摘 要:【目的】挖掘干旱區(qū)放線菌天然產(chǎn)物代謝潛力,篩選群體感應(yīng)抑制活性的產(chǎn)物,研究其對梨火疫病原菌毒力因子代謝能力的影響。
【方法】利用紫色桿菌(Chromobacterium violaceum 026, CV026)群體感應(yīng)抑制活性篩選模型,對新疆庫木塔格沙漠周邊干旱地區(qū)土壤中分離的放線菌進(jìn)行發(fā)酵,采用牛津杯法對其發(fā)酵液進(jìn)行活性篩選;鑒定群體感應(yīng)抑制活性菌株及驗(yàn)證其發(fā)酵液提取和活性,分析粗提液對歐文氏菌毒力因子代謝影響,并采用液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatography and mass spectrometry, LC-MS)方法檢測菌株代謝產(chǎn)物活性物質(zhì),挑選相似結(jié)構(gòu)化合物驗(yàn)證群體感應(yīng)抑制活性。
【結(jié)果】獲得一株具有明顯群體感應(yīng)抑制活性菌株K-9,其與Streptomyces rubradiris strain NBRC 14000T相似性達(dá)到99.72%。該菌發(fā)酵粗提液具有明顯的群體感應(yīng)抑制活性,可有效降低紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色素和梨火疫病原菌的游動能力,并對梨火疫病原菌生物膜、胞外多糖和胞外酶等毒力因子產(chǎn)生具有顯著抑制活性,呈明顯的濃度依賴性;從鏈霉菌K-9粗提液中得到635種化合物,苯基丙烯酸、4-羥基-3甲氧基苯甲酸等5種明顯群體感應(yīng)抑制化合物。
【結(jié)論】干旱區(qū)放線菌K-9為Streptomyces rubradiris,其發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有明顯群體感應(yīng)抑制活性,能顯著抑制歐文氏菌毒力因子的產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)了多種新型的群體感應(yīng)抑制活性化合物。
關(guān)鍵詞:群體感應(yīng)抑制劑;干旱地區(qū)放線菌;歐文氏菌;毒力因子
中圖分類號:S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-4330(2024)04-1011-10
0 引 言
【研究意義】群體感應(yīng)抑制劑(Quorum sensing inhibitor, QSI)是一種可以阻斷群體感應(yīng)通路的化學(xué)物質(zhì)[1]。群體感應(yīng)參與許多重要的生物學(xué)過程,如孢子形成、毒力和生物膜形成等[2],還可引起動植物發(fā)病、食物腐敗等[3]。群體感應(yīng)抑制劑可通過對群體感應(yīng)信號分子合成酶抑制,或產(chǎn)生信號分子類似物競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白受體等,阻斷群體感應(yīng)通路,降低病原菌抗藥性、毒力因子代謝等,且不會給病原菌帶來明顯的生存壓力[4-5]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】梨火疫病危害香梨和蘋果[6];梨火疫病原菌解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)是一種革蘭氏陰性菌,能夠引起梨、蘋果及其他薔薇科植物火疫病,使植物葉、花、果實(shí)以及枝干快速枯萎、變黑,導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)[7]。歐文氏菌的毒力因子與生物膜、胞外多糖、胞外酶等代謝產(chǎn)生及其運(yùn)動性均與群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān),其中LuxI/LuxR信號系統(tǒng)主要調(diào)控一些蛋白酶、毒力因子的表達(dá),LuxS/LuxO信號系統(tǒng)與植物細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生有關(guān),并可以提高環(huán)境適應(yīng)度[8, 9]。
【本研究切入點(diǎn)】
目前,主要以細(xì)菌來源為主,如殺黃胞鏈霉菌能夠抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌所引起的軟腐作用[10];芽胞桿菌 240B1 菌株產(chǎn)生的N-?;呓z氨酸內(nèi)酯酶可以降低胡蘿卜軟腐歐文氏菌的致病性[11]。放線菌可以代謝豐富多樣的天然活性產(chǎn)物,現(xiàn)已從多種特殊環(huán)境放線菌中分離獲得群體感應(yīng)抑制劑[12-13]。目前,常用的群體感應(yīng)抑制劑篩選模型紫色桿菌CV026,當(dāng)添加群體感應(yīng)抑制劑時(shí)可阻斷或破壞信號分子傳遞通路,從而抑制紫色桿菌CV026紫色素產(chǎn)生,但不抑制其生長,從而形成無紫色色素的模糊透明圈[14]。歐文氏菌具有和紫色桿菌CV026相類似的群體感應(yīng)信號分子,通過該模型可對歐文氏菌群體感應(yīng)抑制劑進(jìn)行有效的篩選。目前,有關(guān)歐文氏菌群體感應(yīng)抑制劑相關(guān)研究的報(bào)道較少,需研究挖掘干旱區(qū)放線菌天然產(chǎn)物代謝潛力,篩選群體感應(yīng)抑制活性的產(chǎn)物?!緮M解決的關(guān)鍵問題】從庫木塔格沙漠周邊干旱區(qū)土壤中分離出一批放線菌資源,通過紫色桿菌CV026篩選模型篩選,發(fā)現(xiàn)一株具有較強(qiáng)群體感應(yīng)活性的菌株K-9,鑒定菌株,并對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取,檢驗(yàn)粗提物對歐文氏菌群集性和泳動性的影響及其生物膜、胞外多糖、胞外酶產(chǎn)量的抑制作用,為菌株K-9群體感應(yīng)抑制活性分子分析及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 株
紫色桿菌CV026由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院王巖教授惠贈; 梨火疫病原菌解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)由新疆微生物資源保藏管理中心提供。
1.1.2 試 劑
二甲基亞砜(DMSO),結(jié)晶紫,乙酸乙酯,蒽酮,N-己酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(C6-HSL)均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司; DL-4-羥基苯乳酸水合物,3,4-二羥苯基丙酸均購自上海麥克林生化科技有限公司;苯基丙烯酸、哌啶酸、4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸購自北京陽光峰行化學(xué)研究有限公司; 4-羥基-3甲氧基苯甲酸均購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司; 2-吡咯羧酸、甘氨酸三甲胺內(nèi)鹽均購自河北百靈威超精細(xì)材料有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
高氏一號培養(yǎng)基,貝耐特培養(yǎng)基, ISP2培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基,購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
群集檢測培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10.0,葡萄糖 5.0,NaCl 5.0,瓊脂5.0,pH自然。
泳動檢測培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,NaCl 3.0,瓊脂5.0,pH自然。
1.1.4 器 材
PLCD離心機(jī)(德國希格瑪公司);SPX-250BF恒溫培養(yǎng)箱(上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);R300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義市英裕予華公司);Biotek Epoch-2型酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司);SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);BSD-250振蕩培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);Silica gel 60 F254薄層鋁板(德國默克公司)。
1.2 方 法
1.2.1 QSI活性放線菌的篩選
從新鮮待測放線菌菌株斜面上刮取表面孢子,接種至含有50 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃,150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液經(jīng)雙層濾紙抽濾后,用0.22 μm濾膜過濾,收集濾液,保存于-20 ℃,備用。
取紫色桿菌CV026新鮮菌苔一環(huán)接入LB中, 30 ℃ ,150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)16 h。取1 mL CV026菌液和20 μL 100 μmol/mL C6-HSL加入平皿中,加入25 mL LB固體培養(yǎng)基(約50 ℃),迅速混勻,放入外徑8 mm牛津杯,等培養(yǎng)基凝固,備用。
取100 μL發(fā)酵濾液加入孔中,并以無菌水為對照,30 ℃正置恒溫培養(yǎng)24 h,觀察平板變色情況,并記錄有模糊透明圈的菌株。
1.2.2 放線菌的形態(tài)及分子鑒定
將篩選獲得菌株劃線于高氏一號固體培養(yǎng)基平板上, 30 ℃恒溫培養(yǎng) 4 d,觀察菌落形態(tài)大小、顏色等形態(tài)。
菌株基因組DNA按照試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)說明書提取,PCR采用細(xì)菌16S rRNA基因序列通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性 5 min; 94 ℃變性 30 s,54 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min,30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,純化后,由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。
1.2.3 粗提物制備及其功能驗(yàn)證
菌株接種至高氏一號液體培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d, 發(fā)酵液離心,取上清液,等體積乙酸乙酯萃取3 h,取有機(jī)相40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干,稱重,獲得粗提物。稱取適量粗提物溶解于二甲基亞砜中配制成一定濃度,有機(jī)溶劑濾膜過濾,濾液保存于-20 ℃,備用。
粗提液群體感應(yīng)活性驗(yàn)證采用薄層色譜(TLC)-生物自顯影法[15]。取5 μL粗提物點(diǎn)在鋁制薄層板上,選用展開劑體系為甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷-石油醚(體積比10∶50∶1∶1),密閉層析至上端0.5 cm,冷風(fēng)吹干,置于紫外線燈254 nm觀察熒光斑點(diǎn) ,并拍照。將混有紫色桿菌CV026和C6-HSL的LB瓊脂鋪于TLC板上,凝固后, 30℃恒溫培養(yǎng)36 h,觀察平板變色情況,并拍照。
1.2.4 不同濃度粗提液的抑菌情況
采用96孔板法,分別接種對數(shù)中后期的紫色桿菌CV026和梨火疫病原菌,按2%接種量接種于含有不同濃度粗提物的LB液體培養(yǎng)基中,其中粗提物的終濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10 mg/mL,并以加入等體積二甲基亞砜作為對照,等體積無菌水為陰性對照。各處理設(shè)3個(gè)平行,置于酶標(biāo)儀中30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h,每2 h測定OD590值,觀察粗提物的抑菌情況。
1.2.5 粗提液對紫色桿菌產(chǎn)紫色色素的影響
采用96孔板法,分別取 120 μL的LB液體培養(yǎng)基(含 0.1 μmol C6-HSL )置于孔中,以 2%接種量接種CV026菌液,分別加入適量的粗提液,至0.15、0.3、0.6、1.25、2.5 mg/mL,并以加入等量的二甲基亞砜為對照,置于酶標(biāo)儀中30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h。采用Choo等[16]方法,分別吸取上述發(fā)酵液100 μL置于1.5 mL離心管中,10 000 r/min室溫離心5 min,棄上清,加100 μL的DMSO渦旋震蕩混勻,并使紫色桿菌紫色素充分溶解后,離心取上清液,運(yùn)用酶標(biāo)儀測定其 OD600值,分析粗提物對紫色桿菌產(chǎn)生紫色素的影響。
1.2.6 粗提液對梨火疫病原菌生物膜的影響
采用96孔板法,分別取120 μL LB液體培養(yǎng)基于孔中,以2%的接種量接入梨火疫病原菌菌液,分別加入一定量的粗提物,至終濃度為0.5、1、2、5 mg/mL, 并以加入等量的二甲基亞砜為對照,置于酶標(biāo)儀中30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h。參考Zhang等[17]棄掉菌液,蒸餾水沖洗3次獲得生物膜,自然風(fēng)干后用1%結(jié)晶紫染色15 min,沖洗干凈并烘干,用95%的乙醇洗脫,測定OD590值。
1.2.7 粗提液對梨火疫病原菌胞外多糖的測定
參考于福浩等[18]方法,吸取100 μL菌液上清液,加入乙酸乙酯萃取2次,40 ℃蒸干,加入100 μL超純水溶解后用 300 μL 2%蒽酮-硫酸溶液進(jìn)行顯色反應(yīng),在沸水中反應(yīng) 15 min并冷卻,設(shè)立空白對照組,重復(fù)3次,測定樣品與空白對照組的 OD625 值。
1.2.8 粗提液對梨火疫病原菌蛋白酶產(chǎn)量測定
取100 μL菌液10 000 r/min常溫離心8 min,取上清,加入200 μL 1.3%的脫脂牛奶溶液(w/v,50 mmol/L K2HPO4,pH值 7.0),37℃,靜置2 h,測量OD600。
1.2.9 粗提液對梨火疫病原菌群集性和泳動性的影響
參考劉佳宜等[19]方法,分別配制含有0.6、1.2、2.5、5 mg/mL粗提物的群集瓊脂培養(yǎng)基和泳動瓊脂培養(yǎng)基平板,以添加等體積的二甲基亞砜為對照,點(diǎn)接梨火疫病原菌,30 ℃恒溫正置培養(yǎng) 24 h,觀察菌株的群集和泳動情況。
1.2.10 LC-MS檢測及化合物群體感應(yīng)抑制活性驗(yàn)證
將菌株K-9發(fā)酵粗提物送至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行LC-MS檢測,色譜條件:正離子流動相為 0.1%甲酸乙腈(B2)和 0.1%甲酸水(A2),梯度洗脫順序?yàn)?% B2,0~1 min;2%~50% B2,1~9 min;50%~98% B2,9~12 min;98% B2,12~13.5 min;98%~2% B2,13.5~14 min;2% B2,14~20 min。負(fù)離子流動相為乙腈(B3)和 5 mM 甲酸銨水(A3),梯度洗脫順序?yàn)?% B3,0~1 min;2%~50% B3,1~9 min;50%~98% B3,9~12min;98% B3,12~13.5 min;98%~2% B3,13.5~14 min;2% B3,14~17 min。流速:0.25 mL/min,柱溫:40 ℃,進(jìn)樣量 2 μL[20]。
質(zhì)譜主要條件:采用電噴霧離子源(ESI),正離子噴霧電壓為 3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV,毛細(xì)管溫度 325 ℃。以分辨率 70 000 進(jìn)行一級掃描,一級離子掃描范圍100~1 000 m/z,并采用高能碰撞誘導(dǎo)裂解模式(HCD)進(jìn)行二級裂解,碰撞能量為 30 eV,二級分辨率為 17 500[21]。
選取部分潛在功能化合物,將化合物標(biāo)準(zhǔn)品濃度配制為10 mg/mL,功能驗(yàn)證。取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液加至紫色桿菌CV026模型篩選培養(yǎng)基打孔處,并以無菌水為對照,30 ℃正置恒溫培養(yǎng)24 h,觀察平板變色情況,記錄有模糊透明圈直徑。
1.3 數(shù)據(jù)處理
將所得菌株16S rRNA 基因序列上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,并調(diào)取相關(guān)相似性模式菌株序列,利用 MEGA 7軟件進(jìn)行Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,確定其分類地位。
2 結(jié)果與分析
2.1 群體感應(yīng)抑制活性菌株的篩選及鑒定
研究表明,與對照無菌水相比,菌株K-9發(fā)酵液可產(chǎn)生較大的模糊圈,該菌株發(fā)酵液無明顯抑制紫色桿菌CV026的生長,但可以明顯抑制紫色桿菌CV026產(chǎn)生紫色色素,且經(jīng)稀釋4倍仍具有較淡模糊圈,該菌株具有明顯的群體感應(yīng)抑制效果。
菌株K-9菌落大小為0.2~0.6(cm)×0.2~0.6(cm),其與培養(yǎng)基結(jié)合較緊、質(zhì)地致密,中間凹陷,氣生菌絲呈白色絨狀,孢子呈白色,基內(nèi)菌絲呈淡黃色。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,菌株K-9隸屬于鏈霉菌屬,其16S rRNA基因序列與Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達(dá)到99.72%,其16S rRNA基因序列登錄號為OQ568903。圖1,圖2
2.2 粗提液群體感應(yīng)抑制效果驗(yàn)證
2.2.1 粗提液TLC活性成分生物顯影
研究表明,100 mg/mL濃度粗提液在254 nm紫外照射下出現(xiàn)三個(gè)明顯的暗斑,群體感應(yīng)活性中心條帶處具有明顯著色條帶,其主要活性基團(tuán)具有254 nm紫外吸收能力。在TLC薄板上方有多處明顯菌株生長,但無紫色素積累條帶,粗提液中含有較強(qiáng)的群體感應(yīng)抑制活性。圖3
2.2.2 不同濃度粗提液對菌株生長的影響
研究表明,高濃度的粗提液對紫色桿菌和梨火疫病原菌生長均有明顯的抑制,但低濃度下對不同菌抑制效果存在不同,當(dāng)粗提液濃度為2.5 mg/mL時(shí)紫色桿菌生長即受明顯影響,而梨火疫病原菌在濃度為5 mg/mL仍可微弱生長。表1
2.2.3 對紫色桿菌紫色色素產(chǎn)生的影響
研究表明,各試驗(yàn)組中粗提液均對紫色桿菌CV026紫色色素產(chǎn)量有著明顯影響,且隨著粗提液濃度的升高,紫色色素含量顯著減少。當(dāng)粗提物濃度為2.5 mg/mL時(shí),對紫色色素產(chǎn)生具有極其顯著抑制作用;當(dāng)粗提液濃度為0.3~1.25 mg/mL時(shí),對紫色色素產(chǎn)生具有極顯著抑制作用;即使?jié)舛?.15 mg/mL的粗提液仍能有效降低其紫色素產(chǎn)量,達(dá)到12.95%,粗提液具有較強(qiáng)的群體感應(yīng)抑制劑活性。圖4
2.3 粗提液對梨火疫病原菌群體感應(yīng)抑制效果
2.3.1 粗提液對生物膜產(chǎn)生的影響
研究表明,各粗提液濃度均對梨火疫病原菌生物膜產(chǎn)生有極其顯著的影響,且隨著粗提液濃度的升高,生物膜抑制作用也逐漸增強(qiáng),其中濃度為5 mg/mL時(shí)對生物膜有抑制作用最為顯著,抑制率達(dá)95.92%。圖5
2.3.2 粗提液對胞外多糖產(chǎn)量的影響
研究表明,不同添加濃度對胞外多糖產(chǎn)量有著不同的影響效果,當(dāng)粗提物濃度為1.2~5.0 mg/mL時(shí)抑制效果最顯著,抑制率分別為48.98%、38.62%、26.27%,當(dāng)濃度低于0.6 mg/mL時(shí)抑制效果不顯著。圖6
2.3.3 粗提液對蛋白酶的影響
研究表明,在添加濃度為0.3~5 mg/mL時(shí)的粗提液時(shí),菌株蛋白酶抑制率呈濃度依賴性下降,均有極其顯著抑制作用,抑制率分別為61.8%、37.07%、33.94%、26.34%和20.23%。圖7
2.3.4 粗提液對菌株群集和泳動性影響
研究表明,梨火疫病原菌群集在有無粗提液處理下均不明顯,而加入粗提液后對病原菌泳動性具有明顯的抑制,且隨著濃度的增加抑制效果更為明顯。圖8
2.4 粗提液活性物質(zhì)
研究表明,鑒定出635種代謝化合物,遴選出8個(gè)化合物進(jìn)行功能驗(yàn)證。在濃度均為10 mg/L時(shí),所選化合物中有5種具有明顯群體感應(yīng)抑制活性,其中2種化合物也具有較為明顯的抑菌活性。苯基丙烯酸和4-羥基-3甲氧基苯甲酸的抑制活性最高,群體感應(yīng)面積分別達(dá)4.15和3.14 cm2;吡咯-2-羧酸和3,4-二羥苯基丙酸同時(shí)具有抑菌活性和群體感應(yīng)抑制活性;DL-4-羥基苯乳酸群體感應(yīng)抑制活性最低,抑制面積為0.79 cm2,其余各化合物沒有群體感應(yīng)抑制活性。圖9,表2
3 討 論
3.1
微生物來源的天然活性產(chǎn)物33 500種,其中放線菌來源的有13 700種,約占41%,而鏈霉菌屬來源的占其80%左右[22]。沙漠極端環(huán)境具有極端干旱、強(qiáng)紫外線輻射和晝夜周期極端溫度變化等特征,有著豐富的極端環(huán)境微生物,其中,放線菌是重要組成部分之一[23]。庫木塔格沙漠夏季炎熱干燥,最高氣溫達(dá)到49.6 ℃,地表溫度最高可達(dá)82.5 ℃,而冬季一般氣溫在-10 ℃左右,極端低溫可達(dá)-29 ℃,全年偶有雨雪,生態(tài)環(huán)境極其特殊。該區(qū)域放線菌占可培養(yǎng)菌群的絕對優(yōu)勢,并篩選到一株具有明顯群體感應(yīng)抑制活性菌株K-9,其16S rRNA基因序列與Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達(dá)到99.72%。
3.2
群體感應(yīng)抑制劑來源多種多樣,包括動物、植物以及微生物,其中,多種放線菌被報(bào)道代謝產(chǎn)物具有群體感應(yīng)抑制活性,如灰紅肉鏈霉菌、達(dá)松維爾擬諾卡氏菌、微小鏈霉菌、殺黃胞鏈霉菌等[10,24]。Hassan等[25]從土壤樣品中分離出Streptomyces coelicoflavus,其代謝產(chǎn)物1H-吡咯-2-羧酸可以抑制群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá);Ooka等[26]從土壤中分離出Streptomyces phaeofaciens其多種代謝產(chǎn)物菜青素A1 、3’-鼠李糖苷A1以及新化合物菜青素E具有群體感應(yīng)抑制活性;周恒等[24]和Ishaque等[27]分別從中國連云港海區(qū)表層海水和印度南部羅美斯瓦倫海岸土壤中分離到Streptomyces parvulus和Streptomyces tendae具有群體感應(yīng)抑制活性;Velasco-Bucheli等[28]分離出的Streptomyces lavendulae代謝產(chǎn)物青霉素?;缚捎行鈳追NAHL的酰胺鍵。試驗(yàn)獲得菌株Streptomyces sp. K-9與已報(bào)道的Streptomyces coelicoflavus、Streptomyces tendae 和Streptomyces griseoincarnatus[29]均具有較近的相似性,分別為98.37%、98.72%和98.58%,預(yù)示著Streptomyces sp. K-9可能有著三株菌相似的群體感應(yīng)抑制活性產(chǎn)物或代謝途徑,相關(guān)研究有待深入。
3.3
Molina等[30]將信號分子內(nèi)酯酶基因?qū)霟晒饧賳伟山档秃}卜軟腐病的癥狀;在大腸桿菌中異種表達(dá)的aim基因產(chǎn)物也對群體感應(yīng)信號分子具有較強(qiáng)的水解活性,可減少馬鈴薯軟腐病歐文氏菌產(chǎn)生果膠酶活性從而減輕軟腐病侵害[31];Kang等[10]發(fā)現(xiàn)Streptomyces xanthocidicus KPP01532代謝產(chǎn)物piericidin A和glucopiericidin A可以抑制馬鈴薯軟腐病歐文氏菌(Erwinia carotovora subsp. atroseptica)毒力基因表達(dá)。試驗(yàn)對Streptomyces sp.K-9代謝粗提物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其對紫色桿菌CV026具有較強(qiáng)的群體感應(yīng)抑制活性,且能明顯抑制梨火疫病原菌泳動特性,對菌株的生物膜、胞外多糖、蛋白酶產(chǎn)生具有顯著抑制活性,并呈明顯的濃度依賴性,在試驗(yàn)條件下相關(guān)最高抑制率分別可達(dá)95.92%、48.98%和61.8%。同時(shí),高濃度K-9粗提液具有明顯的抑菌活性,該菌的發(fā)酵液可通過群體感應(yīng)抑制和抑菌活性聯(lián)合對有害菌株生長進(jìn)行抑制。
3.4
5種具有群體感應(yīng)抑制化合物,除發(fā)現(xiàn)了苯基丙烯酸和4-羥基-3甲氧基苯甲酸[32, 33]已報(bào)道外,發(fā)現(xiàn)吡咯-2-羧酸和3,4-二羥苯基丙酸同時(shí)還具有較為明顯的抑菌活性,而3,4-二羥苯基丙酸、DL-4-羥基苯乳酸此前未見報(bào)道,顯示鏈霉菌K-9豐富的群體感應(yīng)抑制活性化合物代謝能力,相關(guān)化合物的進(jìn)一步功能評價(jià)及發(fā)酵代謝優(yōu)化,有待深入開展。
4 結(jié) 論
從新疆庫木塔格沙漠分離出一株群體感應(yīng)抑制活性放線菌K-9,經(jīng)16S rRNA基因序列分子鑒定其于Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達(dá)到99.72%。發(fā)酵粗提液在亞抑菌濃度下能明顯抑制紫色桿菌紫色色素的產(chǎn)生,且能顯著抑制梨火疫病原菌的泳動性,對其生物膜、胞外多糖、蛋白酶等毒力因子代謝的抑制率最高可達(dá)95.92%、48.98%和61.8%。從鏈霉菌K-9粗提液鑒定出635個(gè)化合物,篩選出5種具有明顯的群體感應(yīng)抑制活性。
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