冬小麥根際細菌多樣性及其促生活性

摘 要：以分離自新疆冬小麥根際的36 株細菌為研究對象，通過16S rRNA 基因序列測定、系統(tǒng)進化分析研究其多樣性，并檢測其溶磷和固氮活性. 結果發(fā)現(xiàn)： （1）36 株菌分布于3 門5 綱11 目14 科14 屬，其中α-變形菌門和放線菌綱為優(yōu)勢菌門（各占總菌株數(shù)的47.2%），紅球菌為最主要的優(yōu)勢菌屬（占總菌株數(shù)的36.1%），并有一個潛在的新物種；（2）以磷酸鈣為底物，定性檢測表明待測菌株中50.0% 具有溶磷活性，定量測定的5 株優(yōu)選菌中菌株57 溶磷活性最高（11.5 mg/L）；（3）66.7% 菌株具有固氮活性，其中45.8% 具有較強固氮活性.

關鍵詞：冬小麥；根際細菌；多樣性；促生活性

中圖分類號：Q939.96

DOI： 10.19504/j.cnki.issn1671-5365.2024.06.17

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizo?bacteria， PGPR）是一類生活在植物根系表面，能夠促進植物吸收和利用養(yǎng)分、對危害宿主植物健康的病蟲害具有抑制活性作用的有益微生物[1]. PGPR 可通過直接作用，如固氮、解磷、解鉀，或產生植物生長調節(jié)物質，促進根系生長，提高對土壤中有效養(yǎng)分及水分的吸收效率[2]. PGPR 還可與植物有害菌競爭養(yǎng)分和生存空間、抑制病原菌生長，誘導植物對病原菌產生抗性[3]. 因此，開展植物根際促生菌資源的收集與挖掘，對開發(fā)植物促生菌劑、微生物肥料，實現(xiàn)土壤生態(tài)健康可持續(xù)化發(fā)展具有重要意義.

小麥是一種重要的禾本科糧食作物，在我國廣泛種植. 近年來，與小麥根際促生菌的相關研究較多，如苜蓿根瘤菌對小麥莖長、莖重和根重有一定的促生作用[4]，根際促生菌能誘導小麥苗期的抗旱性[5]、提高小麥產量[6]等作用. 然而，人們對地處歐亞大陸腹地新疆小麥根際促生菌的報道較少，相關認識有限. 新疆屬干旱半干旱地區(qū)、溫帶大陸性荒漠氣候，該區(qū)域農田土壤鹽漬化和次生鹽漬化較為嚴重[7]. 因此，收集和挖掘該區(qū)域特有的、能很好適應其特殊生態(tài)環(huán)境的植物根際促生菌，對干旱區(qū)農業(yè)綠色高效發(fā)展意義深遠. 本研究擬以分離自新疆和田地區(qū)冬小麥根際、在含3% NaCl 培養(yǎng)基上正常生長的36 株細菌為研究對象，以16S rRNA 基因為標記對其進行鑒定，并檢測其溶磷、固氮活性，以期為干旱區(qū)農業(yè)微生物資源收集與挖掘提供依據.

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗所用菌株分離自2019 年3 月中旬通過抖根法從新疆墨玉縣加汗巴格鄉(xiāng)冬小麥根際采集的土樣. 分離純化的菌株制備成20% 甘油細胞懸液，凍存于-80 oC 超低溫冰箱中.

1.2 儀器與設備

立式高壓蒸汽滅菌器（LDZX-50L，上海申安）；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-50，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；恒溫搖床（LYZ-100B，上海龍躍搖床）；低速離心機（LC-LX-L60D，武漢力振科技有限責任公司）；PCR 擴增儀（ABI-2720，天津金思德生物技術有限公司）；分光光度計（UV1600A 型，尤尼科（上海）儀器有限公司）.

1.3 方法

（1）菌株活化. 取適量甘油管保藏的菌種懸液，分別轉接無機磷細菌培養(yǎng)基和解磷培養(yǎng)基上，置于30oC 培養(yǎng)3 d，然后劃線純化.

（2）菌株的分子鑒定及系統(tǒng)進化樹構建. 用EZ-10 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，按說明書操作. 菌株16S rRNA 基因的PCR 擴增、序列測定、分析，及系統(tǒng)進化樹的構建參考文獻[8]進行.

（3）溶磷活性的定性檢測. 參照標準NY/T1847-2010[9]，采用平板透明圈法定性對菌株溶磷活性進行初測，用鉬銻抗比色法定量測定優(yōu)選菌株的溶磷活性.

（4）固氮活性檢測. 將新鮮菌體接到無氮培養(yǎng)基平板上，在30oC 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，連續(xù)傳代5 次. 如果最后菌落生長良好，說明具有固氮能力.

2 結果與分析

2.1 根際細菌16S rRNA 基因的擴增

在眾多生物大分子中，16S rRNA 基因高度保守，是一種被公認最合適的研究細菌譜系進化的分子標記. 本研究采用通用引物擴增了小麥根際細菌的16S rRNA 基因，部分菌株的PCR 擴增結果見圖1. 在標記菌株號的泳道中檢測到一個大小約為1500 bp 的條帶，與預期的16S rRNA 基因擴增產物的大小相符，表明擴增得到了目的基因. 得到的陽性PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定.

2.2 根際細菌物種的多樣性

測序結果經質量判定后，提交到EzBioCloud 數(shù)據庫和GenBank 數(shù)據庫中進行Blast 搜索，下載與其相似性最高的相關序列，然后進行進化分析. 36 株菌與其16S rRNA 基因序列相似性最高的物種序列信息見表1.

對菌株分類信息進行統(tǒng)計，結果見表2. 36 株菌分布在3 個門、5 個綱、11 個目、14 個科和14 個屬內.3 個菌門中，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinomycetota）為優(yōu)勢菌門，各占總菌株數(shù)的47.2%，厚壁菌門（Firmicutes）僅占5.6%. α-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢菌綱，紅球菌（Rhodococcus）為最主要的優(yōu)勢菌屬（占總菌株數(shù)的36.1%），其次為Brucella、Stenotrophomonas 和Agrobacterium.

待測菌中35 株與已知物種的16S rRNA 基因序列相似性超過98.65%，根據Kim 等的觀點[10]，可將其歸為對應的物種. 僅菌株22 與其親緣關系最近物種的16S rRNA 基因序列相似性低于98.65%. 為準確地確定其分類學地位，用軟件Mega 6.0 構建了鄰接法系統(tǒng)進化樹（圖2）.結果顯示，菌株22 與Schumannela luteola KHIA 聚在一起，形成一個單獨的進化枝，1 000 次重復抽樣中出現(xiàn)這種情況的概率為87.0%；用最大似然法和最大簡約法構建的系統(tǒng)進化樹也同樣支持上述觀點. 這說明菌株22 與S. luteolaKHIA 親緣關系最近，二者的16S rRNA 基因相似性低于98.65%[10]，由此推測菌株22 可能為該屬一個潛在的新種.

2.3 菌株溶磷能力

以磷酸鈣為難溶性磷源，通過透明圈法定性測定了菌株的溶磷活性，結果顯示50.0% 的菌株具有溶磷活性. 其中，菌株1、6、10、14 和57 形成較大的透明圈（圖3），其水解圈與菌落直徑的比值分別為1.6、1.6、1.5、1.6 和1.9. 在未優(yōu)化溶磷條件的情況下，采用鉬銻抗比色法定量測定了優(yōu)選菌株的溶磷活性，結果菌株1、6、10 和14 溶磷活性約為6.0 mg/L，菌株57 的溶磷活性最高，為11.5 mg/L，如圖3 所示.

2.4 菌株的固氮活性

在無氮培養(yǎng)基上連續(xù)轉接5 代，結果顯示，待測菌株中66.7% 具有固氮能力；菌株6、7、30、41、43、53、56、64、67、95 和101 在無氮培養(yǎng)基上生長良好.部分具有固氮活性的菌株同時具有較強的溶解磷酸鈣活性（如表3）.

3 討論與結論

大量PGPR 棲息在植物根際，它們可促進宿主植物吸收營養(yǎng)、生長、抗逆和拮抗病原菌等[1-3]，因此，這些資源的分離、多樣性及功能等研究，對微生物肥料開發(fā)和農業(yè)綠色發(fā)展意義深遠. 土壤中難溶性的無機磷約占總磷的35% ～ 70%，主要由Achromobacter、Aerobacter 和Agrobacterium 等13 個屬細菌溶解循環(huán)[11]. 在本研究中，5 株優(yōu)選的溶磷菌中有4株屬Achromobacter 和Agrobacterium 菌屬，很好地證明了Oleńska 的觀點. Stenotrophomonas 屬菌株具有促進植物吸收元素、產生吲哚乙酸類似生長調節(jié)劑、抑制病原菌或增強糧食作物抗逆性等促生屬性[12]. 本文中屬Stenotrophomonas 的菌株10 具有一定的溶磷活性（圖3），佐證了該屬具有促磷元素循環(huán)的生態(tài)功能.

由固氮菌驅動的生物固氮作用在農田生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位. 根據固氮菌與植物的關系，固氮菌可分為共生固氮菌（ 如Rhizobium 和Bradyrbizobium）和自生固氮菌（如Azospirillum）[3]. 小麥為禾本科植物，缺少共生固氮菌，故此土壤中尤其是根際的自生固氮作用尤為重要. 本研究中未分離到上述3 個屬的菌株，可能特殊的氣候、土壤、地貌等非生物因素對固氮菌具有一定的環(huán)境選擇作用.Kuhl 等基于基因組學技術研究了放線菌門的Rhodococcus qingshengii 和Rhodococcus erythropolis 耐脅迫及與植物互作的基因，并做了實驗驗證[13]. 本研究篩選到的11 株高固氮活性菌中5 株屬Rhodococcus，這也很好地證明了小麥根際分布的Rhodococcus 具有植物促生活性.

最近，Youseif 等以宏基因組學結果為指導開展了小麥根際可培養(yǎng)細菌多樣性研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、綠桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是最豐富的門，21% 的可培養(yǎng)菌株表現(xiàn)出多種促生特性，包括磷的溶解活性和鐵載體的產生[14]. 本研究在未優(yōu)化分離方法的情況下，從小麥根際分離到變形菌門、放線菌門和厚壁菌門（圖2），前2 個門為優(yōu)勢門，未分離到綠桿菌門、擬桿菌門菌株，說明根際細菌分布與土壤特征及所處生境相關；測定菌株中50.0% 具有一定的溶磷活性，66.7% 在無氮培養(yǎng)基上可以生長，表明大部分菌株同時具有這兩種促生活性.

綜上，本文圍繞新疆冬小麥根際細菌開展了多樣性及促生活性研究，可得到以下結論：新疆冬小麥根際細菌多樣性極為豐富，優(yōu)勢菌門為變形菌門和放線菌門；大多數(shù)菌株具有溶磷或固氮活性，少數(shù)菌株同時具有溶磷和固氮活性. 后續(xù)，可開展促生機制、盆栽及應用研究，便于充分挖掘這些寶貴的根際促生菌資源.

參考文獻：

[1] 穆文強， 康慎敏， 李平蘭. 根際促生菌對植物的生長促進作用及機制研究進展[J]. 生命科學， 2022， 34（2）： 118-127.

[2] GUPTA K， DUBEY N K， SINGH S P， et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria （PGPR）： Current and Future Pros?pects for Crop Improvement[M]//Yadav A N， Singh J， SinghC， et al. Current Trends in Microbial Biotechnology for Sus?tainable Agriculture. Singapore： Springer， 2021. doi：10.1007/978-981-15-6949-4_90.

[3] MOHANTY P， SINGH P K， CHAKRABORTY D， et al.Insight into the role of PGPR in sustainable agriculture andenvironment[J]. Frontiers in Sustainable Food Systems， 2021（5）： 667150. doi：10.3389/fsufs.2021.667150.

[4] 趙慧云， 戚名揚， 黨長喜， 等. 植物根圍促生菌誘導小麥幼苗耐旱性的研究[J]. 云南農業(yè)大學學報（ 自然科學版），2020， 35（1）： 8-14.

[5] 李永斌， 李云龍， 關國華， 等. 植物根際促生菌的篩選、鑒定及其對小麥的減肥增產效果[J]. 農業(yè)生物技術學報： 2020，28（8）： 1471-1476.

[6] ?；燮?， 邢文會， 夏鐵騎， 等. 根際促生細菌的篩選及其對小麥幼苗的促生作用[J]. 河南農業(yè)科學， 2016， 45（12）：52-57.

[7] 中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所， 新疆維吾爾自治區(qū)水利廳農牧水利處. 新疆灌區(qū)土壤鹽漬化及改良治理模式[M]. 烏魯木齊： 新疆科學技術出版社， 2008.

[8] 張永光， 劉晴， 王宏飛， 等. 新疆阜康鹽堿地可培養(yǎng)兼性嗜堿放線菌多樣性及其酶活篩選[J]. 微生物學報， 2014， 54（2）： 183-190.

[9] 中華人民共和國農業(yè)部. 微生物肥料生產菌株質量評價通用技術要求： NY/T 1847-2010[S]. 北京： 中國農業(yè)出版社，2010.

[10] KIM M， OH H S， PARK S C， et al. Towards a taxonomiccoherence between average nucleotide identity and 16SrRNA gene sequence similarity for species demarcation ofprokaryotes[J]. International Journal of Systematic and Evolu?tionary Microbiology. 2014， 64（2）： 346-351. doi： 10.1099/ijs.0.064931-0.

[11] OLE?SKA E， MA?EK W， WóJCIK M， et al. Beneficialfeatures of plant growth-promoting rhizobacteria for improv?ing plant growth and health in challenging conditions： A me?thodical review[J]. Science of The Total Environment， 2020（743）： 140682. doi：10.1016/j.scitotenv.2020.140682.

[12] GHOSH R， CHATTERJEE S， MANDAL N C. Chapter 20 -Stenotrophomonas[M]//AMARESAN N， SENTHIL KUMARM， ANNAPURNA K， et al. Beneficial Microbes in Agro-Ecology： Bacteria and Fungi. Elsevier， 2020： 427-442. doi：10.1016/B978-0-12-823414-3.00020-4.

[13] KUHL T， CHOWDHURY S P， UHL J， et al. Genomebasedcharacterization of plant-associated Rhodococcus qing?shengii RL1 reveals stress tolerance and plant-microbe inter?action traits[J]. Frontiers in Microbiology， 2021（12）： 708605.doi：10.3389/fmicb.2021.708605.

[14] YOUSEIF S H， EL-MEGEED F H A， HUMM E A， et al.Comparative analysis of the cultured and total bacterial com?munity in the wheat rhizosphere microbiome using culturedependentand culture-independent approaches[J]. Microbiol?ogy Spectrum. 2021， 9（2）： e0067821. doi： 10.1128/Spec?trum.00678-21.s.

【編校：許潔】

基金項目：宜賓學院科學研究基金項目（2020YY01）；中國科學院“西部之光”基金項目（2017-XBQNXZ-A-003）；宜賓學院博士啟動基金項目（2020QH04）