頭孢菌素菌渣有機(jī)肥對(duì)玉米土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因的影響

摘 要：【目的】研究頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用后對(duì)玉米農(nóng)田土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度的影響，為頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用生物安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

【方法】設(shè)置不施菌渣有機(jī)肥（CK）、施用菌渣有機(jī)肥500 kg /667m2（B1）、1 000 kg /667m2（B2）3個(gè)處理，分別采用可培養(yǎng)方法和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，分析各處理下玉米農(nóng)田中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度變化。

【結(jié)果】施用頭孢菌素菌渣有機(jī)肥能顯著提高玉米苗期和結(jié)果期土壤中細(xì)菌總數(shù)及苗期時(shí)頭孢拉定耐藥菌菌數(shù)。獲得了主要抗生素耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，分屬于6個(gè)屬。

【結(jié)論】施用頭孢菌素菌渣有機(jī)肥能顯著提高玉米苗期土壤中各ARGs基因的相對(duì)豐度，但在結(jié)果期各處理間β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對(duì)豐度無(wú)顯著影響，并對(duì)其它耐藥基因無(wú)明顯規(guī)律性影響。

關(guān)鍵詞：頭孢菌素菌渣；玉米土壤；耐藥菌；ARGs；q-PCR

中圖分類號(hào)：S512 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2024）04-1003-08

0 引 言

【研究意義】抗生素菌渣處理處置方法主要通過(guò)物理化學(xué)或生物處理，如焚燒、填埋、堆肥、厭氧消化、高溫高壓熱水解、微波、堿處理以及電離輻照等方法，實(shí)現(xiàn)菌渣的無(wú)害化處理。通過(guò)堆肥、厭氧消化、高溫高壓熱水解等處理能有效降低菌渣中殘留抗生素，進(jìn)而資源化利用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抗生素生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)形成菌渣［1］。目前，我國(guó)抗生素原料藥β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用量較大［2，3］。頭孢菌素是一種最為常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類抗生素［3，4］。菌渣科學(xué)處理已受到關(guān)注［5-11］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚缺少抗生素菌渣肥料化施用土壤后生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范。有研究表明施用頭孢菌素菌渣有機(jī)肥后，玉米土壤真菌豐富度和優(yōu)勢(shì)度顯著降低，潛在致病菌數(shù)量下降，但對(duì)玉米土壤耐藥菌及其抗性基因的影響尚不清楚，有待深入研究［12］。因此，有必要研究頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用后對(duì)玉米農(nóng)田土壤中耐藥菌及相關(guān)抗性基因豐度的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在玉米田設(shè)置不同菌渣有機(jī)肥施用量處理，在玉米主要生長(zhǎng)期檢測(cè)土壤中的抗生素抗性菌數(shù)量和種類，研究不同種類抗生素抗性基因的豐度變化，分析菌渣有機(jī)肥施用后農(nóng)田抗性菌及ARGs基因豐度的變化，為頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用后對(duì)農(nóng)作物土壤生物安全性評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)設(shè)在新疆伊犁（37°20′N，116°38′E），選用遼作1號(hào)為玉米品種供試，施用肥料為某生物制藥企業(yè)頭孢菌素菌渣無(wú)害化處理后制得的有機(jī)肥。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置不施藥渣有機(jī)肥對(duì)照組（CK），頭孢菌素菌渣有機(jī)肥施用量500 kg /667m2處理組1（B1），施用量1 000 kg /667m2處理組2（B2），每個(gè)處理組面積約為1 334 m2。播種前，將頭孢菌素菌渣有機(jī)肥作為底肥于當(dāng)年春季施入試驗(yàn)田，并取樣測(cè)定土壤頭孢菌素及理化性質(zhì)。表1

1.2.2 樣品采集

選擇在玉米的出苗期和結(jié)果期，按照“梅花五點(diǎn)”法，在每個(gè)處理小區(qū)選取5個(gè)典型樣方，采集表層（0～20 cm）土壤，剔除石頭、雜草等雜質(zhì)后，土樣用四分法充分混勻后保留2 kg，隨即放入裝有冰袋的采樣箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在24 h內(nèi)計(jì)數(shù)抗生素耐藥菌，剩余土壤樣品-80℃保存，備用。

1.2.3 細(xì)菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

取 10 g 土壤樣品，置于 100 mL 無(wú)菌生理鹽水中，120 r /min條件下振蕩 10 min，靜置 5 min，取 1 mL 土壤懸液按 10 倍系列稀釋后，取適宜稀釋度土壤懸液100 μL，涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。其中，總菌數(shù)計(jì)數(shù)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，耐藥菌的計(jì)數(shù)和篩選采用 50 μg/mL的硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的抗性營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.4 耐藥細(xì)菌的挑選及分子鑒定

耐藥菌挑選根據(jù)抗性平板中菌落形態(tài)、顏色、大小等進(jìn)行挑選，并在對(duì)應(yīng)的抗性平板上劃線純化，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)純化培養(yǎng)，直至獲得單菌落。

純化后單菌落采用菌落 PCR 方法，選用細(xì)菌 16S rDNA 序列通用引物 27F 和 1492R 進(jìn)行耐藥菌 PCR 擴(kuò)增［13］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)天根膠回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）切膠純化后，送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得菌株序列到 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)與BLAST 進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 ARGs檢測(cè)基因及擴(kuò)增

選取典型耐藥基因β-內(nèi)酰胺類ARGs（blaTEM）、紅霉素類 ARGs（ermB、ermF）、磺胺類 ARGs（sul1、sul2）等5種作為目標(biāo)檢測(cè)基因，并由生工生物工程（上海）有限公司合成。

以快速提取試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil）提取土壤總 DNA 為模板，參照王佳佳［14］、朱玥晗［15］方法，進(jìn)行 ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2目的基因的 PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序所得序列經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)產(chǎn)物準(zhǔn)確性。表2

1.2.6 不同ARGs的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

抗性基因PCR 純化產(chǎn)物與 pMD19-T 載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于50 μg/mL 氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)。挑取潛在陽(yáng)性單克隆，接種于含 50 μg/mL 氨芐青霉素抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，采用天根質(zhì)粒小提試劑盒（TIAN Pure Midi Plasmid Kit）提取質(zhì)粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

對(duì)鑒定正確的抗性基因質(zhì)粒，采用 Biotek Epoch 微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)） 檢測(cè)濃度以及純度，根據(jù)濃度值計(jì)算基因拷貝數(shù)［16］。質(zhì)粒 DNA 按 10 倍梯度稀釋作為定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)模版，參照 qPCR 試劑盒（Quanti Nova SYBR Green PCR Kit）條件進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primers 0.25 μL，Reverse Primers 0.25 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃，30 s；54 ℃， 30 s；72 ℃，30 s；30 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 10 min。分析各基因序列在不同濃度 PCR 擴(kuò)增的 Ct 值。以拷貝數(shù)的 log 值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算曲線方程。

1.2.7 土壤ARGs的定量

分別以各土壤 DNA 為模版，進(jìn)行不同基因qPCR 擴(kuò)增。待 qPCR 擴(kuò)增結(jié)束后，明確各土壤樣品 qPCR擴(kuò)增的 Ct 值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到土壤樣品中目的基因的絕對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel 軟件對(duì)常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總，采用 SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選用 GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

研究表明，玉米不同生育期可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)及抗生素耐藥菌菌落數(shù)之間存在一定差異。在苗期土壤樣品中，施加了頭孢菌素菌渣有機(jī)肥的土壤細(xì)菌總數(shù)、頭孢拉定耐藥菌和硫紅霉素耐藥菌均顯著高于對(duì)照組，而青霉素耐藥菌菌落數(shù)差異不顯著；到了結(jié)果期，施加了頭孢菌素菌渣有機(jī)肥的土壤中細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)顯著增加，而硫紅霉素耐藥菌顯著降低，而關(guān)孢拉定耐藥菌數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。表3

2.2 土壤中抗生素耐藥菌的種屬構(gòu)成

研究表明，共獲得各類耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，青霉素耐藥菌 30 株，紅霉素耐藥菌 3 株。共獲得 8 株頭孢拉定耐藥菌，分布于 6 個(gè)種屬，其中假單胞菌屬和短桿菌屬各 2 株，占總菌株數(shù)的 25%；所得青霉素耐藥菌株為11 個(gè)菌屬，其中，鏈霉菌屬菌株數(shù)最多，達(dá)到 14 株，占總菌株數(shù) 的 46.67%；獲得 3 株紅霉素耐藥菌，其中 2 株為假單胞菌。表4

2.3 不同 ARGs 及16S rDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

研究表明，各擴(kuò)增基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù) R2均高于 0.99，各基因濃度與 qPCR 的 Ct 值線性相關(guān)性較好。表5

2.4 施用有機(jī)肥后土壤中 ARGs 的絕對(duì)豐度

研究表明，施用頭孢菌素有機(jī)肥后，土壤中細(xì)菌總數(shù)在苗期影響不顯著，而在結(jié)果期是B1處理較其它處理存在顯著增加。在抗生素耐藥性基因方面，玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期各類 ARGs 之間存在一定差異，不同處理下 β-內(nèi)酰胺類ARGs（blaTEM）拷貝數(shù)均明顯高于紅霉素類 ARGs（ermB、ermF）和磺胺類 ARGs（sul1、sul2）。在出苗期，BlaTEM絕對(duì)拷貝數(shù)隨著有機(jī)肥施用量的增加顯著增加，而到結(jié)果期時(shí)，僅B2處理較其它處理存在顯著差異?；前奉怉RGs基因sul1、sul2的拷貝數(shù)在苗期時(shí)存在一定程度的降低，而在結(jié)果期時(shí)明顯增加，尤其是B2處理較其它處理顯著增加。紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF拷貝數(shù)對(duì)各個(gè)處理的不同時(shí)期均表現(xiàn)出差異不顯著。表6

2.5 施用有機(jī)肥后土壤中ARGs的相對(duì)豐度

研究表明，施用了頭孢菌素菌渣有機(jī)肥的玉米土壤中，各 ARGs基因相對(duì)豐度之間存在明顯差異；苗期玉米土壤中各ARGs（blaTEM）基因隨著施用量的增加相對(duì)豐度顯著增加，其中， blaTEM在低量添加B1處理中相對(duì)豐度較對(duì)照CK表現(xiàn)為顯著（P＜0.05），在低量添加B1處理中相對(duì)豐度較對(duì)照CK表現(xiàn)為較顯著（P＜0.01）；而紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF和磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對(duì)豐度表現(xiàn)出極顯著（P＜0.000 1）。在結(jié)果期，各處理中blaTEM相對(duì)豐度較對(duì)照CK差異不顯著；紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF相對(duì)豐度均表現(xiàn)出高添加B2處理較對(duì)照CK極顯著增加（P＜0.000 1）；磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對(duì)豐度卻在不同處理表現(xiàn)不同，sul1相對(duì)豐度在低添加B1處理時(shí)較對(duì)照呈現(xiàn)極顯著增加（P＜0.000 1），而sul2相對(duì)豐度在高添加B2處理時(shí)較對(duì)照呈現(xiàn)極顯著增加（P＜0.000 1）。圖 1～3

3 討 論

3.1

抗生素菌渣通過(guò)有效處理進(jìn)行肥料化可實(shí)現(xiàn)資源再利用，但是，如果菌渣在發(fā)酵過(guò)程中處置不完全，生產(chǎn)的有機(jī)肥中可能會(huì)有殘留抗生素和中間代謝產(chǎn)物等［17，18］。試驗(yàn)所施用的頭孢菌素菌渣無(wú)害化處理制得有機(jī)肥作為底肥的玉米田后，均未發(fā)現(xiàn)頭孢菌素殘留，其菌渣無(wú)害化肥料處理較為有效。

3.2

盡管在菌渣有機(jī)肥發(fā)酵無(wú)害化處理可以有效降解殘留抗生素或中間代謝產(chǎn)物，但發(fā)酵過(guò)程中菌渣殘留抗生素和中間代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)相關(guān)抗性菌群篩選和富集，可帶來(lái)潛在抗生素耐藥基因的富集和污染［5，6］。不同無(wú)害化處理過(guò)程對(duì)菌渣中抗生菌耐藥基因的影響不同，其形成的有機(jī)肥對(duì)環(huán)境影響也不同。周睫雅［3］對(duì)頭孢菌素菌渣肥料化利用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)水熱預(yù)處理噴霧干燥菌渣肥無(wú)抗生素殘留檢測(cè)出，但施用有機(jī)肥處理組中菌落總數(shù)明顯升高，菌群組成發(fā)生明顯變化，檢測(cè)的所有抗性基因和可移動(dòng)元件相對(duì)豐度均高于對(duì)照組，但與施用其它有機(jī)肥相比無(wú)顯著差異。張濤等［9］對(duì)頭孢菌素發(fā)酵菌渣利用電子束輻照-好氧堆肥無(wú)害資源化處理后，發(fā)現(xiàn)堆肥10 d抗生素殘留即無(wú)法液相色譜檢出，但堆肥過(guò)程中抗性基因erm B豐度有所減小，sul2豐度升高，有機(jī)肥施用過(guò)程中，對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)基本無(wú)害。研究中，施加頭孢菌素菌渣有機(jī)肥的玉米不同生長(zhǎng)期的土壤細(xì)菌總數(shù)顯著高于對(duì)照組，其結(jié)果與Zhou等［19］報(bào)道一致；但采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其細(xì)菌總數(shù)增加不顯著，表明通過(guò)施肥有效提升土壤中可培養(yǎng)菌群的數(shù)量，但土壤中總體微生物數(shù)量增加有限。

3.3

對(duì)耐藥基因相對(duì)豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在玉米苗期土壤中β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM、紅霉素類 ARGs基因ermB、ermF和磺胺類 ARGs基因sul1、sul2相對(duì)豐度較對(duì)照CK均表現(xiàn)出顯著增加，與周睫雅［19］相關(guān)研究一致。平然［20］也發(fā)現(xiàn)施用硫酸新菌素菌渣有機(jī)肥可明顯提高硫酸新霉素抗性基因acc（6’）ib相對(duì)豐度，但顯著低于商品有機(jī)肥施用土壤，相關(guān)耐藥性基因的增加可能因有機(jī)肥的施入通過(guò)肥效作用激活相關(guān)微生物，導(dǎo)致土壤微生物群落組成的改變，提高土壤中相關(guān)耐藥菌的增加，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)耐藥基因增加。在研究玉米結(jié)果期時(shí)，β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對(duì)豐度與對(duì)照相比差異不顯著，其它相關(guān)耐藥性盡管在各處理中也有不同程度的顯著增加，但與施肥量呈現(xiàn)規(guī)律性對(duì)應(yīng)。

4 結(jié) 論

施用不同濃度的頭孢菌素菌渣有機(jī)肥能顯著提高玉米不同時(shí)期的細(xì)菌總數(shù)，明顯提高了苗期時(shí)頭孢拉定耐藥菌菌數(shù)。獲得了主要抗生素抗性菌株耐藥菌株 41 株，其中，頭孢拉定耐藥菌 8 株，分屬于6個(gè)屬。施用頭孢菌素菌渣有機(jī)肥對(duì)玉米苗期土壤中三種常見(jiàn)ARGs的相對(duì)豐度有顯著提高，在結(jié)果期對(duì)β-內(nèi)酰胺類 ARGs基因blaTEM相對(duì)豐度無(wú)顯著影響。

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