基于CRISPR技術(shù)的雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性研究

摘" 要：雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是一種急性呼吸道疾病，具有很高的傳染性。該病的發(fā)病率不高，但發(fā)病后可導致雞生長緩慢、產(chǎn)蛋率降低等，嚴重影響家禽業(yè)的健康發(fā)展。早期診斷和綜合防治是控制該病的有效方法，因此，本文就如何有效地防治雞傳染性支氣管炎進行了探討與分析。

關鍵詞：CRISPR技術(shù)；雞傳染性支氣管炎；耐藥性

作者簡介：李軍琪（1988－ ），男，高級獸醫(yī)師，主要從事基層畜牧獸醫(yī)工作；E-mail：xumuweishi@yeah.net

隨著我國規(guī)?；⒓s化飼養(yǎng)技術(shù)的進步，雞的飼養(yǎng)量大幅提升，但高密度飼養(yǎng)也導致各種疾病的發(fā)生。雞傳染性支氣管炎在全國范圍內(nèi)均有發(fā)生，不論規(guī)模大小，發(fā)病率均較高。南方的雞場發(fā)病率較北方的高。雞傳染性支氣管炎具有一定的季節(jié)性，可在不同季節(jié)發(fā)生。該病具有很強的傳染性，如果不能進行有效控制，很難達到很好的控制效果。多年的飼養(yǎng)經(jīng)驗表明，飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理、疾病預防措施與該病的發(fā)生、流行之間存在著密切的關系。

1" 病原學

雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV）所引起的一種急性、高度接觸性傳染病。IBV是一種單股負鏈RNA病毒，病毒粒子呈囊泡狀和球形，具有較差的耐溫性，56 ℃下15 min即死亡，但在低溫下能存活很久[1]。IBV也會發(fā)生突變，突變株在傳染性和防控方面與原有毒株有很大差異，不僅造成防控更加困難，而且容易出現(xiàn)新的血清型和變種。這些變種可以在患病雞氣道內(nèi)大量繁殖，嚴重影響呼吸道的結(jié)構(gòu)和功能，有些毒株甚至會侵害腎臟、生殖器官，引發(fā)病變。

IBV可通過飼料和飲水途徑進行傳播，不同品種、年齡和性別的雞均易感，但1～4周齡的雞更易感，且發(fā)病率更高。IB一年四季都有發(fā)生，主要發(fā)生在冬春季節(jié)。

2" 臨床癥狀

2.1 呼吸型傳染性支氣管炎

喘氣、氣管啰音、咳嗽、打噴嚏、流鼻液等是雛雞患有傳染性支氣管炎的典型癥狀。在條件差的雞舍中，容易發(fā)生支原體、大腸桿菌、副嗜血桿菌等多種病原體的混合感染，造成雞群出現(xiàn)較大的傷亡?；疾‰u表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減退、羽毛蓬亂、昏睡、怕冷、下痢等癥狀[2]。6周齡以上及成年雞感染IBV后，會出現(xiàn)輕微的呼吸癥狀，死亡率下降，甚至無死亡；產(chǎn)蛋母雞感染后，會出現(xiàn)產(chǎn)蛋率和蛋殼品質(zhì)下降，軟殼和畸形蛋增多，蛋白偏??；患病蛋雞的產(chǎn)蛋率降低程度與雞群所處的產(chǎn)蛋期及所感染毒株的毒性有關。

2.2 腎型傳染性支氣管炎

腎型傳染性支氣管炎多見于10周齡以內(nèi)的幼年雞，成年雞中很少見。在發(fā)病早期，患病雞無明顯的臨床癥狀，僅有輕度的呼吸癥狀，接著死亡率急劇上升，病死雞體表呈深紫色；患病雞群食欲增加，出現(xiàn)白色水樣腹瀉。本病常在雞群中延續(xù)很久，有時可超過兩周。

2.3 腺胃型傳染性支氣管炎

在發(fā)病初期，患病雞沒有什么特別的臨床癥狀，但隨著時間的推移，食欲越來越差，情緒也變得低落，表現(xiàn)為無精打采，羽毛蓬松，排便量越來越少，直到死亡。在感染期，各類疫苗都無法產(chǎn)生良好的免疫效果，有些疫苗甚至會出現(xiàn)免疫失敗。在良好的環(huán)境管理和飼料營養(yǎng)狀況下，雞的發(fā)病率較小，即使發(fā)生，病程也較短[3]。

3" 特征性剖檢病變

發(fā)生呼吸型傳染性支氣管炎時，患病雞的氣管和竇腔中可發(fā)現(xiàn)漿狀、卡他性或酪性分泌物；氣囊有輕微的渾濁和增厚；灰紅色的病變多發(fā)生在肺門處，或靠近支氣管。

發(fā)生腎型傳染性支氣管炎時，患病雞腎水腫，呈灰白色，尿酸沉積于小管，呈一條白線，腎切面可見乳白色的細顆粒狀分泌物；尿酸鹽沉淀導致的輸尿管擴大。如果病情較重，在心包膜、心外膜、肝表面、氣管黏膜、氣囊可見白色的鈣尿酸鹽。

發(fā)生腺胃型傳染性支氣管炎時，患病雞腺胃體積較大，在漿膜表面可見膨大的腺胃腺；腺胃黏膜水腫、出血；在乳頭根部有環(huán)狀出血，偶有腺胃乳頭破裂，呈彈坑狀；腎腫大，有斑點。

患有傳染性支氣管炎的產(chǎn)蛋雞，剖解后通常可見卵泡系帶松弛，卵泡扁平、橢圓形，同時輸卵管子宮部位會有黏膜水腫等情況?；疾‰u在幼年期感染，剖檢可見其卵巢發(fā)育良好，并有大量的卵泡排出，卵黃破裂；可能是輸卵管發(fā)育不全，僅有子宮、陰道部分存在，造成輸卵管內(nèi)積水[4]。

4" 基于規(guī)律成簇的規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)的雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性概述

IBV的耐藥性是指病毒對多種藥物的敏感性變差，包括藥物治療和疫苗接種。IBV的耐藥性會影響疫苗的免疫效果。研究表明，IBV耐藥株中編碼蛋白的基因發(fā)生了顯著的改變。研究表明，某些IBV基因在其遺傳變異過程中發(fā)生了改變，導致其對抗生素產(chǎn)生抗藥性。這些研究為未來針對IBV的耐藥性分析奠定了基礎。利用CRISPR/CRISPR（CRISPR associated，Cas）蛋白9（CRISPR/Cas9）技術(shù)，對不同基因型IBV在不同組織中的耐藥情況進行分析，有助于深入了解不同IBV對抗生素耐藥的分子機制，為抗生素耐藥性檢測提供重要信息。

為此，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對IBV進行了檢測，為建立快速的IBV耐藥性檢測方法提供了新思路。

首先，我們從雞組織中分離得到IBV，并通過反向遺傳技術(shù)對IBV進行遺傳變異分析。結(jié)果顯示，通過反向遺傳技術(shù)獲得的IBV對多種藥物具有耐藥性。其次，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)在雞組織中鑒定了IBV的耐藥突變位點。通過反向遺傳技術(shù)獲得的IBV耐藥突變位點與傳統(tǒng)方法獲得的變異位點存在較大差異。再次，我們對兩種變異類型的IBV進行了比較，結(jié)果表明耐藥突變位點在兩種變異類型之間存在差異。最后，我們通過實時熒光定量PCR技術(shù)對IBV在不同組織中的藥物敏感性進行了分析。結(jié)果表明，反向遺傳獲得的IBV對多種藥物有耐藥性，其變異位點主要分布在感染細胞中。對IBV耐藥突變位點進行分析，可以有效識別并鑒定IBV的耐藥性。

基于CRISPR/Cas9技術(shù)的IBV耐藥性檢測方法已經(jīng)被廣泛應用于細菌耐藥性的研究，但目前僅在小鼠模型中得到了驗證。因此，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了一種快速、簡便、敏感的IBV耐藥性檢測方法，并利用該方法對不同基因型IBV在不同組織中的藥物敏感性進行了分析[5]。

5" 基于CRISPR技術(shù)優(yōu)化雞IBV耐藥性的舉措

目前，IBV的耐藥機制研究主要集中在耐藥基因的定位與克隆、耐藥基因的功能驗證及分子機制解析。因此，可以利用CRISPR/Cas技術(shù)，在獲得高質(zhì)量病毒基因組的基礎上，對病毒的耐藥性進行篩選和驗證。為了解決雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性問題，可以對病毒基因組進行優(yōu)化設計，并選擇合適的方法對其進行提取、純化和測序。對基因組中不利于藥物篩選的基因進行剔除或替換。也可以對CRISPR/Cas系統(tǒng)中不同靶點進行改造，增加靶向基因的數(shù)量，優(yōu)化設計出更加高效、安全的基因編輯系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)提高雞胚致死率。還可以通過在不同宿主細胞中，建立相應的病毒基因組表達系統(tǒng)，并將表達系統(tǒng)引入到病毒基因組中，利用該系統(tǒng)對病毒基因組進行調(diào)控，使其產(chǎn)生新的基因突變。

在細胞水平上，可以通過測定病毒基因突變后的毒力，并通過免疫原性試驗、疫苗免疫效果評價等方法，對基因突變后的病毒毒力進行評價。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)進行藥物篩選也是目前研究病毒耐藥性的一個重要方法。然而，目前CRISPR/Cas系統(tǒng)用于篩選藥物的方法還存在一定的局限性。因此，需要尋找一種更為高效、安全的方法進行藥物篩選工作，以提高藥物篩選的準確性。

6" 總結(jié)

目前，基于CRISPR技術(shù)的IBV耐藥性研究仍處于初期階段，相關研究還不夠深入。未來的研究工作應深入到IBV基因的功能研究，特別是基因表達調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等方面，將這些機制闡明，有助于進一步揭示IBV耐藥性的形成機制和規(guī)律，為今后優(yōu)化IBV耐藥性提供理論基礎，同時也可為臨床藥物的研發(fā)提供重要參考。

參考文獻

[1] 李倩．雞傳染性支氣管炎病毒血清學和分子生物學檢測技術(shù)研究進展[J]．畜禽業(yè)，2023，34（9）：12-14.

[2] 莊金秋，阮震，張穎，等．雞傳染性支氣管炎病毒血清學和分子生物學檢測技術(shù)研究進展[J]．中國動物檢疫，2018，35（7）：74-77.

[3] 趙秀美，周生，姜逸，等．雞傳染性支氣管炎病毒輔助蛋白研究進展[J]．中國家禽，2022，44（1）：97-101.

[4] 王金萍，路宏朝，張濤，等．CRISPR/Cas9技術(shù)在雞抗病毒感染中應用的研究進展[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)（下半月），2022（2）：28-34，41.

[5] 馬得瑩，范佳慧，任夢婷，等．不同毒力傳染性支氣管炎病毒誘導SPF雞炎癥反應的免疫機制[J]．東北農(nóng)業(yè)大學學報，2023，54（1）：60-69.