雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲、雄蟲觸角轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)基因分析

摘 要：【目的】建立雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選雌蟲、雄蟲觸角中的差異表達(dá)基因并解析其涉及的生理功能，為進(jìn)一步研究雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲的基因功能分析及嗅覺感受機(jī)制奠定分子基礎(chǔ)。

【方法】采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲、雄蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)獲得的unigenes進(jìn)行功能注釋、通路富集等生物信息學(xué)分析，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)氣味結(jié)合蛋白基因在觸角中的表達(dá)水平。

【結(jié)果】雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得73 050條unigenes，Q30堿基百分比均在93.23%以上，34 233條unigenes至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得注釋。與雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲觸角相比，雄蟲觸角中檢測(cè)到395個(gè)差異表達(dá)基因，其中288個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，107個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

【結(jié)論】在GO注釋庫(kù)中，差異表達(dá)基因富集最顯著的功能為氣味結(jié)合、嗅覺受體活性和嗅覺感知。氣味結(jié)合蛋白基因在雌蟲、雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)水平趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符合，獲得了雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。

關(guān)鍵詞：雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲；觸角轉(zhuǎn)錄組；功能注釋；差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S433 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2024）04-0984-11

0 引 言

【研究意義】雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲Monolepta signata，屬于鞘翅目Coleoptera，葉甲科Chrysomelidae，螢葉甲亞科Galerucinae，長(zhǎng)跗螢葉甲屬M(fèi)onolepta［1-3］。該葉甲在世界上主要分布于亞洲東部和東南部；在我國(guó)主要分布于西北、東南和西南地區(qū)［4-7］。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲為多食性昆蟲，不僅為害玉米、棉花、高粱、豆類和十字花科蔬菜等多種作物，還取食多種雜草，且能在田間雜草和農(nóng)作物之間轉(zhuǎn)移為害［8， 9］。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲以幼蟲為害植物根部，成蟲取食寄主植物的葉片、花和果穗，具有為害期長(zhǎng)、蟲口密度高、繁殖力強(qiáng)、擴(kuò)散快等特點(diǎn)，危害多種作物［10， 11］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲利用靈敏的嗅覺系統(tǒng)來(lái)識(shí)別環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)，并根據(jù)接收到的信號(hào)進(jìn)行自身的生命活動(dòng)，如定位寄主、尋找配偶和躲避天敵［15， 16］。昆蟲在尋找配偶時(shí)，雄蟲感受到雌蟲釋放的性信息素后沿著跡象尋找雌蟲，接近雌蟲后釋放自身的信息素，雌蟲除了根據(jù)雄蟲釋放的信息素評(píng)估后進(jìn)行交配之外，交配后也要依據(jù)寄主揮發(fā)物定位產(chǎn)卵場(chǎng)所［17， 18］。觸角是昆蟲進(jìn)行化學(xué)信號(hào)識(shí)別的主要器官，雌蟲、雄蟲觸角基因表達(dá)水平的差異直接影響了二者對(duì)環(huán)境中化學(xué)信號(hào)的識(shí)別與接收，最終導(dǎo)致了雌蟲、雄蟲生理和行為的差異［19］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是對(duì)細(xì)胞或組織在某一生理?xiàng)l件下的所有轉(zhuǎn)錄信息進(jìn)行高通量測(cè)序分析，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對(duì)生物體所有基因的表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)功能等信息進(jìn)行研究［21， 22］。高通量測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)［23， 24］，隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)在昆蟲上的應(yīng)用，目前對(duì)30余種鞘翅目昆蟲進(jìn)行了觸角的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析［25-27］，篩選出了參與嗅覺識(shí)別過程的相關(guān)蛋白基因，并利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了序列分析和功能驗(yàn)證［28-31］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲的研究主要集中于生物學(xué)特性和綜合防治［12-14］，關(guān)于其觸角在嗅覺識(shí)別過程的分子機(jī)制尚不清楚。

利用掃描電鏡觀察了雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌成蟲、雄成蟲觸角形態(tài)及感器類型 ［20］，而觸角是如何執(zhí)行嗅覺功能的分子機(jī)制尚未報(bào)道。需選擇雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及雌蟲、雄蟲差異基因的篩選，明確雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲觸角中的基因信息?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該葉甲雌、雄成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)獲得的unigenes進(jìn)行功能注釋，篩選出在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲、雄蟲觸角中差異表達(dá)基因，分析雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲、雄蟲生理和行為差異的關(guān)鍵基因，為研究該葉甲觸角的基因功能和嗅覺感受機(jī)制奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲采集于新疆塔城地區(qū)沙灣市南灣鎮(zhèn)東灣村玉米地（85°48′E，44°03′N），實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室溫度28℃，相對(duì)濕度控制在40%～50%，每日飼喂新鮮的棉花葉片。分別選擇活動(dòng)能力較強(qiáng)的雌成蟲、雄成蟲并用顯微手術(shù)鑷子和剪刀切取觸角，以100對(duì)觸角為一個(gè)樣品，雌蟲、雄蟲各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將觸角與蟲體分離后迅速放入浸泡在液氮的離心管中，保存于-80℃低溫冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

用Trizol試劑（Invitrogen， USA）提取雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄觸角樣品的總RNA，RNA的質(zhì)量和完整性用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent Technologies， CA， USA）進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的RNA樣品由北京諾禾致源科技股份有限公司完成cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq 6000（Illumina， USA）。利用Oligo（dt）的磁珠富集帶有Poly A尾的mRNA后加入片段緩沖液，使其成為短片段mRNA，以短片段mRNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物合成cDNA第一條鏈。在DNA polymerase I體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈，用AMPure XP 系統(tǒng)（Beckman Coulter， Beverly， USA）篩選修復(fù)處理后的250～300 bp的片段，用PCR擴(kuò)增后再次純化后建庫(kù)并質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)拼接與組裝

對(duì)包含帶有測(cè)序接頭和測(cè)序質(zhì)量較低的reads原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤率和GC含量分布進(jìn)行檢查，F(xiàn)astp軟件（version 0.19.7）被用于數(shù)據(jù)質(zhì)量把控，保證獲得的clean reads能夠用于后續(xù)組裝。用Trinity軟件（version 2.6.6，默認(rèn)參數(shù)）對(duì)clean reads進(jìn)行拼接與組裝，用BUSCO軟件對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，確保得到高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本序列［32］。

1.2.3 基因功能注釋

利用Blast軟件（version 2.2.28+）將獲得的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角unigenes與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI non-redundant protein sequences，NR）、GO數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)（A manually annotated and reviewed protein sequence database）、蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein family database，PFAM）、直系同源基因簇（Clusters of orthologous groups of protein，KOG/COG）和NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI nucleotide sequences，NT）進(jìn)行比對(duì)，獲得unigenes的注釋信息。

1.2.4 差異表達(dá)基因

利用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件（version 1.6.3）對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異表達(dá)分析，標(biāo)準(zhǔn)化處理后計(jì)算得到Fold Change，根據(jù)Padjust lt; 0.05 且 log2FoldChange＞1的條件，篩選雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲、雄蟲觸角中具有表達(dá)差異的基因。Clusterprofiler軟件（version 3.0.4）被用于差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG通路富集分析，當(dāng)Pvalue≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異表達(dá)基因在此GO功能或KEGG通路中顯著富集。

1.2.5 氣味結(jié)合蛋白基因相對(duì)表達(dá)水平

基于雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes功能注釋結(jié)果，選擇FPKM值（每千堿基轉(zhuǎn)錄序列中每百萬(wàn)個(gè)堿基測(cè)序的預(yù)期片段數(shù)）較高的氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding protein， OBP）基因進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，分析其在雌蟲、雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)水平。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作為內(nèi)參基因，利用NCBI Primer -Blast 在線網(wǎng)站（https：// www. ncbi. nlm. nih. gov/ tools/ primer-blast/ index. cgi）設(shè)計(jì)引物，由北京諾禾致源科技股份有限公司合成引物。利用CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）對(duì)OBP基因進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s后，95℃ 15 s和60℃ 30 s循環(huán)40次，將反應(yīng)體系從65℃緩慢升溫至95℃，以每秒0.5℃的升溫速度擴(kuò)增溶解曲線，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。以各基因在雌蟲觸角中的表達(dá)量作為對(duì)照，用2-△△CT法計(jì)算各基因在雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件（version 20.0）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)法檢驗(yàn)基因在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲觸角和雄蟲觸角表達(dá)量間的差異顯著性。表1

2 結(jié)果與分析

2.1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)組裝

研究表明，各樣品clean bases皆超過了6 Gb，GC堿基占總堿基數(shù)的百分比為35.05%。Q20和Q30所占百分比分別在97.75%和93.23%以上，clean reads的測(cè)序錯(cuò)誤率較低，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好。共得到73 050個(gè)unigenes，平均長(zhǎng)度為1 140 bp，N50和N90的平均長(zhǎng)度分別為1 896 bp和440 bp，unigenes長(zhǎng)度大于1 000 bp的有23 032條，占比31.53%，組裝完整性較好。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI的SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)，項(xiàng)目號(hào)為PRJNA960895。表2，表3

2.2 Unigenes功能注釋

研究表明，34 233條unigenes至少在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得功能注釋信息，占總unigenes數(shù)的46.86%。其中有3 475條unigenes在以上7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中同時(shí)成功注釋，占總unigenes數(shù)的4.75%。NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋成功的unigenes數(shù)量最多，為29 403個(gè)（40.25%），其后依次是PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)為19 137個(gè)（26.19%），GO數(shù)據(jù)庫(kù)為19 135個(gè)（26.19%），Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)為15 487個(gè)（21.20%），NT數(shù)據(jù)庫(kù)為10 676個(gè)（14.61%），KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)為10 014個(gè)（13.70%），KOG數(shù)據(jù)庫(kù)為7 554個(gè)（10.34%）。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角注釋的基因序列與玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera LeConte相似性最高，占38.80%。其次為光肩星天牛Anoplophora glabripennis（Motschulsky）（7.18%）、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（7.07%）、赤擬谷盜Tribolium castaneum（3.32%）、堆沙白蟻Cryptotermes secundus（1.61%）、牛頭嗡蜣螂Onthophagus taurus（1.53%）、黑毛蟻Lasius niger（1.23%）、沙漠鐵甲蟲Asbolus verrucosus（1.13%）和中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae（1.09%），其他物種占37.02%。表4，圖1

2.3 基因功能分類

研究表明，測(cè)序共有19 135條unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，可分為生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)大類，細(xì)分為42個(gè)亞類。在3大類中，unigenes注釋到生物學(xué)過程的數(shù)量最多，占比50.44%；注釋到分子功能這一大類的unigenes數(shù)量占比為27.06%，注釋到細(xì)胞組分這一大類的unigenes數(shù)量占比最少，為22.49%。細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)節(jié)是生物學(xué)過程這一大類中unigenes數(shù)量最多的3個(gè)類別，比重分別是14.08%、11.66%和5.25%；結(jié)合和催化活性是分子功能這一大類中最主要的2個(gè)類別，unigenes數(shù)量占比分別是13.27%和8.77%；細(xì)胞解剖實(shí)體和細(xì)胞內(nèi)是細(xì)胞組分中unigenes數(shù)量最多的兩個(gè)類別，占比分別是10.38%和6.11%。圖2

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組中有10 014條unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，參與了5大類代謝通路分支，即細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機(jī)系統(tǒng)，第二層級(jí)包括34小類，在第三層級(jí)中包括231個(gè)代謝通路。其中被注釋在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因數(shù)目最多，為1 146條（11.44%），占比11.44%；其次注釋unigenes數(shù)目較多的通路依次是轉(zhuǎn)錄681條（6.80%），運(yùn)輸和代謝672條（6.71%），氨基酸代謝627條（6.26%），折疊、分類和降解565條（5.64%），內(nèi)分泌系統(tǒng)526條（5.25%），免疫系統(tǒng)451條（4.50%）。圖3

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組中的7 554條unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，分為25類。在R類（一般功能預(yù)測(cè)）中注釋的unigenes數(shù)目最多，有1 203個(gè)，占比15.92%；其次是O類（翻譯后修飾，蛋白質(zhì)翻譯，分子伴侶）中有881條unigenes被注釋，占比1.66%；在T類（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）有859條unigenes被注釋，占比11.37%；在S類（未知功能）中有569條unigenes被注釋，占比7.53%，在U類（胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸）有496條unigenes獲得注釋，占比6.57%。圖4

2.4 差異表達(dá)基因

研究表明，與雌蟲觸角相比，雄蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組中篩選有395個(gè)差異表達(dá)基因，其中288個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，107個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。圖5

99個(gè)上調(diào)表達(dá)基因被注釋到GO的3大功能類別中，共獲得806條功能注釋。在生物學(xué)過程中，最多有48個(gè)基因（48.50%）注釋到細(xì)胞過程，其次是39個(gè)基因（39.40%）注釋到代謝過程，29個(gè)基因（29.30%）被注釋到有機(jī)物代謝過程；在分子功能中，最多有48個(gè)基因（48.50%）注釋到結(jié)合，其次有33個(gè)基因（33.30%）為催化活性；在細(xì)胞組分中，有27個(gè)基因（27.30%）注釋為細(xì)胞膜，剩余的功能條目注釋基因均不超過20個(gè)。64個(gè)下調(diào)基因被注釋到GO的3大功能類別中，在生物學(xué)過程中，最多有35個(gè)基因（54.70%）注釋到細(xì)胞過程，其次有27個(gè)基因（42.20%）注釋到代謝過程；分子功能類別中29個(gè)基因（45.30%）注釋到催化活性，27個(gè)基因（42.20%）注釋到結(jié)合；細(xì)胞組分中有23個(gè)基因（35.90%）注釋到細(xì)胞膜，剩余的功能條目注釋基因均不超過20個(gè)。選擇富集最顯著的20個(gè)GO term在氣泡圖中展示。圖6

95個(gè)差異表達(dá)基因主要參與了59個(gè)代謝途徑，288個(gè)上調(diào)表達(dá)基因中有43個(gè)基因（14.90%）參與了29個(gè)代謝通路，107個(gè)下調(diào)表達(dá)基因中有52個(gè)基因（48.60%）被富集到38個(gè)代謝通路中。95個(gè)差異表達(dá)基因中富集到谷胱甘肽代謝中的基因數(shù)目最多，富集也最顯著；其次富集顯著的是腎素-血管緊張素系統(tǒng)和造血細(xì)胞譜系。選擇富集最顯著的20個(gè)KEGG代謝通路在氣泡中展示。圖7

2.5 氣味結(jié)合蛋白基因表達(dá)水平

研究表明，OBP基因在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲觸角中穩(wěn)定表達(dá)，其中MsigOBP2、MsigOBP6、MsigOBP15、MsigOBP18、MsigOBP20和MsigOBP21在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于雄蟲觸角，MsigOBP3和MsigOBP6在雄蟲觸角中的表達(dá)水平顯著高于雌蟲觸角，MsigOBP5在雌、雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。OBP基因在雌、雄蟲觸角中的相對(duì)表達(dá)水平或變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，觸角是OBP基因發(fā)揮作用的主要場(chǎng)所。圖9

3 討 論

3.1

雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲為多食性昆蟲，可取食多種農(nóng)作物［14］。試驗(yàn)利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)篩選出的OBP基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明以上基因均能夠在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲觸角中穩(wěn)定表達(dá)，印證了觸角是氣味結(jié)合蛋白作用的主要場(chǎng)所。

3.2

研究中雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序和拼接效果良好，組裝優(yōu)化后得到73 050條unigenes。與和綠豆象Callosobruchus chinensis的觸角轉(zhuǎn)錄組得到69 847條unigenes處于同一數(shù)量水平上［33］。將unigenes與獲得的7大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有46.86%的unigenes至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，基于雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋信息，比對(duì)得知匹配雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲u(yù)nigenes最多的物種是玉米根螢葉甲，玉米根螢葉甲的基因組信息已獲得［34］。與多數(shù)昆蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明注釋到的unigenes均與基因組信息已知的親緣關(guān)系較近的物種相似性序列最多相一致，如紅脂大小蠹Dendroctonus valens的在NR注釋中有69.1%的基因與鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜Tribolium castaneum相似性高［35］。

3.3

基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角轉(zhuǎn)錄組共有19 135條unigenes分別注釋于生物過程、分子功能和細(xì)胞成分3大類，在這3大類中分別注釋到細(xì)胞過程、結(jié)合和代謝過程的unigenes數(shù)量最多，這和七星瓢蟲Coccinella septempunctata［36］觸角轉(zhuǎn)錄組在GO數(shù)據(jù)庫(kù)分子功能大類中注釋到催化活性的unigenes數(shù)量多于結(jié)合存在差異，但與花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi［37］成蟲觸角在GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋得到的結(jié)果一致，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲的觸角中也存在大量具有與化學(xué)信息物質(zhì)結(jié)合的功能蛋白，例如OBPs。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)unigenes數(shù)量最多，有1146條，占總注釋基因的11.4%，觸角在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。與大多數(shù)昆蟲相似，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到一般功能預(yù)測(cè)的數(shù)量最多［38-40］。

3.4

某些基因的表達(dá)情況在不同性別昆蟲或者同性別昆蟲的不同組織間存在一定差異，例如鱗翅目中茶谷蛾Agriophara rhombata雌、雄蟲觸角中篩選得到1 307個(gè)差異表達(dá)基因，其中474個(gè)基因在雄性茶谷蛾觸角中上調(diào)表達(dá)，833個(gè)基因在雌性茶谷蛾觸角中上調(diào)表達(dá)［41］，大蠟螟Galleria mellonella雌、雄成蟲觸角中鑒定出了114個(gè)差異表達(dá)基因，66個(gè)基因在雌蟲觸角中高表達(dá)，48個(gè)基因在雄蟲觸角中高表達(dá)［42］。鞘翅目中眉斑并脊天牛Glenea cantor Fabricius的雌、雄蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中篩選得到了488個(gè)差異表達(dá)基因，其中268個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，220個(gè)基因下調(diào)表達(dá)［43］。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲觸角中篩選得到395個(gè)差異表達(dá)基因。以雌蟲觸角為對(duì)照組，在雄蟲觸角中上調(diào)表達(dá)的基因有288個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有107個(gè)，少于花椒窄吉丁雌、雄成蟲觸角中的726個(gè)差異表達(dá)基因［44］，多于不同性別四紋豆象Callosobruchus maculatus （F.）觸角中的231個(gè)差異表達(dá)基因［45］。與花椒窄吉丁相似的是，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在雄蟲觸角中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量高于雌蟲觸角，與前期用掃描電鏡觀察得知雄蟲觸角上的感器數(shù)量明顯多于雌蟲觸角相印證［20］。根據(jù)GO功能富集結(jié)果可知，雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲觸角的差異表達(dá)基因最顯著富集的功能為氣味結(jié)合和嗅覺受體活性，這些差異基因是導(dǎo)致雌蟲、雄蟲氣味感知差異的關(guān)鍵靶標(biāo)基因。395個(gè)差異表達(dá)基因只有95個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得代謝途徑富集，而大部分差異表達(dá)基因涉及的代謝通路是未知的，該未知通路的基因有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

對(duì)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲觸角進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，46.86%的unigenes在至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋信息。在雌蟲、雄蟲觸角中篩選出395個(gè)差異表達(dá)基因，與雌蟲觸角相比，288個(gè)基因在雄蟲觸角中上調(diào)表達(dá)，107個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。預(yù)測(cè)到雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄蟲中的差異表達(dá)基因主要涉及該葉甲的氣味識(shí)別過程。所選的氣味結(jié)合蛋白基因可在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲觸角中穩(wěn)定表達(dá)。

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