網(wǎng)絡性能，采用GA對BP神經(jīng)網(wǎng)絡的網(wǎng)絡權重和偏置進行優(yōu)化，使BP神經(jīng)網(wǎng)絡最終預測值的均方誤差（mean square error，MSE）最小化，從而獲得最優(yōu)BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型。GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡和響應面法均可用于優(yōu)化生產(chǎn)工藝。綜上，本研究擬采用高壓-

超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，以高壓（121 ℃、100 kPa）時間、超聲（4 ℃、140 W）時間、酶添加量、酶解時間為因素，以膠原蛋白提取率為評價指標，對比分析GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型和響應面模型在羊皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化中的效果，確定羊皮膠原蛋白的最佳提取參數(shù)，以期為羊皮膠原蛋白的提取和開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊皮源于云南省云上黑山羊，采集后置于－80 ℃冷凍柜保存?zhèn)溆谩?/p>

木瓜蛋白酶（300 000 U/g）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量檢測試劑盒、MD1444-5m 透析袋（截留分子質(zhì)量14 000 Da） 北京索萊寶科技有限公司；乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HV-501高壓蒸汽滅菌器 日本Hirayama公司；Powersonic 520超聲波清洗機 韓國HST公司；LGJ-12A真空冷凍干燥機 北京四環(huán)起航科技有限公司；EMS-19磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；UV-1700紫外分光光度計 日本島津公司；FT/IR-4100分光光度計 日本Jasco公司；Spectra Max 190全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；PL2002電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Sorvall Lynx 6000超速離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FCR1000-UF-E超純水機 青島富勒姆科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊皮膠原蛋白制備

1.3.1.1 羊皮預處理

去除羊皮樣品表面毛發(fā)和皮下脂肪，將其剪成1 cm×1 cm小塊，35 ℃蒸餾水清洗2 次，5 倍體積脫脂溶液（40 ℃溫水和1 mol/L碳酸鈉（2∶1，V/V））浸泡10 min，再次用蒸餾水清洗，重復此步驟2 次，即可得脫脂羊皮樣品，真空冷凍干燥。稱取10 g干燥后的羊皮樣品，在4 ℃、體積分數(shù)1.5%鹽酸中浸泡5 h，料液比1∶5（g/mL）[11-12]。

1.3.1.2 高壓-超聲-酶解法和傳統(tǒng)酶解法提取羊皮膠原蛋白

高壓-超聲-酶解法（聯(lián)合處理組）提取羊皮膠原蛋白：參考王艷茹[8]、Sun Man[9]等的方法并修改，采用1 mol/L氫氧化鈉溶液將1.3.1.1節(jié)酸提液pH值調(diào)節(jié)至6，高壓（121 ℃、100 kPa）處理，冷卻后進行超聲處理（4 ℃、140 W）。然后按照酶解溫度51 ℃、pH 6.0、木瓜蛋白酶添加量4%、酶解時間240 min進行酶解[13-14]。將上清液轉(zhuǎn)移至透析袋（14 000 Da），將透析袋放入10 倍體積蒸餾水中，持續(xù)攪拌透析48 h，每4 h換1 次水，最后進行冷凍干燥，從而得到羊皮膠原蛋白[15]。

傳統(tǒng)酶解法（對照組）提取羊皮膠原蛋白：采用1 mol/L氫氧化鈉溶液將1.3.1.1節(jié)酸提液pH值調(diào)節(jié)至6，

木瓜蛋白酶添加量4%、酶解溫度51 ℃、酶解時間240 min[11-12]。其余過程同上。

1.3.2 單因素試驗設計

在超聲時間30 min、酶添加量4%、酶解時間240 min條件下，考察高壓時間（15、20、25、30、35 min）對羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時間20 min、酶添加量4%、酶解時間240 min條件下，考察超聲時間（15、20、25、30、35 min）對羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時間20 min、超聲時間30 min、酶解時間240 min條件下，考察酶添加量（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）對羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時間20 min、超聲時間30 min、酶添加量4%條件下，考察酶解時間（150、180、210、240、270 min）對羊皮膠原蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計4因素3水平的組合試驗，以提取率為指標進行優(yōu)化，響應面試驗因素及水平如表1所示。

1.3.4 羊皮膠原蛋白提取率測定

稱取約0.2 g羊皮膠原蛋白凍干樣品于玻璃管，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉。加入2 mL 6 mol/L鹽酸溶液，煮沸2～6 h，消化至沒有大的可見團塊，冷卻后用10 mol/L NaOH溶液（約1 mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8，蒸餾水定容至4 mL，25 ℃、10 000×g離心20 min。首先，上清液加入0.1 mL氧化劑溶液（7 g/100 mL氯胺T和乙酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液的混合物，1∶4（V/V），pH 6），充分混合[16-17]；然后加入1.3 mL Ehrlich試劑溶液（2 g對二甲氨基苯甲醛溶于3 mL 60%（V/V）高氯酸溶液，按照體積比3∶13與異丙醇混合）；最后將混合物于60 ℃水浴加熱20 min，不斷攪拌，然后在自來水中冷卻2～3 min。酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長為560 nm，以HYP質(zhì)量濃度（0.2～30.0 μg/mL）為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標制作標準曲線，線性方程為

y＝0.018 5x＋0.001 6，以羊皮、凍干樣品吸光度計算其HYP含量，單位為μg/g，由HYP含量計算膠原蛋白含量[18]。

羊皮膠原蛋白提取率按照下式計算：

式中：m1為提取的膠原蛋白質(zhì)量/g；m0為羊皮中膠原蛋白質(zhì)量/g。

1.3.5 紫外-可見光譜測定

將羊皮膠原蛋白凍干樣品溶解于0.3 mol/L乙酸溶液，配制成2 mg/mL膠原蛋白溶液，置于1 cm比色皿中，在200～300 nm波長范圍內(nèi)對其進行掃描[19]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

將羊皮膠原蛋白凍干樣品與干燥的溴化鉀以1∶100（m/m）混合，研磨并壓成顆粒，將樣品置于樣品室，紅外光譜掃描范圍400～4 000 cm－1，分辨率1 cm－1?；邗０稩帶峰（1 600～1 700 cm－1）的積分面積，使用二階導數(shù)和反卷積計算二級結構的相對含量[20]。

1.3.7 神經(jīng)網(wǎng)絡分析

GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型結合了GA和BP算法，GA用于優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)，BP算法用于對神經(jīng)網(wǎng)絡進行訓練[21]。

基于Matlab R2018b軟件，將響應面試驗數(shù)據(jù)用于訓練神經(jīng)網(wǎng)絡模型，建立包含輸入層、隱含層和輸出層的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型。利用GA確定最佳隱含層節(jié)點數(shù)，以提高模型的預測性能[22-23]。以相關系數(shù)（R2）、平均絕對誤差（mean absolute error，MAE）、MSE、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、平均絕對百分比誤差（mean absolute percentage error，MAPE）為模型性能評價指標，選擇合適的模型進行提取工藝條件優(yōu)化[24-25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

提取率測定設置3 次平行實驗，數(shù)據(jù)表示為±s。采用Excel 2022、IBM SPSS 20、GraphPad Prism 10.2軟件進行數(shù)據(jù)分析、單因素方差分析、Duncan多重檢驗和圖形繪制，采用Design Expert 8.0軟件對Box-Behnken設計結果進行響應面分析。使用Matlab R2018b軟件訓練優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡模型。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 高壓時間對羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1A可知，隨高壓時間延長，羊皮膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，高壓處理20 min時，提取率達到最大值（64.4%）。這可能是因為短時間高壓處理可有效破壞細胞結構，促進膠原蛋白提取，而長時間高壓處理則可能導致膠原蛋白結構凝聚，從而抑制后續(xù)的酶解反應，降低膠原蛋白提取率。有研究表明，超高壓處理對牛蛙皮膠原蛋白特性有顯著影響，低壓水平下膠原蛋白分子的熱穩(wěn)定性增加，但高壓水平下的結果相反[15，17]。因此，選擇高壓時間15～25 min進行后續(xù)響應面試驗。

2.1.2 超聲時間對羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1B可知，隨超聲時間延長，羊皮膠原蛋白提取率迅速增加，在20 min時達到最大值（67.5%），隨后提取率開始下降。研究表明，適當?shù)某曁幚砜梢蕴岣叩鞍踪|(zhì)提取率，但過長的超聲時間可能會導致膠原蛋白提取率降低，這可能是由于超聲空化作用增加導致蛋白質(zhì)表面活性位點暴露或破壞，從而阻礙了進一步的酶水解反應[16，26]。此外，超聲波的機械作用和熱效應會引起膠原蛋白變性和降解，從而導致膠原蛋白提取率進一步下降[27]。因此，選擇超聲時間15～25 min進行后續(xù)響應面試驗。

2.1.3 酶添加量對羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1C可知，酶添加量從2.0%增加到3.0%時，膠原蛋白提取率顯著提高（P＜0.05），在酶添加量3.0%時，提取率達到最大值（70.38%）。這可能是因為酶添加量低于3.0%時，隨著木瓜蛋白酶的增加，底物與酶之間充分結合，提高了膠原蛋白提取率[28]；當酶添加量超過3.0%時，膠原蛋白與酶的結合位點達到飽和，因此隨著酶添加量的進一步增加，膠原蛋白提取率不再增加?？紤]到成本問題，選擇酶添加量2.5%～3.5%進行后續(xù)響應面試驗。

2.1.4 酶解時間對羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1D可知，酶解時間從150 min延長到240 min時，膠原蛋白提取率顯著提高（P＜0.05），在酶解時間240 min時，提取率達到最大（73.31%）。當酶解時間小于240 min時，底物與酶充分結合，酶促反應充分，提取率隨提取時間延長而提高；酶解時間240～270 min時，膠原蛋白與酶結合趨于飽和，提取率隨酶解時間緩慢下降，而且，酶解時間過長，膠原蛋白結構可能遭到破壞，生成小分子多肽。因此，綜合考慮時間成本和膠原蛋白提取率，選擇酶解時間210～270 min進行后續(xù)響應面試驗。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果分析

根據(jù)單因素試驗結果設計響應面試驗，各組試驗方案及結果如表2所示。使用Design Export 8.0分析得到提取條件和膠原蛋白提取率的回歸方程：Y＝74.56－3.34A－0.87B＋1.39C－3.33D＋0.99AB＋1.32AC＋3.10AD＋4.22BC－0.01BD－2.61CD－8.91A2－13.42B2－11.03C2－9.51D2。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項P＝0.436 5＞0.05，表明該模型顯著[29]。

R2＝0.971 5，表明膠原蛋白提取率受高壓時間、超聲時間、酶添加量和酶解時間的影響，R2接近1，表明預測值與實際值較為吻合。變異系數(shù)為3.98，遠小于10，說明模型離散度低，可信度高。校正決定系數(shù)R2Adj＝0.934 2，表明二次回歸模型適當，能夠準確描述不同參數(shù)對羊皮膠原蛋白提取率的影響[30]。

根據(jù)表3中的F值可知，高壓時間（A）、超聲時間（B）、酶添加量（C）、酶解時間（D）對羊皮膠原蛋白提取率影響顯著（P＜0.05），特別是高壓時間（A）和酶解時間（D）對提取率影響高度顯著（P＜0.000 1），4 個因素對提取率的影響程度順序為高壓時間＞酶解時間＞酶添加量＞超聲時間。二次交互項AD、BC、CD的P＜0.05，說明高壓時間和酶解時間、超聲時間和酶添加量、酶添加量和酶解時間之間的交互作用對提取率影響顯著。

圖2為各因素之間的交互作用對提取率影響的三維響應面圖，通過Design export 8.0分析，確定較佳工藝參數(shù)為高壓時間23.18 min、超聲時間20.05 min、酶添加量3.06%、酶解時間237.42 min。在此條件下，羊皮膠原蛋白提取率預測值為79.61%，實驗結果顯示實測值為（74.19±1.20）%，與預測值相對誤差為7.3%。

2.3 GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化結果分析

利用Matlab R2018b軟件對響應面試驗結果進行神經(jīng)網(wǎng)絡分析，以高壓時間、超聲時間、酶添加量和酶解時間作為輸入神經(jīng)元，通過算法確定隱藏神經(jīng)元數(shù)，提取率作為輸出神經(jīng)元，對神經(jīng)網(wǎng)絡進行訓練和測試[31]。隱藏層節(jié)點數(shù)代表神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化次數(shù)，將隱藏層節(jié)點數(shù)代入神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行訓練[32]，訓練后的MSE如圖3所示，當隱藏層節(jié)點數(shù)為7時，訓練集MSE最小，為0.049 1，因此，選擇隱藏層節(jié)點數(shù)為7。

隨機選取Box-Behnken設計29 組數(shù)據(jù)中的80%用于訓練，其余數(shù)據(jù)用于驗證[33]。在訓練過程中，將模型的學習率設置為1 000，經(jīng)過不斷迭代訓練減小誤差，由圖4可知，當?shù)螖?shù)為6時，總體的MSE最小，為0.033 1，此時的模型滿足訓練誤差要求。

由圖5可知，經(jīng)過GA優(yōu)化后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型回歸圖的擬合程度提高，R2從0.889 5提高至0.998 2，根據(jù)Matlab R2018b分析可知，預測準確性由88.79%提高至98.84%。

由圖6可知，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型在訓練、驗證、測試和全部數(shù)據(jù)集上的R2分別為0.972 7、0.950 6、0.909 5和0.953 3，接近1，說明所構建的GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型具有良好的擬合能力。因此，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型。

為提高GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型性能和收斂速率，經(jīng)過多次迭代分析最優(yōu)和平均權重參數(shù)，得到最大適應度值。通過對高壓時間、超聲時間、酶添加量和酶解時間進行調(diào)整，得到提取率的最高值和最低值[34]。如圖7所示，經(jīng)過59 次迭代，在第13次迭代模型獲得最大適應度值，確定較佳工藝參數(shù)為高壓時間23.4 min、超聲時間22.3 min、酶添加量3.21%、酶解時間222.02 min，此條件下，提取率預測值為81.69%。

2.4 響應面模型和GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型對比分析

由圖8可知，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的R2較高，而MAE、MSE、RMSE和MAPE均低于響應面模型，即GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型對羊皮膠原蛋白提取率的預測能力更強，預測誤差更小。驗證實驗結果顯示，響應面和GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測的最優(yōu)提取率與實際值之間的相對誤差分別為5.25%和1.21%，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型具有較高的準確性。因此，選擇GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型作為最佳模型，最優(yōu)提取條件為高壓時間23.4 min、超聲時間22.3 min、酶添加量3.21%、酶解時間222.02 min，在此條件下，羊皮膠原蛋白提取率為（80.5±1.6）%。

2.5 羊皮膠原蛋白紫外可見光譜分析

根據(jù)紫外掃描光譜圖，不僅能判斷所提取膠原蛋白中是否含有酪氨酸等生色團，還能判斷多肽鏈中非螺旋端肽的完整性[35]。如圖9所示，2 種提取方式下的膠原蛋白都表現(xiàn)出鐘形光譜，在240 nm處顯示出主要的吸收峰，與Tan Yuqing等[36]所研究的豬皮膠原蛋白（235 nm）、海參膠原蛋白（236.5 nm）、鱘魚皮膠原蛋白（235 nm）的最大吸收峰相近，符合I型膠原蛋白的最大紫外吸收特征。2 種提取方式下的膠原蛋白在280 nm處均無吸收峰。Zinchenko等[37]的研究表明，酪氨酸和苯丙氨酸是敏感的發(fā)色團，能夠吸收280 nm處的紫外線，當膠原蛋白被提取和純化時，該特性用于表征非螺旋端肽和其他蛋白質(zhì)污染物的完整性。以上結果顯示，最優(yōu)工藝條件下，高壓和超聲處理未破壞膠原蛋白的完整性，聯(lián)合處理組和對照組提取的膠原蛋白均符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征。

2.5 羊皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

由圖10可知，對照組和聯(lián)合處理組的酰胺A帶分別為3 307 cm－1和3 240 cm－1，高壓和超聲處理可能通過削弱氫鍵影響膠原蛋白的三螺旋結構[19]，與對照組相比，聯(lián)合處理組酰胺A帶出現(xiàn)紅移，這與氫鍵延伸振動有關。當氫鍵在NH和官能團之間形成時，峰向低波數(shù)移動。這一發(fā)現(xiàn)與Nan Jie等[15]報道的高壓處理后酰胺A帶位置變化的結果一致。酰胺B帶與—CH2的不對稱拉伸振動有關，對照組和聯(lián)合處理組的膠原蛋白吸收峰分別為2 955 cm－1和2 923 cm－1，這表明高壓處理導致的蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)減少[18]。酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）主要與參與羰基拉伸振動的氫鍵強度有關[18]，結果表明，對照組在1 620 cm－1處觀察到峰帶，聯(lián)合處理組在1 639 cm－1處觀察到峰帶，即聯(lián)合處理幾乎沒有改變酰胺I帶波峰的位置。酰胺II帶（1 550～1 600 cm－1）與N—H彎曲和C—N振動有關，酰胺III帶（1 210～1 230 cm－1）

與膠原蛋白三螺旋結構的完整性有關，峰值強度比（酰胺III帶與1 450 cm－1附近吸收峰強度之比）為1.05～1.14，則膠原蛋白的三螺旋結構完整[35]。對照組與聯(lián)合處理組在1 210 cm－1與1 230 cm－1附近的峰值強度比分別為1.06和1.10，接近I型膠原蛋白的特征值1.0。由此可見，2 種方法提取的膠原蛋白二級結構和三螺旋結構基本保持完整，與傳統(tǒng)的提取方法相比，復合法對膠原蛋白的破壞較小。

3 結 論

本研究采用高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，在單因素試驗結果基礎上進行響應面試驗，獲取GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型所需的訓練、測試和驗證數(shù)據(jù)。結果表明：GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型比響應面模型具有更好的擬合和預測能力，最佳提取工藝條件為高壓時間23 min、超聲時間22 min、酶添加量3.2%、酶解時間222 min，在此條件下羊皮膠原蛋白提取率為（80.5±1.6）%，與模型預測值相近；通過紫外-可見吸收光譜和傅里葉變換紅外光譜確定了此條件下提取的羊皮膠原蛋白結構的完整性。相較于傳統(tǒng)的酶解提取法，高壓-超聲-酶解法將提取時間從傳統(tǒng)的5 d縮短至3 d，提取率從40%提升至80%[4，11]。而且，與傳統(tǒng)的提取方法相比，聯(lián)合法無需大量化學試劑，從根源上降低了污染物殘留風險。另外，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型可有效應用于羊皮膠原蛋白高壓-超聲-酶解提取工藝研究，為活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化提供技術支持。本研究結果可為羊皮資源的高值化利用提供參考。

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收稿日期：2024-05-10

基金項目：云南省重大科技專項計劃項目（202102AE090039）

第一作者簡介：朱明（1999—）（ORCID： 0009-0002-5114-4867），女，碩士研究生，研究方向為副產(chǎn)物多元開發(fā)利用。

E-mail： zm147qwe@163.com

*通信作者簡介：關文強（1974—）（ORCID： 0000-0001-8663-5725），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

E-mail： gwq18@163.com