標(biāo)準(zhǔn)曲線法與自動(dòng)閾值法對(duì)TREC檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的影響

摘 要：為評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè) T 細(xì)胞受體剪切環(huán)（TREC）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法或自動(dòng)閾值法對(duì)不同操作批次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的影響，采用同一批次TREC檢測(cè)試劑盒重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中內(nèi)參基因與靶標(biāo)TREC的Ct值，同時(shí)重復(fù)檢測(cè)一組TREC低值樣本的Ct值；分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)閾值法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，比較兩種分析方法得到結(jié)果（Ct值）的穩(wěn)定性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和TREC低值樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，兩種分析方法得到的Ct值與兩個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)稱(chēng)濃度（log10）均呈線性相關(guān)，R²為1.00。兩種方法獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中內(nèi)參基因Ct平均值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法較自動(dòng)閾值法平均低1.26，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中TREC基因Ct平均值，前者較后者平均低0.96。對(duì)TREC低值樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果表明，同一樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的兩種靶標(biāo)Ct值的變異系數(shù)（CV）和極差均低于自動(dòng)閾值法。表明在以實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)TREC靶標(biāo)從而進(jìn)行重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法的分析結(jié)果穩(wěn)定性優(yōu)于自動(dòng)閾值法。

關(guān)鍵詞：重癥聯(lián)合免疫缺陷；T細(xì)胞受體剪切環(huán)；實(shí)時(shí)熒光PCR；標(biāo)準(zhǔn)曲線

中圖分類(lèi)號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Influence of standard curve method and automatic threshold method on the stability of TREC test results

XU Weijia， SHI Lin， ZHAO Shumin， LU Daru

（School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433， China）

Abstract： To evaluate the effects of standard curve method or automatic threshold method on the results stability of repeated detection in different batches when real-time fluorescent PCR was used to detect T-cell receptor excision circles （TREC）. Ct values of reference gene and target TREC in standard plasmid were repeatedly detected with the same batch of TREC detection kit， and Ct values of a group of samples with low TREC value were repeatedly detected. Standard curve method and automatic threshold method were used to analyze the detection results respectively， and the stability of the results （Ct value） obtained by the two analysis methods was compared. The detection results of standard plasmid and TREC samples with low value show that the Ct values obtained by the two analysis methods were linearly correlated with the nominal concentration （log10） of the two targets， R² was 1.00. The average Ct values of reference genes in standard plasmid were obtained by the two methods. The average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 1.26 lower than those using automatic threshold method， and the average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 0.96 lower than those using automatic threshold method. The results of repeated detection of low-value TREC samples show that the coefficient of variation （CV） and range of Ct values of two targets obtained by standard curve method in the same sample were lower than those obtained by automatic threshold method. The findings indicate that the stability of the standard curve method was better than the automatic threshold method when the TREC target was detected by real-time fluorescent PCR for screening severe combined immunodeficiency （SCID）.

Key words： severe combined immunodeficiency （SCID）; T-cell receptor excision circles （TREC）; real-time fluorescent PCR; standard curve

在T細(xì)胞成熟過(guò)程中，每產(chǎn)生一種T細(xì)胞受體（TCR），均伴隨一個(gè)TCR剪切環(huán)（TREC）的形成，且TREC不隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制［1-2］。因此，TREC檢測(cè)（TREC assay）被廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞缺陷相關(guān)的新生兒先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查［2-4］。在T細(xì)胞缺陷相關(guān)的SCID中，由于T細(xì)胞成熟障礙， TCR受體形成受阻，在新生兒血樣中往往無(wú)法檢出足量的TREC［3，5］。目前已有相應(yīng)的商品化TREC檢測(cè)試劑盒，如PE公司的EnLiteTM Neonatal TREC Kit ［6］，ThermoFisher公司的TaqManTM SCID/SMA Plus 測(cè)定試劑盒［7］，但學(xué)界在TREC的量綱以及檢測(cè)技術(shù)方法等諸多方面仍存在爭(zhēng)議。如KWOK等［8］探討了TREC檢測(cè)中，兩種不同量綱（copies/μL、copies/106cells）的合理性。在方法學(xué)上，EnLiteTM Neonatal TREC Kit對(duì)待檢樣本中內(nèi)參基因和TREC同時(shí)進(jìn)行絕對(duì)定量的方法，并以copies/105 cells為量綱進(jìn)行結(jié)果報(bào)告［9］；而TaqManTM SCID/SMA Plus 測(cè)定試劑盒是以定性方式進(jìn)行結(jié)果報(bào)告，即以TREC無(wú)法檢出作為陽(yáng)性結(jié)果［10］。國(guó)內(nèi)亦有公司開(kāi)發(fā)了基于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的TREC試劑盒。對(duì)于大部分基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的IVD產(chǎn)品，例如SARS-COV-2檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)中是以擴(kuò)增信號(hào)陽(yáng)性作為臨床陽(yáng)性結(jié)果，當(dāng)Ct值大于35時(shí)判為陰性；而SCID的檢測(cè)與此相反，患兒通常存在TREC缺失，則在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)以加入足夠擴(kuò)增模板的情況下Ct值仍大于35作為陽(yáng)性結(jié)果［11］。因此，對(duì)TREC檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷時(shí)，不同的分析方案（如使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，或采用熒光PCR儀的自動(dòng)閾值分析法）對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果判定的影響可能將無(wú)法忽略。在本研究中，采用一種TREC檢測(cè)試劑盒，評(píng)估了在基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的TREC檢測(cè)中，兩種不同分析方案對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以及TREC低值樣本檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，以期為T(mén)REC在新生兒SCID篩查的方法學(xué)構(gòu)建提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑采用TREC-KREC 聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光定量PCR法）（上海晶準(zhǔn)生物醫(yī)藥有限公司），儀器選取實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ThermoFisher Scientific Inc.，型號(hào)Applied Biosystems^TM 7500）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備及檢測(cè)方案

該試劑盒包含一個(gè)內(nèi)參基因與TREC拷貝比為1∶1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。依據(jù)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度和分子量，將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋至2×10⁷ copies/μL，并命名為S7。將S7和水按1∶10的比例進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋至2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³和2×10² copies/μL，依次命名為S6、S5、S4、S3、S2，每個(gè)PCR反應(yīng)加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。各梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)批次，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度梯度共計(jì)可測(cè)得72個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.2.2 低值樣本制備及檢測(cè)方案

本研究所涉及的TREC低值樣本信息與檢測(cè)方案見(jiàn)表1。其中TL1人組織樣本DNA中不含TREC，而TL2成年志愿者外周血DNA中的TREC水平低于試劑盒標(biāo)示的最低檢出限，二者均與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋液S2進(jìn)行混合，制備成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL TREC低值樣本。剩余4例樣本所用的成年人志愿者外周血DNA均已進(jìn)行TREC定量檢測(cè)，根據(jù)TREC檢測(cè)值分別使用人組織樣本DNA進(jìn)行稀釋?zhuān)苽涑山K質(zhì)量濃度為100 ng/μL的TREC中低值樣本。制備完成的6例樣本DNA質(zhì)量濃度均為100 ng/μL，以保證每例樣本檢測(cè)中，內(nèi)參基因定量結(jié)果基本一致。依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，每個(gè)PCR反應(yīng)起始模板量為200 ng，按1 ng基因組DNA約150個(gè)細(xì)胞［12］，則每個(gè)PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因的理論值約為6×10⁴拷貝/反應(yīng)。每次測(cè)試都設(shè)置空白對(duì)照，空白對(duì)照每次上機(jī)做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 獲得Ct值

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

以S2至S7共6個(gè)梯度的質(zhì)粒樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用軟件Real-Time PCR Software v2.4構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。水平閾值線設(shè)定在標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R²為1.000且空白對(duì)照（H₂O）的Ct值大于35或無(wú)信號(hào)，由此得到樣本TL1～TL6的Ct值，記作Ct-SC?；€的設(shè)置采用AUTO模式。

1.3.2 自動(dòng)閾值法

將S2至S7共6個(gè)梯度的質(zhì)粒樣本與樣本TL1～TL6均作為待測(cè)樣本，水平閾值線、基線范圍設(shè)置均采用熒光定量PCR儀的自動(dòng)分析模式，此時(shí)得到的各檢測(cè)樣本的Ct值記作Ct-AUTO。自動(dòng)分析模式下，NTC（H₂O）的Ct值均大于35或無(wú)信號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果分析

分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)閾值法下獲得的Ct值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差，采用GraphPad Prism（版本號(hào)8.0.2.263）對(duì)兩種分析方法得到的Ct值與各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)稱(chēng)濃度作線性相關(guān)分析，得到兩種分析方法下的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的擴(kuò)增效率。

1.4.2 TREC低值樣本檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性分析

分別計(jì)算每個(gè)TREC低值樣本在4個(gè)操作批次共20次測(cè)量中，兩種分析方法得到的內(nèi)參基因與TREC的Ct值的變異系數(shù)（CV），并計(jì)算各樣本根據(jù)兩種分析方法得到的4個(gè)操作批間Ct值的極差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩種分析方法得到的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒樣本的檢測(cè)結(jié)果

各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-SC與Ct-AUTO的均值（AVE）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與變異系數(shù)（CV）見(jiàn)表2、表3。對(duì)于內(nèi)參基因IR，各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加1.26；對(duì)于TREC，各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加0.96。依據(jù)表2、表3，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線法與自動(dòng)閾值法分析模式下的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。依據(jù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，計(jì)算內(nèi)參基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)分析模式下的擴(kuò)增效率分別為100.5%和100.1%，TREC的擴(kuò)增效率分別為100.1%和99.3%，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品S7起始模板量2×107 拷貝/反應(yīng)及低濃度標(biāo)準(zhǔn)品S2起始模板量2×10² 拷貝/反應(yīng)均在正常擴(kuò)增范圍內(nèi)。

2.2 不同分析方法對(duì)低值樣本Ct值CV影響

6例TREC低值樣本，每例樣本各20次測(cè)量，兩種靶標(biāo)測(cè)量結(jié)果（以Ct值表示）的CV見(jiàn)圖2。

兩種不同的分析方案，同一樣本、兩種靶標(biāo)、不同分析方法、操作批間的Ct值CV均＜5%，這一結(jié)果符合我國(guó)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于1%，在AUTO模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均介于2%～3%之間，各樣本中，相同靶標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的Ct值CV均小于自動(dòng)閾值法獲得Ct值的CV。

2.3 不同分析方法對(duì)Ct值變化的影響

TL1～TL6樣本各20次測(cè)量，不同分析方法對(duì)兩種靶標(biāo)Ct值測(cè)量結(jié)果的影響見(jiàn)表4和圖3。對(duì)內(nèi)參基因IR，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.33～0.46之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于1.42～1.62之間。對(duì)于靶標(biāo)TREC，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.44～1.18之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于2.15～3.03之間。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、成本低廉，而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)［15-17］，采用這一技術(shù)方案所開(kāi)發(fā)的試劑盒，依據(jù)其檢測(cè)目的分為定量檢測(cè)和定性檢測(cè)兩大類(lèi)［18］。以病毒核酸的檢測(cè)，如2019-nCoV的核酸定性檢測(cè)為例，由于病毒核酸相對(duì)于感染宿主為外源核酸［19］，在定性檢測(cè)時(shí)通常以Ct值小于35為陽(yáng)性［11］；在定量檢測(cè)時(shí)則需要制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如HBV［20］、HCV［21］以及甲型與乙型流感病毒［12］的定量檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量［18］。

研究表明，TREC作為一種游離于基因組DNA之外的內(nèi)源核酸靶標(biāo)，在SCID的篩查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［3，8，22-23］。但與病毒等外源核酸以檢出靶核酸信號(hào)作為陽(yáng)性判斷結(jié)果不同，在新生兒樣本中，當(dāng)TREC含量極低或無(wú)TREC信號(hào)時(shí)，代表可能患有T細(xì)胞缺陷相關(guān)的SCID［3，5，24］。這對(duì)基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的TREC檢測(cè)的靈敏度與穩(wěn)定性提出了更高的要求，因?yàn)闊晒鈹U(kuò)增信號(hào)陰性既與反應(yīng)體系中是否加入足夠的待測(cè)模板有關(guān)，又與熒光擴(kuò)增信號(hào)的判斷，尤其是水平閾值線的確定方法密切相關(guān)，對(duì)于擴(kuò)增信號(hào)處于臨界水平的樣本更是如此。

本研究首先以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒評(píng)價(jià)了一種TREC檢測(cè)試劑盒的線性范圍以及對(duì)內(nèi)參基因IR和TREC的擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示這一實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線法以及自動(dòng)水平閾值分析模式下，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的擴(kuò)增效率無(wú)顯著差異。無(wú)論是對(duì)IR還是TREC，自動(dòng)閾值法得到的Ct均值大于標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的Ct均值。Ct值的增加意味著對(duì)相應(yīng)靶標(biāo)定量結(jié)果的低估，對(duì)最終定性結(jié)果可能存在影響。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同分析方法對(duì)實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果的影響，采用成年志愿者外周血DNA以及人組織DNA與低值標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋液模擬了TREC的低值樣本，通過(guò)技術(shù)重復(fù)與操作批間重復(fù)，比較了標(biāo)準(zhǔn)曲線法與自動(dòng)閾值法兩種分析方案對(duì)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的影響。兩種分析方案下，各樣本內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的Ct值的CV均滿足我國(guó)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。但I(xiàn)R靶標(biāo)和TREC靶標(biāo)的同一樣本由標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到結(jié)果的CV均小于由自動(dòng)閾值法得到結(jié)果的CV，且不同樣本初始模板量（均為200 ng/反應(yīng)）相同，不同樣本的內(nèi)參基因IR的檢測(cè)結(jié)果理論值應(yīng)相同，標(biāo)準(zhǔn)曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于AUTO模式下的CV，這種分析結(jié)果的差異唯一影響因素是分析方法，反映出不同分析方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的影響。

為進(jìn)一步研究分析方法對(duì)操作批間穩(wěn)定性的影響，比較了同一樣本不同操作批間不同分析方案得到的Ct值均值的極差的變化，不論是內(nèi)參基因IR還是靶基因TREC，SC分析模式下得到結(jié)果的極差均小于AUTO分析模式下結(jié)果的極差。對(duì)于內(nèi)參基因IR的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于1.42～1.62之間，由于內(nèi)參基因IR是用于標(biāo)定加入反應(yīng)體系中的細(xì)胞數(shù)量，這一結(jié)果表明，即使是同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間獲得的細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)定結(jié)果也將相差2～3倍。而對(duì)于TREC的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于2.15～3.03之間，每差一個(gè)Ct值代表PCR相差一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，基因拷貝數(shù)會(huì)呈倍數(shù)變化，這表明即使是對(duì)于同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間靶基因的定量（拷貝數(shù)）也將相差4～8倍。更重要的是，對(duì)于TREC低值樣本，AUTO分析模式下的這樣的批間差，將可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，對(duì)于類(lèi)似TREC的內(nèi)源基因組以外的靶基因的檢測(cè)，以擴(kuò)增信號(hào)陰性作為陽(yáng)性判斷結(jié)果時(shí)，配備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定擴(kuò)增熒光信號(hào)的水平閾值線，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判斷是必要的，有利于降低假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。

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