宜賓4 個品種早茶葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的比較分析

摘 要：為了比較宜賓不同品種早茶葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)，以種植面積較廣的4 個早茶品種為材料，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，分別從其老葉和嫩葉中分離內(nèi)生細菌，并經(jīng)16S rDNA 序列分析對其進行鑒定. 結(jié)果表明，從4 個品種早茶葉中共分離到內(nèi)生細菌336 株，歸類于18 個屬23 個種. 從內(nèi)生細菌數(shù)量和多樣性來看，黃芽早gt;福鼎大白gt;中茶302gt;中茶108，且均為嫩葉gt;老葉. 微桿菌屬Microbacterium 和黃單胞菌屬Xanthomonas 在4 個品種早茶葉中均有分布，且都集中或僅存在于嫩葉，其中Microbacterium 為絕對優(yōu)勢菌群. 各種早茶老葉和嫩葉還有各自的優(yōu)勢菌屬短小桿菌屬Curtobacterium 等或特異性菌種短小芽胞桿菌B. pumilus、磷酸鐮孢菌F. phosphorivorans 等. 說明不同品種早茶葉內(nèi)生細菌種類組成有明顯的相似性，也存在一定的品種或組織專一性. 這些內(nèi)生細菌及其分布規(guī)律可能在較大程度上促成了宜賓早茶的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)以及各品種早茶的不同品質(zhì)特征.

關(guān)鍵詞：宜賓；早茶；可培養(yǎng)內(nèi)生細菌

中圖分類號：Q939.11

DOI： 10.19504/j.cnki.issn1671-5365.2024.06.10

茶樹（Camellia sin ensis （L.） O. Kuntze）為山茶科、山茶屬的木本經(jīng)濟作物. 中國的茶葉種植面積和產(chǎn)銷量多年來穩(wěn)居世界首位，尤其是以宜賓產(chǎn)地為代表的早茶已成我國重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品[1-2]. 隨著物質(zhì)生活水平的提高，以及茶文化的深遠影響，人們對茶葉的需求量不斷增加，且對茶葉的品質(zhì)有更高的要求. 茶葉的色、香、味等主要品質(zhì)特征及農(nóng)殘量，是茶葉等級評價的依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)，直接影響其消費量[3-4]. 因此，要想提高茶葉市場競爭力，不僅要追求更高的茶葉產(chǎn)量，還需進一步控制農(nóng)殘和改善茶葉品質(zhì).

研究表明，茶樹的內(nèi)生菌不僅能促進宿主生長，還能增強其抗病蟲害能力等[5-6]. 有文獻報道，內(nèi)生菌對茶葉品質(zhì)的形成有很大的貢獻. 一方面，茶葉內(nèi)生菌可參與或調(diào)節(jié)宿主植物茶樹葉內(nèi)活性物質(zhì)的代謝，從而影響茶葉品質(zhì)成分的組成；另一方面，在制茶過程中，部分內(nèi)生菌會參與茶葉的發(fā)酵，產(chǎn)生或降解某些滋味物質(zhì)[7-8]. 不同品種以及同一品種不同生長地的茶樹，對環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力與有害因子的抗性，以及茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)等皆有較大差異[9-12]. 由此推知這些差異在較大程度上與茶樹內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)有關(guān). 宜賓市地處四川盆地南緣，金沙江、岷江、長江橫穿全市，氣候溫和，雨量充沛，長年溫差不大，無霜期達300 天以上，特別適宜茶樹生長，已成為全國最大的生態(tài)早茶基地和出口茶生產(chǎn)基地，茶葉種植面積廣且品種豐富[2，13]. 得天獨厚的自然條件，孕育了世界不可復(fù)制的茶業(yè)生態(tài)，使得宜賓早茶具有“形美、色綠、湯亮、味醇、香雅、早優(yōu)雙絕”特色品質(zhì)而享譽世界[2]. 因此宜賓地區(qū)的茶樹可能存在與其他地域環(huán)境完全不同的潛在內(nèi)生細菌物種資源. 而對這些內(nèi)生菌資源加以開發(fā)利用，最首要的一環(huán)就是分離鑒定.

茶樹內(nèi)生菌的分離鑒定相關(guān)研究起步較晚. 相對較早的是朱育菁等于2008 年從采自福建寧德地區(qū)的大白毫和福云六號茶葉中分離到包括紅桿菌屬、微桿菌屬、根瘤菌屬、貪噬菌屬的16 株細菌和1株真菌[14]. 后來陳百文、汪立群等相繼從黃觀音、福鼎大白茶、紫鵑、云抗10 號等不同品種的茶樹中分離了內(nèi)生菌[15-16]. 鄭世仲，鄧曉旭，劉姣姣等分別從茶樹葉片、根組織中分離到了對茶樹膠孢炭疽菌、腐皮鐮刀菌和輪斑病菌有較好抑制效果的內(nèi)生細菌[6，17-18]. 但針對“中國早茶之鄉(xiāng)”——宜賓的不同品種茶樹及其不同組織部位展開較為系統(tǒng)全面的內(nèi)生菌分離鑒定研究還鮮見報道.

本研究立足于“重要經(jīng)濟作物-茶葉”和“新型生物資源-內(nèi)生細菌”兩大要素，以宜賓4 個代表性的早茶品種為材料，比較研究其老葉和嫩葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)，明確茶葉內(nèi)生細菌在不同品種茶樹和不同組織部位的分布規(guī)律，為進一步探究內(nèi)生細菌對宜賓茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)等的影響提供依據(jù)，亦可為優(yōu)質(zhì)茶葉生產(chǎn)過程中合理實施必要的微生物調(diào)控提供新的微生物來源.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黃芽早、中茶108、中茶302 和福鼎大白4 個品種早茶樹鮮葉，于2022 年夏采自宜賓市金秋湖鎮(zhèn)川茶生產(chǎn)基地. 每個試驗早茶品種，均隨機采集10 株以上無病蟲害、生長健壯的茶樹鮮葉樣品，分老葉和芽葉，每株間隔20 m 以上. 樣品存放在采樣袋中低溫保存，帶回實驗室后立即開展內(nèi)生細菌分離.

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒

選取健康茶樹鮮葉，用自來水沖洗干凈，晾干表面多余水分，用75% 乙醇浸泡1 min，3%～5% 的次氯酸鈉消毒6～10 min（不同茶葉略有不同），無菌水沖洗3～4 次，并將最后一次沖洗液涂布于培養(yǎng)基上，26～28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察平板有無菌落長出，以檢測消毒是否徹底.

1.2.2 內(nèi)生細菌的分離、純化

將消毒后的鮮茶葉用無菌剪刀剪成0.5～1 cm見方的組織小塊，接種于不同培養(yǎng)基上，組織塊緊貼培養(yǎng)基表面，每皿均勻放置6～8 塊，老、嫩茶葉各接30 個平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 天. 根據(jù)平板上菌落形態(tài)特征的差異，對茶葉內(nèi)生細菌進行初步篩選. 用接種針挑取不同的單菌落，平板劃線3～5次，培養(yǎng)至純菌株.

1.2.3 內(nèi)生細菌的鑒定

使用TSINGKE DNA 提取試劑盒（通用型）提取和純化菌株DNA. 具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行. 以所提DNA 為模板，細菌16S rDNA 通用引物27F： 5'～GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG～3'和1492R： 5' ～TACGGCTACCTTGTTACGAC～3'進行PCR 擴增. PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 模板1 μL，引物各2 μL，1×TSE101 金牌mix 45μL.PCR 擴增程序為：98 ℃預(yù)變性3 min；循環(huán)：98 ℃，10 s；55 ℃，15 s；72 ℃，15 s/kb，39 個循環(huán)；7 2 ℃延伸5 min；4 ℃保存. PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京擎科生物科技有限公司完成測序.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Contigexpress 軟件將測序得到的內(nèi)生細菌株的2 條序列進行校對、拼接，把拼接好的序列提交至NCBI 進行BLAST 分析，比較DNA 的同源性，完成菌株16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種早茶葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量

通過分離純化共得到茶葉內(nèi)生細菌336 株，其中黃芽早嫩葉109 株、老葉14 株；福鼎大白嫩葉64株、老葉23 株；中茶302 嫩葉60 株、老葉22 株；中茶108 嫩葉38 株、老葉6 株（如圖1，因分離到的茶葉內(nèi)生細菌總的數(shù)量較大，文中僅列出來自每種鮮茶葉樣品的1 株內(nèi)生細菌的菌落形態(tài)）.從可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量來看，不同品種茶樹及其老葉和嫩葉間均有較大差異，表現(xiàn)為黃芽早gt;福鼎大白gt;中茶302gt;中茶108，在同一品種內(nèi)，皆為嫩葉gt;老葉.

2.2 菌株的16S rDNA 擴增

提取茶葉內(nèi)生細菌的基因組DNA，PCR 擴增16S rDNA 序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一約1500 bp 長的片段（如圖2，因分離到的茶葉內(nèi)生細菌總的數(shù)量較大，對應(yīng)的PCR 圖譜太多，文中僅列出4個品種茶葉部分內(nèi)生細菌的電泳條帶，其余菌株的條帶位置與圖中一致）.

2.3 不同品種早茶葉可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種類及分布

通過測序與同源序列分析，4 種茶樹葉中共鑒定到23 種細菌，分別為磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum、微桿菌Microbacterium proteolyticum、短小桿菌Curtobacterium oceanosedimentun、胞囊桿菌Cytobacillusfirmus、解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽胞桿菌Bacillus pumilus、卡瓦拉農(nóng)桿菌Agrobacteriumcavarae、莫氏土壤桿菌Agrobacterium larrymoorei、黃單胞菌Xanthomonas sacchari、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌Klebsiellaoxytoca、金黃桿菌Chryseobacterium camelliae、燕麥?zhǔn)乘峋鶤cidovorax avenae、赫氏草螺菌Herbaspirillum hut?tiense、草螺菌Herbaspirillum aquaticum、坎皮納斯類芽孢桿菌Paenibacillus campinasensis、燦爛類芽胞桿菌Paenibacillus lautus、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotroph?omonas maltophilia、沼澤短芽孢桿菌Brevibacillus lim?nophilus、薔薇菌Rossellomorea marisflavi、彎曲芽孢桿菌Priestia flexa、伽馬變形桿菌Gamma proteobacterium、云南微球菌Micrococcus yunnanensis、磷酸鐮孢菌Fictibacil?lus phosphorivorans，其中黃芽早嫩葉鑒定到6 種菌，屬水平上分布于微桿菌屬Microbacterium、黃單胞菌屬Xanthomonas、克雷伯氏菌屬Klebsiella、金黃桿菌屬Chryseobacterium、食酸菌屬Acidovorax、類芽孢桿菌屬Paenibacillus，老葉8 種，分布于Microbacterium、短小桿菌屬Curtobacterium、胞囊桿菌屬Cytobacillus、土壤桿菌屬Agrobacterium、Paenibacillus、薔薇菌屬Rossello?morea、普里斯特氏菌屬Priestia、Gamma；福鼎大白嫩葉9 種，分布于Microbacterium、Agrobacterium、Xan?thomonas、Chryseobacterium、Acidovorax、草螺菌屬Her?baspirillum、Paenibacillus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus，老葉3 種，分布于Microbacterium、Curtobacterium、Paeniba?cillus；中茶302 嫩葉7 種，分布于Microbacterium、Cyto?bacillus、芽孢桿菌屬Bacillus、Xanthomonas、Herbaspiril?lum、Paenibacillus，老葉5 種，分布于Microbacterium、Her?baspirillum、Paenibacillus、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotroph?omonas；中茶108 嫩葉7 種，分布于Microbacterium、Agrobacterium、Xanthomonas、Acidovorax、Herbaspirillum、微球菌屬Micrococcus，老葉1 種，假芽孢桿菌屬Fictiba?cillus（如圖3-圖4）.從物種多樣性來看，仍是黃芽早gt;福鼎大白gt;中茶302gt;中茶108，且除了黃芽早的老葉與嫩葉物種多樣性比較接近外，其余3 個品種早茶均為嫩葉gt;老葉.

4 個不同品種早茶樹的葉有2 個共有內(nèi)生細菌屬，Microbacterium 和Xanthomonas，其中Microbacterium為共有優(yōu)勢菌屬，但在不同品種茶葉中存在數(shù)量和種的差異，黃芽早嫩葉有M. proteolyticum 90 株，占可培養(yǎng)內(nèi)生細菌總數(shù)的82.57%；老葉有M. testaceum18株，相比嫩葉該屬內(nèi)生菌數(shù)量雖不算多，但占老葉的內(nèi)生細菌總數(shù)近一半，42.86%；中茶108 有M. proteo?lyticum 14 株，還有同屬的M. testaceum18 株，但都存在于嫩葉，該屬菌株共占嫩葉內(nèi)生細菌總數(shù)的84.21%；福鼎大白嫩葉有M. testaceum 43 株，占嫩葉細菌總數(shù)67.19%，.老葉有M. proteolyticum，僅3 株；中茶302 中只有M. testaceum，嫩葉50 株，占比達83.33%，老葉10株，與黃芽早的老葉相似，也達到該組織內(nèi)生細菌總數(shù)近一半，45.45%. 對Xanthomonas 而言，在4 個不同品種早茶中都僅在于其嫩葉. 此外，每個品種早茶的葉中還存在各自不同種類的優(yōu)勢內(nèi)生細菌屬，如福鼎大白嫩葉中的Chryseobacterium，老葉中的Curto?bacterium. 尤其是中茶108 老葉中的優(yōu)勢菌屬Fictiba?cillus，是在該組織中分離到僅有的1 個屬，也是其特有菌屬. 相較于其余茶葉品種，黃芽早茶葉同時擁有4 個特異種屬，其中Rossellomorea、Priestia、Gamma 分布在老葉，Klebsiella 存在其嫩葉中. 福鼎大白嫩葉有1 個特有屬Brevibacillus；中茶302 老葉和嫩葉各有1個特有屬，分別為Stenotrophomonas 和Bacillus. 中茶108 嫩葉也有1 個特有屬Micrococcus.

3 結(jié)論與討論

本研究從宜賓4 個不同品種早茶的葉中共分離到內(nèi)生細菌336 株，歸類于18 個屬，23 個種. 其中Microbacterium 在4 個品種均有分布，且占比最高，為絕對優(yōu)勢菌群，但都主要集中在嫩葉，如在黃芽早嫩葉中的M. proteolyticum，占老葉和嫩葉組織中該屬菌株總數(shù)的93.75%，福鼎大白和中茶302 的嫩葉中均為M. testaceum，分別占葉內(nèi)該屬菌株總數(shù)的93.48%和83.33%；而中茶108 葉中的M. proteolyticum 和M.testaceum，全部存在于嫩葉中，占葉內(nèi)該屬菌株總數(shù)的100%. 朱育菁等從福建寧德地區(qū)的大白毫和福云六號茶葉也分離到幾種較多數(shù)量的Microbacterium 屬內(nèi)生細菌，且也都來自嫩葉[14]. 后來汪立群等以栽植于安徽省舒城縣德昌苗木有限公司苗圃的3 年生無性系紫娟茶樹較嫩的第3 葉為試驗材料，也分離到一些Microbacterium 屬的內(nèi)生細菌株[16]. 但兩者所分離到的茶葉內(nèi)生細菌Microbacterium 屬在數(shù)量和占比上都遠沒有在宜賓的這4 個早茶品種多，且在同屬內(nèi)的種水平上也存在一些差異. 說明Microbacterium 在茶樹中是較普遍存在的內(nèi)生菌屬，且其分布表現(xiàn)出組織差異性，單從葉組織來看，主要分布在嫩葉. 但不同品種或生長在不同地域的茶樹，其葉中的Micro?bacterium 屬內(nèi)生細菌又存在數(shù)量或種類的差異. 推測除了物種本身的遺傳因素外，這可能還與茶樹生長的地域環(huán)境不同有較大關(guān)系. 據(jù)文獻報道，Micro?bacterium 菌屬可固氮、溶磷以及產(chǎn)植物生長激素，從而能促進植物生長，同時在重金屬耐受與植物病蟲害防治等也表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛能[19-21]. 如張志斌等的研究發(fā)現(xiàn)分離自東鄉(xiāng)野生稻葉組織的內(nèi)生菌株KlspL18，與M. proteolyticum RZ36T 相似度為97.64%，能產(chǎn)IAA 高達291.7 mg.L-1 菌株發(fā)酵液[22].余海忠等從襄麥冬中分離篩選到磚紅色微桿菌M.testaceum，還能產(chǎn)生其宿主植物的主要活性成分甾體皂苷，可能存在與宿主植物相同或相似的代謝途徑，進而影響著植物代謝產(chǎn)物的含量[23]. 根據(jù)以上分析，可以判斷宜賓早茶中葉存在的較大比例的M. proteo?lyticum 與M. testaceum 對茶樹的生長、抗逆性及茶葉品質(zhì)成分等方面可能產(chǎn)生了重要影響.

此外，X. sacchari 在4 個茶葉品種也皆有分布，且僅存在于各品種早茶的嫩葉中. 從已發(fā)現(xiàn)的來自其他物種植物的X. sacchari 內(nèi)生細菌來看，該種菌也具有較多生物學(xué)功能. 如郭鶴寶從水稻種子中分離培養(yǎng)到內(nèi)生細菌群X. sacchari，能分泌IAA，促進水稻和擬南芥幼苗的生長；除此之外，還對番茄青枯以及水稻白葉枯細菌病原菌具有拮抗作用，并能通過莖葉的侵染定殖水稻體內(nèi)，且未發(fā)現(xiàn)該類群對水稻具有致病性，因此認為該菌具備用于生物肥料生產(chǎn)的基本條件[24]. 據(jù)此可以推測宜賓早茶嫩葉中的X. sac?chari 在促進茶樹生長與芽葉萌發(fā)，增強茶樹抗病蟲害能力，提高茶葉產(chǎn)量方面也許發(fā)揮了較大作用.

本研究結(jié)果還顯示，除了4 種早茶共有的內(nèi)生細菌種群外，各品種茶樹的老葉和（或）嫩葉還有各自的優(yōu)勢菌屬或特異性菌屬，而這些內(nèi)生細菌也許是茶葉生長習(xí)性、品質(zhì)特征等形成的又一促成因素，如中茶302 嫩葉中的B. pumilus. 梁靜娟等從廣西北部灣紅樹林海洋淤泥中篩選到的B. pumilus PLM4 具有產(chǎn)生抗腫瘤多糖的能力[25]. 孫迅等從34 株細菌中篩選到菌株B. pumilus H-101 高產(chǎn)木聚糖酶[26]. 羅晶晶等的研究結(jié)果表示，通過在萎凋過程中添加木聚糖酶等外源酶能改變茶葉中的某些化學(xué)成分，如茶多酚、茶氨酸等物質(zhì)有明顯增加，而可溶性糖有減少[27]. KOMERA Irene 等利用重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)B. pumilus 來源的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能高效合成L-茶氨酸[28]. 因此，中茶302 嫩葉中的B. pumilus 極有可能對茶葉中諸如茶氨酸、茶多酚、茶多糖等物質(zhì)成分的含量產(chǎn)生了一定的影響. 再如108 老葉的特異性菌群F. phosphorivorans，同時也是從中分離到僅有的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種群. 袁梅等從湖南水稻根部中分離到編號為sd352 的一株F. phosphorivorans 內(nèi)生細菌，以及郭雨晴等從荒漠珍稀植物根際土中分離到的編號為HD3 的該種菌株，皆有較顯著的促生作用[29-30]. 當(dāng)然除了以上著重分析的內(nèi)生菌群外，還有本研究中一些較少提及的內(nèi)生細菌，其對茶樹潛在的生物學(xué)功能尚不清楚，有待進一步研究.

綜上，不同品種茶樹葉內(nèi)生細菌分布規(guī)律的不同，但又存有相似，可能在一定程度上造就其在生長特點和茶葉品質(zhì)方面的共性和差異. 除了物種的遺傳背景以外，生態(tài)環(huán)境與種植條件等是其重要影響因素. 宜賓是世界茶葉原產(chǎn)地之一，土質(zhì)優(yōu)良，具有非常適合茶樹生長且有別于他地的生態(tài)環(huán)境，加之茶葉基地的管理標(biāo)準(zhǔn)化、生態(tài)化，使得宜賓早茶采摘早、采期長，茶葉香高味爽、病蟲害少、衛(wèi)生安全[2].本研究中4 種宜賓早茶葉均以Microbacterium 為絕對優(yōu)勢菌屬，以及X. sacchar 都僅存在于各品種早茶嫩葉的內(nèi)生細菌分布特點，可能是宜賓早茶具有上述品質(zhì)的共同原因. 此外，同在宜賓種植的不同品種早茶在生長狀況、茶葉產(chǎn)量和香氣、滋味等感官品質(zhì)方面又有各自不同的特點，這可能與各品種的共有內(nèi)生細菌屬的占比不同以及優(yōu)勢或特異性內(nèi)生細菌種屬的差異有關(guān). 由此看來，若對這些來源于宜賓茶葉生態(tài)的內(nèi)生細菌，尤其是那些經(jīng)推測有促進茶樹生長和提高茶葉品質(zhì)的潛力菌株開展進一步研究，有望從中挖掘出有利于茶葉提質(zhì)增產(chǎn)的功能菌株，并將在茶產(chǎn)業(yè)及其相關(guān)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景.

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【編校：許潔】

基金項目：四川省科技廳面上項目（2021YJ0292）；固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室開放基金（2018GTJ002）；香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室開放基金（2018XLZ006）