微小RNA-199a-3p對小鼠皮膚瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制作用及其機制

摘要：目的 探討微小RNA-199a-3p（miR-199a-3p）對小鼠皮膚瘢痕疙瘩成纖維細胞的調(diào)控作用及其作用靶基因。方法 構(gòu)建小鼠皮膚瘢痕疙瘩模型，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-199a-3p、瘢痕疙瘩相關(guān)基因和Smad1的mRNA表達。原代分離和體外培養(yǎng)成體C57BL/6小鼠皮膚成纖維細胞；利用脂質(zhì)體將miR-199a-3p模擬物和Smad1 siRNA轉(zhuǎn)染至小鼠皮膚成纖維細胞中；雙熒光素酶報告實驗驗證miR-199a-3p的靶基因；Cell Counting Kit-8（CCK8）方法驗證miR-199a-3p和沉默Smad1對皮膚成纖維細胞增殖的影響；RT-qPCR和Western blot法分別檢測過表達miR-199a-3p皮膚成纖維細胞的瘢痕疙瘩相關(guān)基因和Smad1的mRNA和蛋白表達；Western blot檢測小鼠皮膚成纖維細胞分別轉(zhuǎn)染Smad1 siRNA和miR-199a-3p模擬物后瘢痕疙瘩相關(guān)基因、Smad1的蛋白表達。結(jié)果 疤痕疙瘩組織中瘢痕疙瘩相關(guān)基因Col1a1（t=-3.334，P=0.016）、Col3a1（t=-5.927，P=0.001）和ACTA2（t=-3.673，P=0.010）mRNA表達和Smad1（t=-4.403，P=0.010）表達顯著高于正常小鼠皮膚組織，而miR-199a-3p（t=7.059，Plt;0.001）表達顯著下降。在皮膚成纖維細胞中過表達miR-199a-3p可以抑制瘢痕疙瘩的相關(guān)基因Col1a1（t=5.514，P=0.005）、Col3a1（t=5.132，P=0.014）和ACTA2（t=4.136，P=0.026）mRNA表達和相關(guān)蛋白Col1a1（t=4.643，P=0.001）、Col3a1（t=6.554，P=0.003）和α-SMA（t=4.681，P=0.008）表達。miR-199a-3p與Smad1 3′-UTR有結(jié)合作用。過表達miR-199a-3p抑制Smad1 mRNA（t=3.556，P=0.024）和蛋白（t=3.781，P=0.019）的表達。分別轉(zhuǎn)染miR-199a-3p模擬物和Smad1 siRNA后均能同時抑制小鼠皮膚成纖維細胞的增殖（F=18.622，Plt;0.001、lt;0.001）和瘢痕疙瘩的相關(guān)蛋白Col1a1（F=18.804，P=0.003、0.022）、Col3a1（F=33.212，P=0.001、0.001）和α-SMA（F=10.181，P=0.020、0.028）表達。結(jié)論 miR-199a-3p通過靶向Smad1抑制瘢痕疙瘩的形成。

關(guān)鍵詞：皮膚瘢痕疙瘩；皮膚成纖維細胞；微小RNA；Smad1

中圖分類號：R751 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202406008

收稿日期：2024-04-10 修回日期：2024-07-10

基金項目：廣東省中醫(yī)藥局科研項目（No. 20241368）；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才類項目（No. 2023KQNCX252）

Supported by the Research Project of Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine （No. 20241368） and Guangdong Province Youth Innovation Talent Program for Ordinary Universities （No. 2023KQNCX252）

通信作者：冼文嬌，講師. E-mail： 15920805018@139.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240719.0827.002.html （2024-07-20）

Inhibition of microRNA-199a-3p on mouse skin keloid formation and its mechanism

XIAN Wenjiao^1，2， LIANG Jingnan³， LU Wei^1，2， HONG Yuehui^1，2

（1. School of Basic Medicine， Guangdong Jiangmen Chinese Medicine College， Jiangmen 529000; 2. Jiangmen Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Ingredients and Their Mechanisms of Action， Jiangmen 529000; 3. Department of Pharmacy， Jiangmen Central Hospital， Jiangmen 529030， China）

ABSTRACT： Objective To investigate the role of miR-199a-3p on mouse skin scar fibroblasts and the potential target of miR-199a-3p. Methods A mouse skin keloid model was established. The mRNA levels of miR-199a-3p， Smad1 and keloid related genes in keloid tissues and normal skin tissues were detected by Real-time quantitative PCR. C57BL/6 mouse skin fibroblasts were isolated and cultured for the cellular experimental study. miR-199a-3p mimic and Smad1 siRNA matter were transiently transfected into mouse skin fibroblasts by liposome reagent. the interaction between miR-199a-3p and the 3′-UTR of Smad1 was confirmed by the dual luciferase reporter assay. The expressions of Smad1 and keloid-related genes at mRNA and protein levels after transfection of miR-199a-3p mimic were determined. The expressions of Smad1 and keloid-related genes at protein level after transfection of miR-199a-3p mimic and Smad1 siRNA were determined by Western blot assay. Results Compared with normal skin tissues， the expressions of Smad1 （t=-4.403，P=0.010） and keloid related genes， Col1a1（t=-3.334， P=0.016）， Col3a1（t=-5.927， P=0.001） and ACTA2（t=-3.673， P=0.010）， were significantly increased in keloid tissues， while miR-199a-3p （t=7.059， Plt;0.001） expression was significantly decreased. Over-expression of miR-199a-3p could significantly decrease the expressions of keloid-related genes， Col1a1 （t=5.514， P=0.005）， Col3a1 （t=5.132， P=0.014） and ACTA2 （t=4.136， P=0.026）， in mouse skin fibroblasts. Moreover， the dual luciferase reporter assay revealed that miR-199a-3p could interact with the 3′-UTR of Smad1. miR-199a-3p was observed to inhibit Smad1 at mRNA expression level （t=3.556， P=0.024）， and at the post-transcriptional level （t=3.781， P=0.019）. Meanwhile， miR-199a-3p mimic， in parallel to Smad1 siRNA， decreased the expressions of keloid-related genes， Col1a1 （F=18.804; P=0.003， 0.022）， Col3a1 （F=33.212; P=0.001， 0.001） and α-SMA （F=10.181; P=0.020， 0.028）， and decreased the proliferation of skin fibroblasts （F=18.622; P=lt;0.001， lt;0.001）. ConclusionmiR-199a-3p inhibits the formation of keloid by targeting Smad1.

KEY WORDS： keloid; skin fibroblast; microRNA; Smad1

瘢痕疙瘩是在皮膚受到損傷后，由于成纖維細胞異常增殖及膠原沉積過多^［1］，形成的高出皮膚表面、病變范圍超出損傷邊界、不會隨時間自行消退的病理性瘢痕^［2］。瘢痕疙瘩皮膚原來的組織結(jié)構(gòu)和功能的大量丟失^［3］。瘢痕引起的瘙癢和疼痛癥狀嚴重影響患者生活質(zhì)量^［4］。研究皮膚瘢痕疙瘩的調(diào)控機制意義重大。

微小RNA（microRNA，miRNA）可以作用于靶基因3′UTRs，從而抑制mRNA的翻譯或者促進其降解，具有調(diào)控基因表達的能力^［5］。miRNAs參與皮膚瘢痕疙瘩形成的過程^［6］。miR-199a-5p在瘢痕疙瘩中表達降低，影響皮膚成纖維細胞的周期分布和增殖，可能參與瘢痕疙瘩形成^［7］。序列不同的miR-199a-3p和miR-199a-5p均由miR-199a stem-loop前體產(chǎn)生，細胞中miR-199a-3p水平高于miR-199a-5p（www.mirbase.org）。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p在小鼠皮膚瘢痕模型中表達顯著降低，但尚無文獻報道m(xù)iR-199a-3p是否參與皮膚瘢痕疙瘩的形成。本文將探究miR-199a-3p對小鼠皮膚瘢痕疙瘩形成的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

特級澳洲胎牛血清（Gibco）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen）；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（碧云天）；4×SDS loading buffer（Invitrogen）；miR-199a-3p mimic和Smad1 siRNA（廣州銳博）；Smad1抗體（Proteintech）、p-Smad1抗體（Proteintech）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（Abcam）、GAPDH抗體（Proteintech）、Col1a1抗體（Invitrogen）； Marker（Fermentas）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（Transgen Biotech）；ECL發(fā)光液（Millipore）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）。

1.2 主要方法

1.2.1 原代分離并培養(yǎng)細胞

取出生1 d的SPF級C57BL/6小鼠皮膚組織，EDTA-胰蛋白酶和膠原酶混合液消化細胞，4 ℃消化過夜，分離消化過夜的皮膚組織中的上皮層和真皮層，快速撕裂真皮層組織，含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基重懸浮，37 ℃、50 mL/L CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。傳代到P3代分別進行相應(yīng)處理。

1.2.2 過表達細胞的miR-199a-3p和沉默Smad1 12孔板接種P2代細胞，貼壁過夜，洗滌細胞，每孔加900 μL含10 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基；2 μL脂質(zhì)體與50 μL DMEM/F12培養(yǎng)基混勻，將0.1 nmol miR-199a-3p mimic、Scramble對照和Smad1 siRNA分別與50 μL DMEM/F12培養(yǎng)基混勻，兩者合并，充分混勻，室溫靜置20 min，形成100 μL脂質(zhì)體復(fù)合物。轉(zhuǎn)染至皮膚成纖維細胞，置于37 ℃、50 mL/L CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后，更換10 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基，18 h后結(jié)束實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測基因 mRNA表達

提取細胞總RNA。引物序列（5′—3′）如下，miR-199a-3p上游引物：GCACAGTAGTCTGCACATTGG，下游引物：GT

GCAGGGTCCGAGGTATTC；Col3a1上游引物：CAATGTAAAGAAGTCTCTGAAG，下游引物：CAAACAGGGCCAATGTCCAC；Col1a1上游引物：CTGGTCCTGTTGGAAGTCGT，下游引物：CA GATGCACCTGTTTCTCCA；U6上游引物：CAA GAAGGTGGTGAAGCAGG

，下游引物：CCAC CCTGTTGCTGTAGCC；ACTA2上游引物：CTGT GCTATGTCGCTCTGGA，下游引物：ATAGGTG GTTTCGTGGATGC；Smad1上游引物TGGT TTCACAGATCCGTCCA，下游引物：CGTGGTGG TAGTTGCAGTTC；U6上游引物：GTCCGCGT GCTCGCTTCGGCAGC，下游引物：GTGCGT GTCGTGGAGTC。1.0 μg總RNA于逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，

由vii A7 Quantitative PCR System 進行RT-qPCR檢測miR-199a-3p、瘢痕疙瘩基因以及Smad1 mRNA表達。2^-ΔΔCt法進行結(jié)果分析，相應(yīng)以U6和GAPDH為內(nèi)參計算基因表達相對水平。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達

4 ℃裂解細胞60 min，刮板，EP管收集裂解液。冷凍離心機離心10 min，12 000 r/min，取上清液，定量分裝蛋白，與loading buffer緩沖液混合，加熱變性8 min。電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉，相應(yīng)的抗體anti-Col3a1（1∶3 000）、anti-α-SMA（1∶3 000）、anti-GAPDH（1∶5 000）、anti-Smad1（1∶1 000）、anti-p-Smad1（1∶1 000）、anti-Col1a1（1∶3 000），4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜2 h。發(fā)光試劑盒顯影，掃描灰度值，以GAPDH為內(nèi)參進行分析。

1.2.5 驗證miR-199a-3p的靶基因

構(gòu)建重組熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Smad1-521-545、pGL3-Smad1-107-126及pGL3-Smad1-521-545-MUT、pGL3-Smad1-107-126-MUT。分別將2μg上述含有可能結(jié)合序列和突變結(jié)合序列的重組熒光素酶報告質(zhì)粒，10 ng pRL-TK和100 nmol/L miR-199a-3p mimic至HEK293細胞，24 h結(jié)束實驗。熒光強度比值=螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶（FL/RL），反映miR-199a-3p與Smad1 3′UTR特異性結(jié)合能力。

1.2.6 CCK-8法檢測過表達miR-199a-3p和沉默Smad1對細胞增殖的影響

96孔板接種P2代細胞，過夜。100 μL含10 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基饑餓過夜；取50 μL含miR-199a-3p mimic和Smad1 siRNA的10 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基于96孔板培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)12 h，換100 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后結(jié)束實驗；按照CCK-8產(chǎn)品說明書操作，加入CCK-8溶液10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm處測定吸光度值（A₄₅₀值），重復(fù)實驗3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。Kolmogorov-Smirnov（K-S）和ShapiroWilk（S-W）檢驗對計量資料進行正態(tài)性檢驗。均數(shù)±標準差（±s）表示服從正態(tài)分布的計量資料，中位數(shù)（四分位距）表示非正態(tài)分布的計量資料。Levene法檢測計量資料是否符合方差齊性。對于符合方差齊性的計量資料，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）；多組間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。對于不符合方差齊性的計量資料，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-199a-3p在皮膚瘢痕模型小鼠中表達下調(diào)

構(gòu)建C57BL/6小鼠皮膚瘢痕模型（圖1）。RT-qPCR結(jié)果顯示，皮膚瘢痕模型組中小鼠皮膚組織中瘢痕疙瘩相關(guān)基因Col1a1、Col3a1和ACTA2表達較正常皮膚組織升高（P均lt;0.05），而miR-199a-3p表達顯著降低（Plt;0.01），同時Smad1 mRNA表達顯著升高（Plt;0.05，表1）。

2.2 小鼠皮膚成纖維細胞形態(tài)

小鼠皮膚真皮層組織中分離的成纖維細胞呈橢圓形狀。P3代皮膚成纖維細胞偏平梭形，輪廓清晰（圖2）。P3代細胞進行細胞實驗。

2.3 miR-199a-3p調(diào)控瘢痕疙瘩相關(guān)基因的表達

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic的方式過表達細胞的miR-199a-3p，檢測miR-199a-3p對瘢痕疙瘩相關(guān)基因調(diào)控作用。RT-qPCR結(jié)果顯示，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic，可以成功過表達miR-199a-3p，同時，可以顯著降低Col1a1、Col3a1和ACTA2 mRNA表達（P均lt;0.05，表2）。Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-199a-3p mimic后的瘢痕疙瘩相關(guān)蛋白Col1a1、Col3a1和α-SMA表達顯著降低（P均lt;0.05，圖3、表3）。

2.4 miR-199a-3p靶基因鑒定

miR-199a-3p與兩個區(qū)域的Smad1的3′UTR具有可能結(jié)合位點（圖4）。根據(jù)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果，pGL3-Smad1-521+miR-199a-3p組和pGL3-Smad1-107+miR-199a-3p組相比于PGL3-promoter+Scramble組，F(xiàn)L/RL顯著下降（P均lt;0.05），同時pGL3-Smad1-MUT組則對FL/RL無明顯影響（Pgt;0.05，表4）。證實miR-199a-3p與Smad1 3′UTR 521-545和107-126位點特異性結(jié)合的同時可以抑制螢火蟲熒光素酶表達。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，相對于Scramble組，過表達miR-199a-3p皮膚成纖維細胞的Smad1 mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)（P均lt;0.05，圖5、表5）。上述結(jié)果證實miR-199a-3p可以作用于Smad1靶基因3′UTRs，從而調(diào)控靶基因的表達。

2.5 miR-199a-3p靶向Smad1抑制皮膚瘢痕疙瘩作用

沉默Smad1和過表達miR-199a-3p，可以下調(diào)瘢痕疙瘩相關(guān)蛋白Col1a1、Col3a1和α-SMA表達，同時Smad1蛋白表達一致性降低（P均lt;0.05，圖6、表6）。CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，相對于Scramble組，作用24 h后，過表達miR-199a-3p和沉默Smad1的小鼠皮膚成纖維細胞增殖能力均顯著降低（P均lt;0.05，表7）。以上結(jié)果證明過表達miR-199a-3p和沉默Smad1，皆可抑制皮膚瘢痕疙瘩形成作用。

3 討 論

miRNAs的調(diào)控與皮膚瘢痕疙瘩形成密切相關(guān)。miR-148b-3p和miR-133a被證實是調(diào)節(jié)皮膚成纖維細胞增殖、遷移和瘢痕疙瘩形成的重要因子^［8-9］。另外，miR-590-5p通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路抑制皮膚瘢痕疙瘩形成^［10］。miR-425-5p通過調(diào)控瘢痕疙瘩的膠原沉積而調(diào)節(jié)皮膚瘢痕疙瘩的進程^［11］。miR-199a-3p被證實具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能^［12-13］。瘢痕疙瘩的形成與創(chuàng)傷皮膚中的皮膚成纖維細胞異常增殖和膠原過度沉積關(guān)系密切^［14］?？梢?，miR-199a-3p通過抑制腫瘤細胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。同時研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在肺氣道囊性瘢痕疙瘩的表達水平顯著降低^［15］，miR-199a-3p可能參與皮膚瘢痕疙瘩形成。然而，miR-199a-3p在皮膚瘢痕疙瘩的作用機制尚未完全闡明。

Smad1屬于TGF-β超家族，Smad1對促進腫瘤細胞的增值和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用^［16-17］。沉默Smad1可抑制miR-32/PTEN通路，進而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力，促進細胞凋亡^［18］。Smad1是SMADs蛋白家族成員之一，TGF-β/Smad信號通路參與皮膚瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展^［19］。Smad1調(diào)控皮膚瘢痕疙瘩的形成尚無報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p可抑制小鼠皮膚成纖維細胞中瘢痕疙瘩相關(guān)基因表達。miR-199a-3p與Smad1 3′UTR 521-545和107-126位點特異性結(jié)合，過表達皮膚成纖維細胞的miR-199a-3p可以抑制Smad1 mRNA和蛋白水平表達，說明miR-199a-3p在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Smad1的表達。另外，過表達miR-199a-3p和沉默Smad1一致性地抑制小鼠皮膚成纖維細胞的增殖和瘢痕疙瘩相關(guān)蛋白表達。上述結(jié)果證實，Smad1是miR-199a-3p的作用靶基因，介導(dǎo)miR-199a-3p發(fā)揮抑制皮膚成纖維細胞增殖和瘢痕疙瘩相關(guān)基因表達作用。Smad1介導(dǎo)miR-199a-3p發(fā)揮生物學(xué)作用與以往在心肌成纖維細胞^［20］和軟骨細胞^［21］的研究報道相同。

綜上所述，細胞水平上Smad1是miR-199a-3p的作用靶基因，介導(dǎo)miR-199a-3p發(fā)揮抑制成纖維細胞增殖和瘢痕疙瘩相關(guān)基因表達。但本研究尚有一定局限性，缺乏進一步在整體動物水平上驗證miR-199a-3p靶向Smad1對皮膚瘢痕疙瘩形成的調(diào)控作用，未來將在本研究基礎(chǔ)上進一步探索。

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（編輯 陳 波）