雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成lncRNA相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

摘要：目的 篩選雞胚胎期肌肉差異表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）及mRNA，通過(guò)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘肌內(nèi)脂肪形成的重要候選基因。方法 分別采集玫瑰冠雞、科寶雞胚胎期的肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法篩選差異表達(dá)lncRNA、miRNA和mRNA，對(duì)差異表達(dá)基因GO富集及KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析，同時(shí)預(yù)測(cè)lncRNA-miRNA、miRNA-mRNA之間的靶標(biāo)關(guān)系，結(jié)合基因表達(dá)分析，構(gòu)建可能與肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用qRT-PCR驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果 玫瑰冠雞、科寶雞的胸肌、腿肌間共差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA分別是5個(gè)、225個(gè)和146個(gè)，GO和KEGG結(jié)果表明靶基因均富集在脂代謝或脂生成相關(guān)信號(hào)通路上，構(gòu)建由4個(gè)lncRNA、6個(gè)miRNA和6個(gè)mRNA組成16個(gè)節(jié)點(diǎn)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論 成功構(gòu)建雞肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步探究肌內(nèi)脂肪形成的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)，對(duì)今后優(yōu)質(zhì)肉雞的選育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞；胚胎期；肌內(nèi)脂肪；lncRNA；ceRNA

中圖分類號(hào)：S828文獻(xiàn)標(biāo)志碼：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

Construction of LncRNA-related CeRNA network for intramuscular fat formation in chicken embryo

SUN" Nanzhen，WANG" Jiajun，CHEN" Ruonan，SUN" Jie*

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： "Objective The aim of this study was to screen the differential expression of long non-coding RNA（lncRNA）， microRNA（miRNA） and mRNA in chicken embryonic muscle. And to explore the important candidate genes of intramuscular fat formation by constructing lncRNA-miRNA-mRNA competitive regulatory network. Methods In this study， the muscle tissues of Rose Crown chicken and Cobb chicken at embryonic period were collected for transcriptome sequencing， and the differentially expressed lncRNA， miRNA and mRNA were screened by bioinformatics methods. We analyzed the GO enrichment and KEGG signal transduction pathway of differentially expressed genes， and then predicted the target relationship between lncRNA-miRNA and miRNA-mRNA. Combined with gene expression analysis， a lncRNA-miRNA-mRNA competitive regulatory network that may be related to the formation of intramuscular fat was constructed， and used qRT-PCR to verify the accuracy of the sequencing data. Results The results showed that there were 5 lncRNAs， 225 miRNAs and 146 mRNAs common differentially expressed between breast and leg muscles of Rose crowned chicken and Cobb chicken. GO and KEGG results showed that the target genes were enriched in the signaling pathways related to lipid metabolism or adipogenesis. A 16-node ceRNA regulatory network consisting of 4 lncRNAs， 6 miRNAs and 6 mRNAs was constructed. Conclusions The ceRNA regulatory network of chicken intramuscular fat formation was successfully constructed. This study provided a reference for further exploring the molecular regulation mechanism of intramuscular fat formation. And laid a foundation for the breeding of high-quality broilers in the future.

Key words： chicken;embryonic period;intramuscular fat;lncRNA;ceRNA

人們對(duì)肉的需求從以前的數(shù)量轉(zhuǎn)向現(xiàn)在的質(zhì)量，風(fēng)味、色澤及口感等是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪能夠降低肌肉的剪切力、提高肉質(zhì)嫩度以及對(duì)肉的多汁性和風(fēng)味起重要作用［1］。而動(dòng)物體內(nèi)脂肪沉積是一個(gè)很復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，不僅受能量水平、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸、酶、激素等影響，遺傳因素也是極其重要的內(nèi)容。為了提供高品質(zhì)肉，育種者從基因著手尋找能夠增加肌內(nèi)脂肪的調(diào)控因子。據(jù)報(bào)道肌內(nèi)脂肪是中等遺傳力的性狀［2］，不同品種的雞脂肪沉積具有顯著差異。家禽脂肪細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞，胚胎期中期肌內(nèi)脂肪開(kāi)始形成，出雛生長(zhǎng)后期則只能通過(guò)增大脂肪細(xì)胞的體積來(lái)增加脂肪的含量［1］，且課題組前期結(jié)果表明，玫瑰冠雞和科寶雞的腿肌、胸肌分別在7、8胚齡開(kāi)始沉積［3］，因此認(rèn)為胚胎期作為脂肪生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期對(duì)最終的脂肪含量有決定性作用，但其潛在的分子調(diào)控機(jī)制所知甚少。

2011年提出了“競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）”假說(shuō)［4］，即lncRNA、環(huán)形RNA（circRNA）可以作為分子海綿，通過(guò)吸附miRNA發(fā)揮ceRNA的作用，對(duì)miRNA的功能產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)水平，最終調(diào)控各種生物學(xué)功能。近幾年ceRNA在脂肪沉積過(guò)程中的研究逐漸增多，lncRNAIMFNCR能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-128-3p和miR-27b-3p，從而導(dǎo)致靶基因PPARγ表達(dá)水平上升，促進(jìn)雞脂肪細(xì)胞分化［5］。miRNA-2l5-5p通過(guò)靶向NCOA3負(fù)調(diào)控雞腹部脂肪形成，而gga-circ-0002520能夠降低miRNA-215-5p對(duì)NCOA3的抑制作用［6］。lncRNA-FNIP2作為miR-24-3p的競(jìng)爭(zhēng)性分子海綿影響靶基因FNIP2的表達(dá)水平，從而促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成［7］。

玫瑰冠雞有巨大且鮮紅的桑葚狀冠型，因其良好的肉品質(zhì)及獨(dú)特的風(fēng)味深受人們喜愛(ài)，肉質(zhì)鮮美，極具食用和觀賞價(jià)值［8］。鑒于ceRNA在雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成方面的研究較少，本文通過(guò)鑒定新疆本土肉品質(zhì)較好的玫瑰冠雞和快大型肉雞科寶雞胚胎期肌肉中差異表達(dá)的lncRNA、miRNA，并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能富集，構(gòu)建肌內(nèi)脂肪相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究非編碼RNA調(diào)控胚胎期肌內(nèi)脂肪形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本選擇

本試驗(yàn)所用玫瑰冠雞、科寶雞種蛋分別由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站和新疆泰昆種雞場(chǎng)提供，常規(guī)程序孵化。采集玫瑰冠雞（M）、科寶雞（K）胚胎期第7天腿?。═）和第8天的胸?。╔），所得樣品置于Trizol試劑（Thermo Scientific，美國(guó)）中，隨后放入液氮中保存，MX、KX、MT和KT每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

Trizol法提取胸肌、腿肌總RNA，并采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳、DanoPhotometer分光光度計(jì)（IMPLEN，CA，USA）、Qubit和Bioanalyzer 2100測(cè)定RNA的質(zhì)量、濃度及完整性。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后構(gòu)建文庫(kù)并利用Illumina Hiseq 4000測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，這一工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

FastQC、NGSQC Toolkit軟件評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量并篩選，剔除原始序列數(shù)據(jù)包含接頭及質(zhì)量較低的序列，得到Clean reads數(shù)據(jù)。Bowti2和HISAT2 v2.0.4軟件把過(guò)濾測(cè)序數(shù)據(jù)同雞參考基因組比對(duì)，然后用StringTie（v1.3.1）進(jìn)行組裝。最后使用Pfam-sca（E-value＜0.001）、CPC（score＜0）和CNCI（score＜0）編碼能力預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)lncRNA，用miREvo和mirDeep2軟件預(yù)測(cè)miRNA。

1.4 差異表達(dá)分析

Cuffdiffv2.1.1軟件定量分析lncRNA、miRNA及mRNA，R包edgeR、DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選2組中表達(dá)量logFC＞2以及FDR≤0.05。

1.5 LncRNA、miRNA的靶基因預(yù)測(cè)和功能分析

搜索lncRNA上、下游100kb內(nèi)的順式靶基因，選擇Pearson相關(guān)系數(shù)（r＞0.95）的靶標(biāo)作為潛在反式靶基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行spearman相關(guān)性分析。Targetscan、miRanda軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。使用GOseq（http：//www.geneontology.org/）對(duì)靶基因進(jìn)行GO注釋，Kobas2.0進(jìn)行KEGG功能富集分析，P值≤0.05則富集程度達(dá)到顯著，最后得到的結(jié)果用R包ggplot2進(jìn)行繪圖。

1.6 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用miRanda軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)lncRNA與miRNA的靶向關(guān)系，結(jié)合各自的靶基因，篩選出與脂肪相關(guān)的互作關(guān)系對(duì)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最后用cytoscape軟件對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.7 測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證

測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)挑選lncRNA、miRNA和mRNA各8個(gè)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，定量所用引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)lncRNA、miRNA與mRNA的鑒定

本研究在MXvsKX中鑒定出差異表達(dá)lncRNA127個(gè)，MTvsKT中25個(gè)，差異表達(dá)分析后得到5個(gè)lncRNA在MX、KX、MT和KT間共差異表達(dá)（圖1A）。同時(shí)在MXvsKX、MTvsKT中分別鑒定出280、335個(gè)差異表達(dá)miRNA，225個(gè)共差異表達(dá)miRNA（圖1B）。在4個(gè)組中共差異表達(dá)基因146個(gè)（圖1C）。

2.2 LncRNA靶基因的功能富集分析

對(duì)差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明其顯著富集在代謝過(guò)程、基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細(xì)胞大分子分解代謝過(guò)程、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程；細(xì)胞成分富集在核糖體細(xì)胞成分、大分子復(fù)合物細(xì)胞組分、細(xì)胞外膜、纖維蛋白復(fù)合物和線粒體內(nèi)膜等；分子功能中富集到RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、翻譯因子活性、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合（圖2A）。

KEGG通路分析表明，部分基因顯著富集在脂肪生成相關(guān)通路上：類固醇激素生物合成、PPAR信號(hào)通路、亞油酸代謝等通路（圖2B）。

2.3 miRNA靶基因的功能富集分析

對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO分析表明部分基因顯著富集于生物合成過(guò)程、轉(zhuǎn)錄過(guò)程、細(xì)胞增殖和分化、調(diào)控核酸結(jié)合的分子功能（圖3A）。KEGG通路分析表明，miRNA"" 靶基因顯著富集于TGF-β信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、脂肪酸降解等通路（圖3B），這些均是脂肪代謝相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路，這表明本實(shí)驗(yàn)篩選到的miRNA可能通過(guò)上述信號(hào)通路參與調(diào)控雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成。

2.4 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

不同組別間篩選共差異表達(dá)lncRNA及其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的miRNA，再篩選與脂肪形成相關(guān)的靶基因，分別對(duì)lncRNA、miRNA和靶基因進(jìn)行表達(dá)分析，構(gòu)建出與肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包含4個(gè)lncRNA、6個(gè)miRNA和6個(gè)mRNA（圖4）。以科寶雞為參照，lncRNA有2個(gè)表達(dá)下調(diào)，2個(gè)上調(diào)，且均是已注釋lncRNA。miRNA有2個(gè)表達(dá)上調(diào)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)，都具有較高的差異表達(dá)倍數(shù)，其中g(shù)ga-miR-402屬于新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其余5個(gè)已注釋miRNA中g(shù)ga-miR-1677-5p和gga-miR-103-3p已被證實(shí)能調(diào)控脂肪生成。該ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中靶基因的表達(dá)有3個(gè)上調(diào)3個(gè)下調(diào)，且均富集到脂肪生成或脂肪代謝相關(guān)信號(hào)通路中。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

qRT-PCR驗(yàn)證隨機(jī)挑選的lncRNA、miRNA和mRNA，結(jié)果如圖5所示，測(cè)序結(jié)果和定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異倍數(shù)存在偏差，但表達(dá)趨勢(shì)相同，表明測(cè)序數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確可靠。

3 討論

ceRNA作為新生領(lǐng)域成為近幾年的研究熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其參與多種生物學(xué)過(guò)程，例如癌癥發(fā)生、肌細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞分化等。lncRNAKCNMB2-AS1能夠競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-509-3p，使得靶基因核糖體蛋白S6激酶A1（RPS6KA1）的表達(dá)水平升高，并且發(fā)現(xiàn)RPS6KA1是mTOR信號(hào)通路中的重要基因，所以KCNMB2-AS1-miR-509-3p-RPS6KA1可能是通過(guò)mTOR信號(hào)通路來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展［9］。在小鼠成肌細(xì)胞中，lncRNAMalat1通過(guò)吸附miR-129-5p從而調(diào)控下游基因肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（Mef2a），促進(jìn)成肌細(xì)胞分化及慢肌基因肌球蛋白重鏈1（MyHCI）的表達(dá)［10］。為了探究lncRNANEAT1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）成脂分化的作用，姚明康［11］在鼠和人來(lái)源的MSCs成脂分化過(guò)程中成功驗(yàn)證了lncRNANEAT1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-875-3p，影響了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)從而促進(jìn)MSCs成脂分化。

lncRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性分子海綿吸附miRNA來(lái)調(diào)控mRNA的表達(dá)在很多物種中的研究較成熟，但雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)lncRNA的功能所知甚少，因此從高差異表達(dá)lncRNA、miRNA和脂肪相關(guān)的靶基因來(lái)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)驗(yàn)證其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。此ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共16個(gè)節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生10個(gè)相互作用，分別是lnc-PACS2-gga-miR-1677-5p-FLVCR1、lnc-PACS2-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-PACS2-gga-miR-6659-3p-ADAMTS1、lnc-DNAJC3-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-DNAJC3-gga-miR-1677-5p-FLVCR1、lnc-ECM1-gga-miR-103-3p-UQCRC2、lnc-ECM1-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-ECM1-gga-miR-3523-MYL4、1nc-GNG7-gga-miR-402-LDB1、lnc-GNG7-gga-miR-402-PFDN5。

研究表明gga-miR-1677-5p能夠抑制細(xì)胞增殖，并且抑制雞前脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程［12］，而預(yù)測(cè)靶基因FLVCR1是血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，該基因與2型糖尿病患者的全身性葡萄糖代謝有關(guān)，和與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)［13］。因此lnc-PACS2、lnc-DNAJC3可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附gga-miR-1677-5p促進(jìn)FLVCR1的表達(dá)進(jìn)而增加脂肪生成。gga-miR-103-3p在固始雞中預(yù)測(cè)與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)［14］，能顯著增加小鼠肝組織中脂滴的積累和脂質(zhì)代謝異常［15］。UQCRC2是泛醇-細(xì)胞色素c還原酶核心蛋白2，在白色脂肪細(xì)胞中作為線粒體活性代表物質(zhì)對(duì)脂質(zhì)代謝很重要［16］。通過(guò)它們之間的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)lnc-ECM1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合gga-miR-103-3p促使UQCRC2表達(dá)水平升高，進(jìn)而抑制脂滴合成。一種具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶（ADAMTS1）被預(yù)測(cè)能夠影響奶牛乳脂代謝［17］，該基因在小鼠脂肪組織中敲除后造成脂肪組織脂質(zhì)增加，胰島素敏感性降低，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞，表明ADAMTS1能夠維持細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂肪組織的生成［18］，因此可以猜測(cè)gga-miR-6659-3p促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的其中一條途徑是通過(guò)降低ADAMTS1的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，而lnc-PACS2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附gga-miR-6659-3p減少gga-miR-6659-3p對(duì)ADAMTS1的抑制作用。棕色脂肪細(xì)胞中含有大量的線粒體，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪含量和產(chǎn)熱的功能，對(duì)肥胖有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LIM域綁定1（LDB1）基因在小鼠和人的棕色脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，與棕色脂肪功能調(diào)節(jié)有關(guān)，使得脂肪細(xì)胞更大更多［19］。lnc-GNG7與未注釋的gga-miR-402有結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)它作為競(jìng)爭(zhēng)性RNA能夠促進(jìn)靶基因LDB1的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。MYL4基因是肌球蛋白輕鏈家族成員之一，該家族中多數(shù)基因與肌細(xì)胞發(fā)育和肌纖維分化有關(guān)，少數(shù)也被證明與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)，且在不同物種間的生物學(xué)功能研究存在差異。例如MYL2磷酸化能夠促進(jìn)棕色脂肪前體細(xì)胞分化，抑制棕色脂肪白色化，對(duì)改善小鼠肥胖起重要作用［20］，但在牛物種中MYL2則與肌肉發(fā)育相關(guān)［21］?；騇YL4在寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪中差異表達(dá)，可能與脂肪沉積有關(guān)［22］，推測(cè)MYL4在雞上也有相似的功能。對(duì)山羊腎周脂肪組織RNA-seq鑒定，前折疊蛋白亞基5（PFDN5）被認(rèn)為是棕色脂肪組織向白色脂肪組織過(guò)渡過(guò)程中最為合適的參考基因之一［23］。本研究篩選到多個(gè)調(diào)控雞肌內(nèi)脂肪形成的lncRNA-miRNA-mRNA，但其在肌內(nèi)脂肪形成過(guò)程中的具體功能仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究在玫瑰冠雞和科寶雞的胸肌、腿肌間鑒定出共差異表達(dá)lncRNA5個(gè)、miRNA225個(gè)及mRNA146個(gè)。成功構(gòu)建雞肌內(nèi)脂肪形成lncRNA相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括16個(gè)節(jié)點(diǎn)和10個(gè)相互作用。該結(jié)果為進(jìn)一步探究雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成的分子調(diào)控機(jī)制提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）