汝州市犬細小病毒的PCR檢測及VP2基因序列分析

摘" 要：為了解汝州市犬細小病毒的流行和變異情況，本研究調查了汝州市3家動物診所接診的20例疑似感染犬細小病毒病例。PCR結果顯示，15份樣本為犬細小病毒陽性。VP2蛋白氨基酸序列分析結果顯示：12株犬細小病毒的基因亞型為CPV-2c，3株犬細小病毒的基因亞型為CPV-2a；分離得到的15株犬細小病毒其氨基酸序列同源性為99.1％～100.0％，與疫苗株的同源性為97.5％～98.6％，與其他國內(nèi)外參考毒株的同源性為98.0％～100.0％；分離的12株CPV-2c型毒株與我國廣西等地分離的CPV-2c型毒株具有較近的親緣關系；分離的3株CPV-2a型毒株與我國廣州等地分離的CPV-2a型毒株屬于同一支。對汝州市犬細小病毒的流行調查，為該地區(qū)犬細小病毒病的防控提供了理論基礎。

關鍵詞：犬細小病毒；VP2基因；檢出率；進化分析

基金項目：河南省本科高校青年骨干教師培養(yǎng)計劃項目（項目編號：2023GGJS178）

作者簡介：雷晨昱（1982－ ），女，助教，碩士，主要研究方向為動物疫病病原分子免疫；E-mail：toffee.lei@163.com

犬細小病毒是一種經(jīng)糞-口途徑傳播的、致犬發(fā)生胃腸道和心肌疾病的病原體[1]。犬細小病毒自20世紀70年代后期出現(xiàn)以來，在全球范圍內(nèi)持續(xù)傳播[2]。目前，我國大部分城市的犬細小病毒病得到了有效的控制，但在縣城或鄉(xiāng)鎮(zhèn)，該病在幼犬和青年犬上仍頻繁發(fā)生，甚至在接種過疫苗的犬上也有發(fā)生，嚴重影響當?shù)貙櫸锝?jīng)濟的發(fā)展[3]。

犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）屬于細小病毒科原細小病毒屬，基因全長5 323 bp，有2個開放閱讀框，共編碼4種蛋白。第一個開放閱讀框編碼NS1和NS2兩種非結構蛋白，NS1蛋白是病毒DNA復制的前提，NS2蛋白促進病毒顆粒從細胞中釋放；第二個開放閱讀框編碼VP1和VP2兩種結構蛋白，VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP3蛋白是由VP2蛋白在酶作用下裂解形成[2]。犬細小病毒的核衣殼由VP1蛋白和VP2蛋白共同組成，VP2蛋白是犬細小病毒的關鍵區(qū)域，與犬細小病毒顆粒的感染性、血凝性等密切相關，其關鍵堿基和氨基酸序列的變化可能導致病毒發(fā)生變異[4]。犬細小病毒為單股線狀DNA病毒，易發(fā)生突變，經(jīng)過這些年的進化，形成了CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、New CPV-2a、New CPV-2b等新的基因型[5]。1983年，徐漢坤等[6]首次報道了犬細小病毒性腸炎，之后犬細小病毒病開始在我國流行。目前CPV-2a和CPV-2b是我國比較流行的毒株[7]。另外，關于New CPV-2a毒株的報道增多，該毒株毒力強并且傳播速度快[7]。目前，犬細小病毒在中國寵物臨床上呈現(xiàn)多重感染的情況。

近年來，關于犬細小病毒流行病學調查的研究不多，為了解汝州市犬細小病毒的流行毒株和變異情況，本研究從該地區(qū)3家動物診所收集有腹瀉、嘔吐癥狀病犬的既往病歷信息，分析檢出率；擴增VP2基因，進行測序和同源性分析。從宏觀水平和分子水平，對汝州市犬細小病毒的流行特點和分子特征進行監(jiān)測和評估，以期為該地區(qū)犬細小病毒病的防控提供理論基礎。

1" 材料與方法

1.1 調查對象和方法

汝州市3家動物診所作為調查地點，診所接收的20只有腹瀉、嘔吐癥狀的疑似患犬細小病毒病的犬作為調查對象，采集犬糞便或肛門拭子。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴增儀購自賽默飛世爾科技公司。TGel藍光凝膠成像系統(tǒng)購自天根生化科技有限公司。病毒DNA/RNA基因組快速提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。2×Taq PCR Master Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 病毒基因組DNA提取

按照病毒DNA/RNA基因組快速提取試劑盒操作說明，對糞便樣本進行DNA提取，－20 ℃保存。

1.4 引物合成

根據(jù)GenBank公布的VP2基因序列，設計2對引物（表1），引物CPV-1F和CPV-1R用于犬細小病毒的常規(guī)檢測；引物C-VP2-2F和C-VP2-2R用于CPV VP2基因全序列擴增。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 樣本PCR檢測

PCR反應體系為：樣本DNA 1.0 μL、引物各0.4 μL、2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL、ddH2O 7.2 μL，總反應體系20.0 μL。反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，40個循環(huán)，72 ℃ 7 min；4 ℃保存。取6 μL PCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 VP2基因擴增和測序

PCR反應體系同1.5步驟。反應條件：預變性95 ℃ 2 min，變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃ 12 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳。將擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司（天津分公司）測序。

1.7 CPV VP2氨基酸序列分析

使用DNAStar（EditSeq）將基因序列翻譯為氨基酸序列，與GenBank上已發(fā)布的30株國內(nèi)外犬細小病毒（16株國內(nèi)分離的CPV-2c型、CPV-2a型、New CPV-2a型和CPV-2b型毒株，11株國外分離的CPV-2c型和CPV-2b型毒株，3株商品化疫苗株）的氨基酸序列進行對比分析。使用DNAStar對氨基酸序列進行同源性比較，分析氨基酸變異情況，確定分離的CPV毒株基因型[8]。使用MEGA-X-10.0.5繪制系統(tǒng)進化樹。

2" 結果

2.1 犬細小病毒檢出率

PCR結果顯示，20個樣本中有15個擴增出特異性條帶，片段大小與預期結果一致。測序為VP2基因，檢出率為75％。

2.2 VP2基因擴增結果

以部分陽性樣本為模板進行VP2基因全序列擴增，大小為1 755 bp。結果顯示，目的條帶大小與預期結果一致。

2.3 毒株亞型分析

將15株犬細小病毒分離株的VP2基因序列翻譯成氨基酸序列，詳細命名見表2。參考犬細小病毒分型標準，確定CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15毒株297位氨基酸為S，426位氨基酸為N，屬于CPV-2a亞型；CPV-RZ-01、CPV-RZ-04、CPV-RZ-05、CPV-RZ-06、CPV-RZ-07、CPV-RZ-08、CPV-RZ-09、CPV-RZ-10、CPV-RZ-11、CPV-RZ-12、CPV-RZ-13、CPV-RZ-14毒株出現(xiàn)了370 （Q→R）、426（N→E）、440（A→T）氨基酸突變，屬于CPV-2c亞型。

2.4 VP2主要氨基酸位點突變分析

從表2可以看出，與CPV-2c參考株（MH660525）相比，12株CPV-2c亞型分離株相對較為保守，VP2蛋白的氨基酸序列沒有發(fā)生突變。CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15除關鍵位點發(fā)生了突變外，與參考株（M24003）相比，還存在氨基酸突變，有D511E處突變。

2.5 同源性分析

結果表明，15株犬細小病毒分離株間的氨基酸同源性在99.1％～100.0％，分離株與疫苗株的氨基酸同源性在97.5％～98.6％，與國內(nèi)16株犬細小病毒的氨基酸同源性在98.6％～100.0％，與境外11株犬細小病毒的氨基酸同源性在98.0％～100.0％（圖1）。

2.6 系統(tǒng)進化樹分析

采用MEGA-X-10.0.5軟件構建VP2蛋白氨基酸的遺傳進化樹，由圖2可知，CPV-RZ-01、CPV-RZ-04、CPV-RZ-05、CPV-RZ-06、CPV-RZ-08、CPV-RZ-09、CPV-RZ-10、CPV-RZ-11、CPV-RZ-12、CPV-RZ-14、CPV-RZ-15、CPV-RZ-17與我國廣西、黑龍江、沈陽等地分離的CPV-2c型毒株的親緣關系比較近，與烏拉圭、西班牙、克羅地亞、意大利分離的CPV-2c型毒株不屬于同一支；CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-20與我國廣州、哈爾濱等地分離的CPV-2a型毒株屬于同一支；15株分離株與3株疫苗株屬于不同的分支，親緣關系較遠。

3" 討論

雖然臨床上CPV-2型疫苗被廣泛使用，但是變異株仍在犬科動物間變異、傳播[9]。本試驗從河南省汝州市3家動物門診的15份樣本中擴增得到12株CPV-2c亞型毒株，3株CPV-2a亞型毒株。2020年，韓國首次報道了CPV-2c亞型，現(xiàn)階段全球多數(shù)地區(qū)均有CPV-2c亞型的報道[10]。2010年以前，我國主要流行CPV-2a亞型[11]，之后，我國廣西、吉林、北京[12]等地發(fā)現(xiàn)CPV-2c亞型。本試驗從河南省汝州市檢測到的毒株主要是CPV-2c亞型，說明該地區(qū)主要流行CPV-2c亞型，這為該地區(qū)犬細小病毒病的防控提供了理論基礎。

VP2基因是犬細小病毒的重要毒力基因，決定著病毒的抗原性、血凝性和宿主范圍[13]。本試驗以15份樣本為模板分別擴增VP2基因，序列比對結果顯示與GenBank已發(fā)布VP2基因序列的同源性都在99％以上。氨基酸序列比對顯示，CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15毒株有D511E處突變，可能是由境外傳入或是現(xiàn)有基因型進化而來。在意大利和尼日利亞的報道中，描述到亞洲存在一種以VP2蛋白中存在特定氨基酸殘基（5Gly、267Tyr、324Ile、370Arg）為特點的CPV-2c基因組變體[14-15]，并在上海的報道中描述過該特征的變異毒株[16]，這與我們得出的結果一致，證明在河南省汝州市流行的CPV-2c毒株是亞洲新的CPV-2c變異毒株。通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析可知，犬細小病毒在進化中形成了不同的分支，檢測的CPV-2c亞型毒株與烏拉圭、西班牙、克羅地亞、意大利的6株CPV-2c亞型毒株不在同一分支上，與國內(nèi)的CPV-2c亞型毒株親緣關系近，與李少晗等[17]在北京的調查結果一致。林瑜婷等[4]在對河南方城縣的調查中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)已出現(xiàn)CPV-2c亞型的突變毒株，結合本試驗結果表明，CPV-2c亞型的突變毒株是該地區(qū)主要流行的毒株。這對河南省使用CPV-2型疫苗對新的CPV-2c亞型突變毒株保護效果的評估很重要。此外，應加強河南省犬細小病毒變異情況的流行病學調查，特別是對CPV-2c亞型的監(jiān)測，對實時調整河南省犬細小病毒病的防控措施有重要意義。

4" 結論

對犬細小病毒VP2基因序列分析發(fā)現(xiàn)，汝州市主要流行CPV-2c亞型毒株，該毒株屬于亞洲CPV-2c亞型的變異毒株，具體情況還需要進一步研究。本調查了解了河南省汝州市犬細小病毒的流行情況，充實了河南省犬細小病毒的流行信息，為該地區(qū)犬細小病毒病的防控工作提供了理論依據(jù)。

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